Summary
Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af specifikke hypothalamus celleundertyper i kultur. Cellerne kan vælges ud fra opportune/unikke membranmarkører og anvendes i mange applikationer, herunder immunofluorescens, elektrofysiologiske og biokemiske assays.
Abstract
Hypothalamus regulerer grundlæggende metaboliske processer ved at kontrollere funktioner så forskellige som fødeindtagelse, kropstemperatur og hormonfrigivelse. Da hypothalamus funktioner styres af specifikke undergrupper af neuronale populationer, giver evnen til at isolere dem et vigtigt redskab til at studere metaboliske mekanismer. I denne henseende udgør hypothalamusens neuronale kompleksitet ekstraordinære udfordringer.
Af disse grunde er nye teknikker, såsom magnetisk aktiveret cellesortering (MACS), blevet undersøgt. Dette papir beskriver en ny anvendelse af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) ved hjælp af mikroperleteknologi til at isolere en målrettet neuronal population fra prænatale musehjerner. Teknikken er enkel og garanterer en meget ren og levedygtig primær hypothalamus neuronkultur med høj reproducerbarhed. Hypothalamus dissocieres forsigtigt, neuroner isoleres selektivt og adskilles fra gliaceller, og endelig vælges populationen af interesse ved anvendelse af et specifikt antistof til en celleoverflademarkør.
Når de er isoleret, kan målrettede neuroner bruges til at undersøge deres morfologiske, elektriske og endokrine egenskaber og deres reaktioner under normale eller patologiske forhold. I betragtning af hypothalamusens brogede roller i reguleringen af fodring, stofskifte, stress, søvn og motivation kan et nærmere kig på målrettede og regionsspecifikke neuroner desuden give indsigt i deres opgaver i dette komplekse miljø.
Introduction
Hypothalamus er et flerstrenget område af hjernen, der medierer endokrine, autonome, viscerale og adfærdsmæssige funktioner, herunder fodring, stofskifte, søvn, kropstemperatur, social adfærd og sexlyst 1,2,3,4,5. Funktionel heterogenitet opnås ved en synergistisk kombination af biokemiske og elektriske mekanismer: hypothalamus neuroner brandhandlingspotentialer og udskiller og frigiver hormoner og neuropeptider for at modulere hjerneområder og organer i kroppen. Endelig oversætter hypothalamus neuroner homeostatiske meddelelser fra kroppen og reagerer med langsigtet og kortsigtet feedback og feedforward-regler6.
Det komplekse neuronale miljø i hypothalamus indbefatter magnocellulære endokrine neuroner, der frigiver oxytocin og vasopressin; parvocellulære neuroner, primært involveret i den systemiske hormonregulering, frigiver for eksempel thyrotropinfrigivelseshormon (TRH) og corticotropinfrigivelseshormon (CRH) til hypofysen; store peptiderge projektionsneuroner, der frigiver orexin og melaninkoncentrerende hormon (MCH); og parvocellulære peptiderge neuroner i Arcuate Nucleus (ARC), der frigiver POMC (proopiomelanocortin) og AgRP (agouti-relateret protein), kaldet henholdsvis ARCPOMC og ARCAgRP. Sammen med sekretoriske celler er andre excitatoriske og hæmmende neuroner, herunder dopaminerge, glutaminerge og GABAerge neuroner 7, involveret i dannelsen af intrahypothalamus og ekstrahypothalamus kredsløb og derved skaber store koordinerede netværk med betydelig cellulær heterogenitet8.
Hypothalamus mangfoldighed har været en udfordring, som forskere har forsøgt at overvinde i løbet af de sidste 50 år. For at studere denne heterogenitet i udvikling, moden og aldrende hypothalami har efterforskere på den ene side anvendt enkeltcelle RNA-sekventering til at udforske neuronal organisation såvel som molekylære og transkriptomiske signaturer. Denne indsats har givet et indsigtsfuldt kig på hypothalamus neuroners varierede roller og har behandlet forbindelser mellem cellulær identitet og dens mulige rolle i det fysiologiske system 8,9,10. På den anden side er neuronale funktioner blevet undersøgt ved optogenetiske manipulationer og fiberfotometriadfærdsmæssige tilgange, hvilket giver et nærmere kig på kredsløbsstrukturen. I de sidste to årtier har Cre-rekombinaseteknologien gjort det muligt for forskere at ontogenetisk stimulere eller hæmme en målrettet gruppe neuroner, mens de observerer ændringer i adfærd og kropsresponser 6,11,12.
Disse tilgange undersøger imidlertid hypothalamus funktioner fra et generelt perspektiv uden at dykke dybere ned i de specifikke cellulære mekanismer eller det biologiske grundlag for deres rolle i det komplekse hypothalamus miljø. For at løse dette har meget få undersøgelser fokuseret på at undersøge molekylære, biokemiske og elektriske egenskaber ved hjælp af heterogene primære hypothalamus kulturer. Disse undersøgelser søgte at dissekere specifikke neuronale processer i et komplekst miljø og genererede integrerende modeller af fysiologiske mekanismer13,14,15. Ikke desto mindre udgør uspecifikke kulturer betydelige udfordringer. For eksempel forstyrres neuronernes fysiologiske forbindelse og anatomiske fordeling ved plettering af neuroner fra forskellige hypothalamus regioner, der normalt ikke ville interagere, hvilket skaber forvirrende virkninger. Derudover har hver region forskellige roller og varierede neuronale populationer, hvilket gør det vanskeligt at studere enkle biologiske processer.
For at løse disse udfordringer er der i det sidste årti blevet implementeret nye tilgange til at isolere neuroner af interesse, såsom immunpanorering, fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). Immunopanning er en strategi, der anvendes til at rense målrettede celler ved hjælp af antistofbelagte retter til en række ikke-neuronale (negative) og neuronale (positive) valg. Mens denne teknik i princippet kunne generere oprensede cellekulturer med højt udbytte, bruges den i praksis mest til astrocytter og oligodendrocytter, da disse celler kan modstå timers manipulation16,17. FACS-teknologi er et kraftfuldt værktøj til at sortere celler baseret på fluorescerende markører og cellulære egenskaber ved hjælp af flowcytometri18,19,20. Imidlertid brugte meget få undersøgelser denne metode til at isolere celler til cellekultur. Teknikken er dyr og kræver højt kvalificeret personale at bruge og vedligeholde; Derudover er det udfordrende at opretholde levedygtige og sterile celler ved afslutningen af sorteringsproceduren21. Samlet set synes MACS at være en simpel, ikke-dyr teknik til at opnå meget rene og levedygtige kulturer af hypothalamus primære neuroner. Metoden udnytter magnetiske perler knyttet til cellerne via et antistof. Dette gør det muligt at isolere cellerne ved hjælp af søjlens magnetfelt.
Her beskriver vi en metode baseret på MACS-teknologi, som typisk bruges med kortikale neuroner. Denne protokol gør det muligt at isolere i princippet levedygtige og meget rene hypothalamus neuroner. I denne undersøgelse forbereder vi primære kulturer af neuroner, der udtrykker Leptinreceptoren (LepR), såsom ARCPOMC og ARCAgRP neuroner, der kun er til stede i Arcuate Nucleus. Disse neuroner reagerer på leptin, et anorektigent hormon, der udskilles af fedtvævet, på biokemiske og elektriske måder. Derfor tillader isoleringen af denne gruppe neuroner i kultur undersøgelsen af deres hormonelle, metaboliske og elektriske egenskaber in vitro.
Protocol
BEMÆRK: En generel oversigt over forsøgsproceduren er grafisk illustreret i figur 1A. Alle forsøg med mus udført i denne undersøgelse blev godkendt af vores institutions Animal Care and Use Committee (IACUC). Vi brugte 3 måneder gamle C57BL6/J-mus, som var anbragt i et AAALAC-godkendt vivarium (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) under pleje af en dyrlæge. Musene levede i store bure med en 12 timers lys-mørk cyklus og blev fodret ad libitum.
1. Undfangelse og graviditetsbekræftelse
- Placer mus af enhver baggrund og genotype af interesse for avl. Optag datoen og vægten af kvinden før undfangelsen.
- Efter 6 timer inspiceres kvinden for en plak med en sonde. Hvis pladen er til stede, skal du adskille kvinden fra hanen. Hvis pladen ikke er til stede, skal du holde kvinden i buret indtil næste dag og derefter adskille musene.
- På dag 7, 10 og 14 efter undfangelsen vejer kvinden for at bekræfte graviditeten.
2. Medier, 24-brønds plade og materialeforberedelse
- På dagen for celleisolering anbringes brugsklare poly-D-lysinbelagte glasdæksler (se materialetabellen) i en plade med 24 huller som følger:
- Under en biologisk hætte steriliseres en enkelt pakke indeholdende 15 dæksedler med 70% ethanol og lades tørre. Åbn pakningen, og læg dækselsedlerne i en 60 mm plade. Ryst pladen vandret for at adskille dækslerne. Vend derefter pladen for at samle enkelte dæksedler, der skal placeres i brøndene på en plade med 24 brønde.
- Vask dækslerne én gang med 1,0 ml steril Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) i 5 min.
- I mellemtiden fremstilles 20,0 ml pletteringsmedier som følger: til 18,31 ml BME (Basal Medium Eagle, + Earle's Salts), suppleret med 1,0 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), tilsættes 200 μL natriumpyruvat (fra en 100x bestand), 200 μL glutamin (fra en 200 nM bestand) og 100 μL penicillin / streptomycin (fra en 200x bestand).
- HBSS i hullerne udskiftes med 1,0 ml pletteringsmedier, og pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C.
- Brug en bunsenbrænder til at brandpolere tre Pasteur-pipetter i faldende diametre. Hold pipetten med den ene hånd, indsæt spidsen i flammen og fjern den hurtigt. Gentag processen, indtil spidsen glatter, og diameteren reduceres til den ønskede diameter (vurderet med øjet).
3. Reagensforberedelse til dissociation af neuralt væv efter anvisningerne i Neural Dissociation kit
- Efter opvarmning af fordøjelsesbuffer 1 ved stuetemperatur fremstilles enzymblanding 1 ved at blande 50 μL enzym 1 med 1,91 ml buffer 1 og enzymblanding 2 ved at blande 15 μL enzym 2 med 30 μL fordøjelsesbuffer 2. Blandingerne er nok til at blive brugt til alle embryoners hjernevæv.
- Forbered 0,5% bovin serumalbumin (BSA) i HBSS, for eksempel 0,25 g i 50,0 ml HBSS.
4. Ekstraktion af embryoner
- Autoklave to lige fine tang, en buet spidstang og et par fine kirurgiske saks og steriliser dem med 70% ethanol før brug. Fyld derefter petriskålene med HBSS.
- Aflive en E14-E16 gravid dæmning i CO2 -kammeret og udfør cervikal dislokation.
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres under emhætten under sterile forhold: - Steriliser maven med 70% ethanol. Skær bukhulen op fra pubic symphysis til xiphoidprocessen i ribbenburet med kirurgisk saks og tang.
- Tag livmoderhornet ud og læg det i en 100 mm plade fyldt med iskold HBSS og vask grundigt.
- Uddrag og adskil alle embryoner fra livmoderen med fine tang. Halshug hurtigt embryonerne med en fin kirurgisk saks og/eller pincet. Placer hovederne i 60 mm petriskålen fyldt med HBSS.
5. Hypothalamus ekstraktion, indsamling, og væv dissociation
- Placer en fin tang i øjenhulen for at holde hjernen. Brug de andre fine pincet til at fjerne huden og kraniet ved at skrælle, indtil hjernen er synlig. Skelne hjernen fra andre væv baseret på dets hvide udseende. Hud og kranium er lyserøde og rige på vaskulatur.
- Fjern hjernen fra kraniet ved hjælp af de buede punktpincet og øse hjernen ud af de olfaktoriske pærer og vende den på hovedet.
- Nu er cortex ventral, og hypothalamus er synlig dorsalt på den overlegne overflade (figur 1B). Med de buede tang skal du fjerne laget af meninges og blodkar, indtil hjernen ser hvid og klar ud.
- Med de buede tang adskilles hypothalamusområdet fra resten af hjernen.
- Skær hypothalamus i 3-4 små stykker og overfør stykkerne til et 15 ml rør med en pipør.
- Gentag trinene for de andre embryoner, mens røret er på is.
- Fyld glasset med 6,0 ml HBSS og lad vævet bundfælde sig, fjern supernatanten, og tilsæt enzymblanding 1. Bland forsigtigt og omrør røret for at forhindre vævet.
- Tuben inkuberes i et 37 °C vandbad i 15 minutter, og vævet omrystes hvert 5. minut for at resuspendere vævet.
- Efter 15 minutter tilsættes 30 μL enzymblanding 2. Afbryd hjernevævet ved hjælp af pipetten Pasteur med den største diameter (<1 mm). Pipet op og ned 10x uden at danne bobler.
- Der inkuberes i 10 minutter ved 37 °C i vandbadet. Omrør forsigtigt røret for at resuspendere vævet hvert 5. minut.
- Efter 10 minutter tilsættes de resterende 15 μL enzymblanding 2. Dissocier vævet 10x med de to andre brandpolerede pipetter med faldende diameter, op og ned uden at danne bobler.
- Til røret med det dissocierede væv tilsættes straks 10,0 ml HBSS-0,5% BSA og centrifugeres ved 300 × g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten suges til syn, og cellepelletsen resuspenderes i 1,0 ml HBS-0,5 % BSA.
6. Celletælling
- Fortynd cellesuspensionen 1:5 med HBSS-0,5% BSA.
- 10 μL af suspensionen af fortyndede celler anbringes i et Neubauer-tællekammer.
- Under et brightfield-mikroskop skal du kun tælle de celler, der er i de fire kammers hjørnefirkanter. Beregn gennemsnittet og multiplicer med 5 × 104.
BEMÆRK: Sørg for, at der er >106 celler til at fortsætte til celleisolering; Det optimale cellenummer er 107.
7. Negativt valg
BEMÆRK: Negativ selektion gør det muligt for brugerne at opnå en ren primær neuronkultur ved at adskille neuronale og ikke-neuronale celler. Brug forkølede opløsninger.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 × g i 3 minutter (centrifugeringen kan forlænges op til 10 min). Supernatanten suges forsigtigt og pellets resuspenderes til en koncentration på 10,7 celler i 80 μL HBSS-0,5% BSA.
- Tilsæt 20 μL ikke-neuronal cellebiotin-antistofcocktail og inkuber i 5 minutter ved 4 °C.
- Vask cellerne for at fjerne frit antistof med 2,0 ml HBSS-0,5% BSA og centrifuger ved 300 × g i 3 minutter.
- Supernatanten suges forsigtigt og pelletsen resuspenderes i 80 μl HBSS-0,5% BSA. Tilsæt 20 μL antibiotin mikroperler, bland grundigt og inkuber i 10 minutter ved 4 °C.
- Tilsæt 0,5 ml HBSS-0,5% BSA til op til 107 celler, og vent, indtil magnetsøjlen er klar.
8. Magnetisk adskillelse, negativt valg
BEMÆRK: Magnetisk adskillelse er et afgørende trin, der tillader adskillelse af de ikke-neuronale celler fra neuroncellerne. Prøven, der indeholder neuronale og ikke-neuronale celler, ledes gennem magnetfeltet, og de ikke-neuronale celler, der er bundet til et biotin-antistof-magnetisk perlekompleks, fanges i søjlen (figur 1C). De frie neuronale celler elueres gennem søjlen og opsamles i et 15 ml rør.
- Forbered stativet (medfølger i sættet) med separatoren og MS-kolonnen som vist i figur 1C.
- Åbn kolonnen, og konfigurer kun stativet, når cellerne er klar til at blive adskilt.
- Skyl kolonnen med 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Vent, indtil opløsningen holder op med at dryppe.
- For at indsamle neuronale celler skal du placere et 15 ml rør under søjlen og føre 0,5 ml af cellesuspensionen gennem søjlen. Saml eluatet i røret, indtil det holder op med at dryppe. For at fange resterende neuronale celler skal du vaske kolonnen 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
- For at indsamle ikke-neuronale celler skal du fjerne søjlen fra magneten og placere den inde i et nyt 15 ml rør. Tilsæt 1,0 ml HBSS - 0,5% BSA til søjlen og brug stemplet til at indsamle de magnetisk mærkede ikke-neuronale celler.
- Centrifuger de neuronale og ikke-neuronale celler ved 300 × g i 3 minutter. Supernatanten suges forsigtigt og cellerne resuspenderes i 1,0 ml HBSS-0,5 % BSA. Tæl cellerne som beskrevet tidligere i punkt 6.
- Hvis det er nødvendigt, plade de ikke-neuronale celler i en 24-brønd plade; ellers kassér dem.
9. Positivt valg
BEMÆRK: Når en ren neuronal cellesuspension er opnået, udføres positiv selektion for at isolere de målrettede celler. Celler kan isoleres ved anvendelse af et specifikt biotinkonjugeret antistof til et overfladeantigen. Antistoffet genkendes af anti-biotin magnetiske perler. Ved at strømme cellesuspensionen gennem søjlen fanges kun cellerne af interesse i magnetfeltet.
- Centrifuger suspensionen af rene neuronceller ved 300 × g i 3 minutter. Supernatanten suges forsigtigt og pelletsen resuspenderes i 80 μl HBSS-0,5% BSA. Tilsæt det specifikke antistof efter producentens anvisninger og inkubér ved 4 °C i 10 minutter.
BEMÆRK: Hvis der søges celler, der udtrykker LepR, foreslår vi et museleptin R-biotinyleret antistof (se materialetabel) i en koncentration på 0,50 μg/106 celler. - Det overskydende antistof vaskes af med 2,0 ml HBSS-0,5% BSA og centrifugeres ved 300 × g i 3 minutter.
- Supernatanten fjernes, pelletpen resuspenderes i 80 μl HBSS-0,5% BSA, og der tilsættes 20 μL antibiotinmikroperler. Der inkuberes ved 4 °C i 10 min.
- For hver 107 celler tilsættes 0,5 ml HBSS-0,5% BSA og venter, indtil magnetsøjlen er klar.
10. Magnetisk adskillelse, positiv udvælgelse
- Forbered stativet med separatoren og MS-kolonnen. Skyl MS-kolonnen med 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Vent, indtil dryppet stopper.
- Anbring et 15 ml rør under søjlen, før 0,5 ml af cellesuspensionen gennem søjlen, og opsaml eluatet, der omfatter de ikke-specifikke neuronale celler. For at rengøre kolonnen af resterende ikke-specifikke neuronale celler, vask med 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
- Fjern søjlen fra magneten, placer den i et nyt 15 ml rør, og tilsæt 1,0 ml HBSS-0,5% BSA. Brug stemplet til at skylle målcellerne ud.
- Begge glas centrifugeres ved 300 × g i 3 min. Supernatanten fjernes forsigtigt og opslæmmes igen i 0,5 ml pletteringsmedium.
- Tæl cellerne som tidligere beskrevet i punkt 6.
- Pladen både målceller som den positive kontrol og ikke-specifikke celler som den negative kontrol ved 120.000-200.000 celler/mm3 densitet i den 24-brønds plade, der tidligere er fremstillet som beskrevet i afsnit 2, og inkuberes ved 37 °C i 5% CO2, 9% O2 og 95 % fugtighed i12 timer.
11. Vedligeholdelse af cellekultur
- Forbered 20 ml dyrkningsmedium med 19,2 ml neuronalt kulturmedium, 400 μL B27-supplement (fra et 50x lager), 200 μL glutamin (fra en 200 μM bestand) og 100 μL penicillin / streptomycin (fra en 200x lager).
- Udskift pletteringsmedier fra de 24 brøndplader, der indeholder neuronale eller ikke-neuronale celler.
- Vask med 2 x 1,0 ml HBSS.
- Tilføj 1,0 ml kulturmedier.
- Opdater mediet hver 2/3 dag ved at udskifte 0,5 ml gamle medier med 0,5 ml friske medier.
BEMÆRK: Celler kan opretholdes i kultur og anvendes i op til 21 dage in vitro (DIV21).
12. Farvning af neuronimmunofluorescens
- Tolv timer før farvningen fremstilles en opløsning bestående af 50/50 methanol og acetone og afkøles ved -20 °C natten over.
- Vask neuronerne i 24-brøndpladen med 2 x 1,0 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i 5 minutter.
- PBS-opløsningen erstattes med 1,0 ml af 50/50-opløsningen og inkuberes i is i 20 minutter.
- Vask med 1x PBS i 3 x 5 min.
- Bloker neuronerne med 3% BSA i 1x PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered den primære antistofopløsning i 3% BSA i 1x PBS ved hjælp af den antistofkoncentration, der er nævnt i producentens anvisninger. De anvendte antistoffer og koncentrationer er anført i materialetabellen.
- Den blokerende opløsning erstattes med den primære antistofopløsning og inkuberes ved 4 °C natten over.
- Vask cellerne i 3 x 10 min med 1x PBS.
- Forbered den sekundære antistofopløsning med 3% BSA i 1x PBS ved hjælp af antistoffernes koncentrationer efter producentens anvisninger. De anvendte sekundære antistoffer er anført i materialetabellen.
- Inkuber cellerne med den sekundære antistofopløsning ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask cellerne i 3 x 10 min med 1x PBS.
- Lad neuronerne være i 1x PBS under monteringsproceduren. En lille dråbe monteringssubstrat (med eller uden 4',6-diamidino-2-phenylindol til nuklear identifikation) anbringes på mikroskopglasset. Uddrag et glasdæksel, der indeholder neuroner med tang, og tryk på siden af dæksedlen på et papirvæv for at tørre overskydende PBS. Vend dækslet på monteringsmediet, og sørg for, at neuronerne vender mod mikroskopets dias; Tryk forsigtigt på og fjern det overskydende monteringsmedie med silkepapir.
- Mikroskopets dias er klar til at blive analyseret med et brightfield eller et konfokalmikroskop.
Representative Results
Dette papir beskriver en protokol til isolering af målrettede neuroner i hypothalamus (figur 1). Metodens omfang er at studere specifikke neuronale egenskaber i en kontrolleret og isoleret sammenhæng. Således blev museembryoner ekstraheret fra de drægtige mødre ved E14-E16. Hjernehinderne blev fjernet, og hypothalamus blev isoleret fra resten af hjernen. Vævet blev forsigtigt dissocieret med to blandinger af enzymer, der var frisklavet ved hjælp af det refererede dissociationssæt. For det første blev ikke-neuronale celler adskilt fra neuronale celler - glia, mikroglia og neuroner blev samlet i den samme enkeltcellesuspension. Til dette formål blev ikke-neuronale celler mærket ved hjælp af en cocktail af antistoffer, der genkender ikke-neuronale overfladeepitoper. Efter inkubation blev antistofcellekomplekset konjugeret med magnetiske mikroperler og efterfølgende passeret gennem en magnetisk søjle for at fange de ikke-neuronale celler.
Dette trin gav to cellesuspensioner, den ene indeholdende ikke-neuronale og den anden indeholdende neuronale celler. Begge suspensioner kunne belægges med det samme. Alternativt kan neuroncellesuspensionen manipuleres yderligere for at adskille en neuronal subpopulation (målrettet suspension) fra resten ved hjælp af den samme strategi. Baseret på eksperimentet af interesse kan neuroncellerne belægges fra 125.000 til 200.000 celler / mm3. De mindre tætte kulturer kan bruges til at analysere neuroner ved enkeltcelleopløsning: fra aksonal udvikling, synaptisk dannelse og transmission til elektrofysiologi. De tættere kulturer kan bruges til biokemiske analyser, herunder DNA- og RNA-ekstraktion, western blot, Southern blot, Northern blot, real-time PCR og RNA-sekventering.
I denne undersøgelse blev LepR målrettet mod at isolere neuroner involveret i melanocortinsystemet, såsom ARCPOMC og ARCAgRP neuroner. Celler blev belagt med tætheder fra 120.000 celler / mm 3 for LepR + neuroner til 200.000 celler / mm3 for generiske neuronale populationer. Efter 48 timer begyndte LepR + neuroner at danne neuritter (figur 2). Ved DIV4 viste aksonale forlængelser fremskridt, mens dendritiske processer begyndte at dukke op. Ved DIV6 var neuronerne tilstrækkeligt udviklede og var derfor klar til at blive analyseret. Immunofluorescensforsøg på LepR+ neuroner viste 99% ekspression af LepR (grøn, figur 3A). Ingen gliaceller eller andre ikke-neuronale celler blev observeret, hvilket bekræfter renheden af den primære neuronale kultur. Cellernes neuronale natur blev bekræftet ved mikrotubulusassocieret protein 2 (MAP2) farvning med identifikation af axoner og dendritiske fremspring (figur 3B). Ved DIV10 udtrykte 30% af LepR+ cellerne POMC (rød). Dette forventes, da størstedelen af LepR+ celler udtrykker enten POMC eller AgRP. Figur 3C,D illustrerer samlokalisering mellem POMC- og LepR-signaler. Bemærk, at co-lokaliseringen var fremtrædende ved og omkring kernen som forventet.
Generelle kulturer indeholdende heterogene hypothalamus neuronale populationer blev anvendt til kontrol. Immunofluorescens viste synaptisk konnektivitet og funktionalitet, vurderet ved Synapsin-1 (grøn) og PSD 95 (rød) co-farvning (figur 4A,B). Antallet af LepR + neuroner til stede i den generelle kultur var ~ 5%, en procentdel i overensstemmelse med forestillingen om, at størstedelen af LepR-ekspressive neuroner var blevet valgt under den magnetiske separationsproces (repræsentative LepR + celler er illustreret i figur 4C, D). Alle data, der genereres eller analyseres under denne undersøgelse, er tilgængelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c.
Figur 1: Eksperimentelt rutediagram og opsætning. (A) Grafisk gengivelse af forsøgsproceduren. Go-no-go: ≥106 celler er nødvendige for at fortsætte til celleisolering; Det optimale cellenummer er 107. (B) Repræsentativt billede af en E16-embryohjerne. Hypothalamus og meninges er angivet. C) MACS-opsætning, der anvendes til adskillelse og isolering af målceller. Magnetisk stativ, magnetisk separator og søjle er angivet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Neuronal kultur mellem DIV2 og DIV6. (A) LepR + celler opnået ved den positive selektion viser reduceret celletæthed og forbindelse, men normal udvikling af neuritter (røde pile), axoner (blå pile) og dendritter (grønne pile). Celler blev belagt med en densitet på 120.000 celler / mm3. Skalabjælke = 100 μm. (B) Generiske hypothalamus neuroner, belagt med en tæthed på 200.000 celler / mm3, viser normale udviklings- og vækstfunktioner og tilslutningsmuligheder (sorte pile). Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: DIV = dage in vitro; LepR = leptinreceptor. Alle data, der genereres eller analyseres for at konstruere dette tal, er tilgængelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: In vivo neuroner rekapituleres af dyrkede LepR + neuroner. (A) Repræsentative billeder af en kultur af neuroner, der udtrykker LepR (grøn; DAPI er blå). Nioghalvfems procent af cellerne udtrykte LepR. Neuroner blev belagt med 120.000 celler / mm3 densitet. Ved DIV7 præsenterede neuronerne langstrakte axoner, dendritisk modning og neuronal forbindelse (pile). Skalabjælke = 40 μm. (B) Immunofluorescens med anti-MAP2 blev anvendt til at bekræfte cellernes neuronale natur. Neuronalspecifikke morfologier såsom axoner, dendritter og fremspring demonstreres (pile). Skalabjælke = 40 μm. (C) Forstørrelse af LepR+ celler. LepR i grøn og DAPI i blå. Skalabjælke = 10 μm. (D) Co-farvning med LepR (grøn) og POMC (rød). Omkring 30% af LepR + neuroner var co-immunoreaktive over for POMC, som blev påvist på kerneniveau (røde pile). Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; MAP2 = mikrotubulusassocieret protein 2; POMC = proopiomelanocortin; LepR = leptinreceptor. Alle data, der genereres eller analyseres for at konstruere dette tal, er tilgængelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: In vivo-celler rekapituleres af dyrkede generiske hypothalamus neuroner. (A) Repræsentative billeder af generisk hypothalamus neuronal kultur farvet med Synapsin 1 (grøn), PSD95 (rød) og DAPI (blå). Neuronerne udviste veludviklet forbindelse og synaptisk funktionalitet (pile). Skalabjælke = 40 μm. (B) Forstørrelse af boksen i (A), der viser samlokalisering af Synapsin 1 (grøn) og PSD95 (rød, pile). Skalabjælke = 20 μm. (C,D) Repræsentative billeder, der viser LepR+ celler i en generel kultur. LepR + celler (grøn) tegnede sig for ~ 5% af det samlede antal. Repræsentative LepR+ celler er angivet med pile. Skalabjælke = 40 μm. (E,F) Forstørrelser af boksene i (C, D), der viser grønne puncta leptinreceptorer lokaliseret ved soma. Skalabjælke = 20 μm. Alle data, der genereres eller analyseres for at konstruere dette tal, er tilgængelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Undersøgelse af de biokemiske og elektriske egenskaber af hypothalamus neuroner er nøglen til at forstå det molekylære grundlag for metabolisme, termoregulering, humørstyring, fodringsadfærd og mere. Imidlertid gør hypothalamus neuronale heterogenitet denne indsats udfordrende, og der er behov for metoder til at isolere og studere specifikke hypothalamus subpopulationer.
In vivo teknikker anvender CRE-rekombinase, optogenetisk, fiberfotometri og calciumbilleddannelse. Disse tilgange tillader primært undersøgelsen af de elektriske egenskaber af hypothalamus neuroner, og meget få metoder er i øjeblikket tilgængelige til at undersøge deres ikke-elektriske egenskaber. MACS-teknologien, der er udviklet i denne undersøgelse, kan give en teknik, der er egnet til at isolere specifikke hypothalamus neuronale subpopulationer in vitro og derved give målrettede behandlinger og analyser. Neuronale kulturer er enklere at håndtere sammenlignet med co-kulturer af forskellige neuronale populationer. Derudover undgår rene kulturer forvirrende virkninger, der stammer fra tilstedeværelsen af glia og mikroglia. Således kunne neuroner fra samme hypothalamus region og type undersøges som reaktion på specifikke metaboliske og hormonelle input.
I denne protokol valgte vi hypothalamus neuroner, der udtrykker LepR. Isolerede LepR + celler blev dyrket for at undersøge deres cellulære, morfologiske og molekylære egenskaber, som er vanskelige at studere in vivo. Renheden af kulturerne var 99%, hvilket understøtter metodens nøjagtighed. Derudover var LepR+ cellerne sunde og levedygtige ved DIV7 indtil DIV21.
Denne teknik har dog nogle begrænsninger. E18 eller ældre rene neuronkulturer er udfordrende at vedligeholde. Derfor er ekstraktionsvinduet begrænset til E14-E16. Dette indebærer, at cellulære ændringer, der opstår efter E16, savnes. For eksempel øges ekspressionen af leptinreceptoren i ARC-neuroner i den tidlige postnatale periode22. Proceduren for isolering skal udføres så hurtigt som muligt for at reducere cellulær stress og død og forbedre udbyttet. Proceduren kan tage op til 5 timer; Derfor er det vigtigt at opretholde sterile forhold og reducere manipulation til det nødvendige minimum. Det positive valg kan føre til lavt udbytte på grund af de lave mængder tilgængeligt væv, hvilket begrænser antallet af eksperimenter, der kan udføres med et enkelt præparat. Forhøjet neuronal død blev observeret, sandsynligvis på grund af lav celletæthed og reduceret neuronal forbindelse og intraneuronal støtte.
Desuden skal antistoffet rettet mod antigenet af interesse binde til celleoverfladen for at garantere en korrekt adskillelse; normalt er antistoffer, der anvendes til flowcytometri, egnede til MACS-teknikken. Hvis antistoffet ikke er blevet brugt før i celleseparationsmetoder, er validerings- og titreringseksperimenter nødvendige for at bestemme den ideelle anvendelse og koncentration. Udtrækning af målrettede celler kræver en celleoverflademarkør. Her brugte vi et biotinyleret antistof, men i princippet kunne antistoffer konjugeret med andre molekyler, såsom FITC (fluoresceinisothiocyanat) og PE (oprenset anti-phycoerythrin), også anvendes. MACS-teknologi kan også anvendes på neuroner, der udtrykker en fluorofor, såsom GFP eller et andet Tag-protein, hvilket potentielt øger specificiteten og udbyttet. Hvis der ikke anvendes en fluorofor, ville alternativet være at bekræfte ekspressionen af molekylet af interesse ved immunofluorescens, før der udføres levende celleforsøg. Fremtidige undersøgelser vil teste validiteten af disse alternativer.
Et vigtigt aspekt, som denne undersøgelse ikke adresserede, vedrører "troskaben" af de subneuronale populationer. Vi konstaterede, at de dyrkede LepR+ neuroner udtrykte POMC, som er en signatur af indfødte ARCPOMC neuroner. Imidlertid vil flere tests være nødvendige for at konkludere, at LepR + neuronale kulturer rekapitulerer deres oprindelige in vivo-modstykker . Samlet set kan MACS neuronal isolationsprotokol, der præsenteres her, give en gyldig og effektiv metode til at studere in vitro hypothalamus mekanismer, der ellers ville være vanskelige at undersøge in vivo.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Grafiske figurer blev skabt med BioRender.com. Dette arbejde blev støttet af et NIA-tilskud (R01AG060919) og et NSF-tilskud (2030348) til FS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo extraction | |||
| 1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
| 1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
| 60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Bench pads | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Cell Culture | |||
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
| Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
| Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
| Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
| Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
| Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
| Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
| MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit - Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
| Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
| Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
| Staining | |||
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
| Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
| POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
| PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
| Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
| Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
References
- Cone, R. D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nature Neuroscience. 8 (5), 571-578 (2005).
- Clarke, I. J. Hypothalamus as an endocrine organ. Comprehensive Physiology. 5 (1), 217-253 (2015).
- Mignot, E., Taheri, S., Nishino, S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. Nature Neuroscience. 5 Suppl, 1071-1075 (2002).
- Baird, A. D., Wilson, S. J., Bladin, P. F., Saling, M. M., Reutens, D. C. Neurological control of human sexual behaviour: insights from lesion studies. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (10), 1042-1049 (2007).
- Caria, A., Dall, O. G. Functional neuroimaging of human hypothalamus in socioemotional behavior: a systematic review. Brain Sciences. 12 (6), 707 (2022).
- Andermann, M. L., Lowell, B. B. Toward a wiring diagram understanding of appetite control. Neuron. 95 (4), 757-778 (2017).
- Romanov, R. A., Alpar, A., Hokfelt, T., Harkany, T. Unified classification of molecular, network, and endocrine features of hypothalamic neurons. Annual Review of Neuroscience. 42, 1-26 (2019).
- Hajdarovic, K. H., Yu, D., Webb, A. E. Understanding the aging hypothalamus, one cell at a time. Trends in Neurosciences. 45 (12), 942-954 (2022).
- Zhang, Y. H., et al. Cascade diversification directs generation of neuronal diversity in the hypothalamus. Cell Stem Cell. 28 (8), 1483-1499 (2021).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-cell RNA-seq reveals hypothalamic cell diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Ma, C., et al. Neural pathways from hypothalamic orexin neurons to the ventrolateral preoptic area mediate sleep impairments induced by conditioned fear. Frontiers in Neuroscience. 17, 1122803 (2023).
- Wang, F., et al. A parabrachial to hypothalamic pathway mediates defensive behavior. Elife. 12, e85450 (2023).
- Cowley, M. A., et al. Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature. 411 (6836), 480-484 (2001).
- Parekh, R. U., et al. Hypothalamic kinin B1 receptor mediates orexin system hyperactivity in neurogenic hypertension. Scientific Reports. 11 (1), 21050 (2021).
- Schmidt, C. X., Tsang, A. H., Oster, H. Generation of mouse primary hypothalamic neuronal cultures for circadian bioluminescence assays. Bio-protocol. 11 (5), e3944 (2021).
- Foo, L. C. Purification of rat and mouse astrocytes by immunopanning. 2013 (5), Cold Spring Harbor Protocols. 421-432 (2013).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. 2013 (9), Cold Spring Harbor Protocols. 854-868 (2013).
- Zhao, H., et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea. International Journal of Molecular Sciences. 12 (3), 1862-1875 (2011).
- Zhang, Z. M., et al. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chinese Medical Journal. 124 (12), 1813-1817 (2011).
- Drake, S. S., Zaman, A., Simas, T., Fournier, A. E. Comparing RNA-sequencing datasets from astrocytes, oligodendrocytes, and microglia in multiple sclerosis identifies novel dysregulated genes relevant to inflammation and myelination. WIREs Mechanisms of Disease. 15 (2), e1594 (2023).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Cottrell, E. C., et al. Developmental changes in hypothalamic leptin receptor: relationship with the postnatal leptin surge and energy balance neuropeptides in the postnatal rat. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296 (3), R631-R639 (2009).
