Summary
Hier presenteren we een protocol om specifieke hypothalamische celsubtypen in cultuur te laten groeien. De cellen kunnen worden geselecteerd op basis van opportune / unieke membraanmarkers en worden gebruikt in vele toepassingen, waaronder immunofluorescentie, elektrofysiologische en biochemische assays.
Abstract
De hypothalamus reguleert fundamentele metabolische processen door functies te regelen die zo gevarieerd zijn als voedselinname, lichaamstemperatuur en hormoonafgifte. Omdat de functies van de hypothalamus worden gecontroleerd door specifieke subsets van neuronale populaties, biedt het vermogen om ze te isoleren een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van metabole mechanismen. In dit opzicht vormt de neuronale complexiteit van de hypothalamus uitzonderlijke uitdagingen.
Om deze redenen zijn nieuwe technieken, zoals Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), onderzocht. Dit artikel beschrijft een nieuwe toepassing van magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS) met behulp van microbead-technologie om een gerichte neuronale populatie te isoleren van prenatale muizenhersenen. De techniek is eenvoudig en garandeert een zeer zuivere en levensvatbare primaire hypothalamus neuroncultuur met hoge reproduceerbaarheid. De hypothalamus wordt voorzichtig gedissocieerd, neuronen worden selectief geïsoleerd en gescheiden van gliacellen, en ten slotte, met behulp van een specifiek antilichaam voor een celoppervlakmarker, wordt de populatie van belang geselecteerd.
Eenmaal geïsoleerd, kunnen gerichte neuronen worden gebruikt om hun morfologische, elektrische en endocriene kenmerken en hun reacties in normale of pathologische omstandigheden te onderzoeken. Bovendien, gezien de bonte rollen van de hypothalamus bij het reguleren van voeding, metabolisme, stress, slaap en motivatie, kan een nadere blik op gerichte en regiospecifieke neuronen inzicht geven in hun taken in deze complexe omgeving.
Introduction
De hypothalamus is een multipronged gebied van de hersenen dat endocriene, autonome, viscerale en gedragsfuncties bemiddelt, waaronder voeding, metabolisme, slaap, lichaamstemperatuur, sociaal gedrag en geslachtsdrift 1,2,3,4,5. Functionele heterogeniteit wordt bereikt door een synergetische combinatie van biochemische en elektrische mechanismen: hypothalamische neuronen vuren actiepotentialen af en scheiden hormonen en neuropeptiden af om hersengebieden en organen van het lichaam te moduleren. Ten slotte vertalen hypothalamische neuronen homeostatische boodschappen van het lichaam en reageren ze met feedback op lange en korte termijn en feedforward-voorschriften6.
De complexe neuronale omgeving van de hypothalamus omvat magnocellulaire endocriene neuronen, waarbij oxytocine en vasopressine vrijkomen; parvocellulaire neuronen, voornamelijk betrokken bij de systemische hormonale regulatie, waarbij bijvoorbeeld thyrotropine-release hormoon (TRH) en corticotropine-release hormoon (CRH) vrijkomen in de hypofyse; grote peptiderge projectieneuronen, waarbij orexine en melanine-concentrerend hormoon (MCH) vrijkomen; en parvocellulaire peptiderge neuronen van de Arcuate Nucleus (ARC) die POMC (proopiomelanocortine) en AgRP (agouti-gerelateerd eiwit) vrijgeven, respectievelijk ARCPOMC en ARCAgRP genoemd. Samen met secretoire cellen zijn andere exciterende en remmende neuronen, waaronder dopaminerge, glutaminerge en GABAerge neuronen 7, betrokken bij het vormen van intrahypothalamische en extrahypothalamische circuits, waardoor grootschalige gecoördineerde netwerken van aanzienlijke cellulaire heterogeniteit8 worden gecreëerd.
Hypothalamische diversiteit is een uitdaging die onderzoekers de afgelopen 50 jaar hebben geprobeerd te overwinnen. Om deze heterogeniteit in ontwikkelende, volwassen en verouderende hypothalami te bestuderen, hebben onderzoekers aan de ene kant eencellige RNA-sequencing gebruikt om neuronale organisatie te onderzoeken, evenals moleculaire en transcriptomische handtekeningen. Deze inspanning heeft een inzichtelijke blik gegeven op de bonte rollen van hypothalamische neuronen en heeft verbanden tussen cellulaire identiteit en zijn mogelijke rol in het fysiologische systeem 8,9,10 aangepakt. Aan de andere kant zijn neuronale functies onderzocht door optogenetische manipulaties en gedragsbenaderingen van vezelfotometrie, waardoor de circuitstructuur van dichtbij kan worden bekeken. In de afgelopen twee decennia heeft de Cre-recombinase-technologie onderzoekers in staat gesteld om een gerichte groep neuronen ontogenetisch te stimuleren of te remmen terwijl ze veranderingen in gedrag en lichaamsreacties observeerden 6,11,12.
Deze benaderingen onderzoeken echter hypothalamusfuncties vanuit een algemeen perspectief zonder dieper in te gaan op de specifieke cellulaire mechanismen of de biologische basis voor hun rol binnen de complexe hypothalamische omgeving. Om dit aan te pakken, hebben zeer weinig studies zich gericht op het onderzoeken van moleculaire, biochemische en elektrische eigenschappen met behulp van heterogene primaire hypothalamische culturen. Deze studies probeerden specifieke neuronale processen in een complexe omgeving te ontleden en genereerden integratieve modellen van fysiologische mechanismen13,14,15. Niettemin vormen niet-specifieke culturen aanzienlijke uitdagingen. De fysiologische connectiviteit en anatomische distributie van de neuronen worden bijvoorbeeld verstoord door neuronen uit verschillende hypothalamische regio's te plateren die normaal gesproken niet zouden interageren, waardoor verstorende effecten ontstaan. Bovendien heeft elke regio verschillende rollen en bonte neuronale populaties, waardoor het moeilijk is om eenvoudige biologische processen te bestuderen.
Om deze uitdagingen aan te pakken, zijn in het afgelopen decennium nieuwe benaderingen geïmplementeerd om neuronen van belang te isoleren, zoals immunopanning, Fluorescent-Activated-Cell-Sorting (FACS) en Magnetic-Activated-Cell-Sorting (MACS). Immunopanning is een strategie die wordt gebruikt om gerichte cellen te zuiveren met behulp van met antilichamen bedekte schotels voor een reeks niet-neuronale (negatieve) en neuronale (positieve) selecties. Hoewel deze techniek in principe gezuiverde celculturen met een hoge opbrengst zou kunnen genereren, wordt deze in de praktijk meestal gebruikt voor astrocyten en oligodendrocyten, omdat deze cellen uren van manipulatie kunnen weerstaan16,17. FACS-technologie is een krachtig hulpmiddel om cellen te sorteren op basis van fluorescerende markers en cellulaire kenmerken met behulp van flowcytometrie18,19,20. Zeer weinig studies gebruikten deze methode echter om cellen te isoleren voor celkweek. De techniek is duur en vereist hoogopgeleid personeel om te gebruiken en te onderhouden; Bovendien is het een uitdaging om levensvatbare en steriele cellen te behouden aan het einde van de sorteerprocedure21. Over het algemeen lijkt MACS een eenvoudige, niet-dure techniek te zijn om zeer zuivere en levensvatbare culturen van hypothalamische primaire neuronen te verkrijgen. De methode maakt gebruik van magnetische kralen die via een antilichaam aan de cellen zijn gekoppeld. Hierdoor kunnen de cellen worden geïsoleerd met behulp van het magnetische veld van de kolom.
Hier beschrijven we een methode op basis van MACS-technologie, die meestal wordt gebruikt met corticale neuronen. Dit protocol maakt het mogelijk om in principe levensvatbare en zeer zuivere hypothalamische neuronen te isoleren. In deze studie bereiden we primaire culturen voor van neuronen die de Leptinereceptor (LepR) tot expressie brengen, zoals ARCPOMC - en ARCAgRP-neuronen , die alleen aanwezig zijn in de Arcuate Nucleus. Deze neuronen reageren op leptine, een anorexigeen hormoon dat wordt afgescheiden door het vetweefsel, op biochemische en elektrische manieren. Daarom maakt de isolatie van deze groep neuronen in cultuur de studie van hun hormonale, metabole en elektrische eigenschappen in vitro mogelijk.
Protocol
OPMERKING: Een algemeen overzicht van de experimentele procedure is grafisch weergegeven in figuur 1A. Alle experimenten met muizen die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee (IACUC) van onze instelling. We gebruikten 3 maanden oude C57BL6 / J-muizen, die waren gehuisvest in een door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) goedgekeurde vivarium, onder de hoede van een dierenarts. De muizen leefden in grote kooien, met een licht-donkercyclus van 12 uur, en werden ad libitum gevoerd.
1. Conceptie en zwangerschapsverificatie
- Plaats muizen van elke achtergrond en genotype van belang voor de fokkerij. Noteer de datum en het gewicht van het vrouwtje vóór de conceptie.
- Inspecteer na 6 uur het vrouwtje op een plaque met een sonde. Als de plaque aanwezig is, scheid dan het vrouwtje van het mannetje. Als de plaque niet aanwezig is, houd het vrouwtje dan tot de volgende dag in de kooi en scheid de muizen vervolgens.
- Op dag 7, 10 en 14 na de conceptie weegt u het vrouwtje om de zwangerschap te bevestigen.
2. Media, 24-well plaat en materiaalvoorbereiding
- Plaats op de dag van de celisolatie kant-en-klare, met poly-D-lysine gecoate glazen afdekplaten (zie materiaaltabel) als volgt in een plaat met 24 putten:
- Steriliseer onder een biologische kap een enkele verpakking met 15 coverslips met 70% ethanol en laat drogen. Open de verpakking en plaats de afdekstroken in een plaat van 60 mm. Schud de plaat horizontaal om de afdekstroken te scheiden. Keer vervolgens de plaat om om enkele coverslips op te pakken om in de putten van een 24-putplaat te plaatsen.
- Was de coverslips één keer met 1,0 ml steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gedurende 5 min.
- Bereid in de tussentijd 20,0 ml plating media als volgt voor: tot 18,31 ml BME (Basal Medium Eagle, + Earle's Salts), aangevuld met 1,0 ml warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), voeg 200 μL natriumpyruvaat (uit een 100x voorraad), 200 μL glutamine (uit een 200 nM voorraad) en 100 μL penicilline / streptomycine (uit een 200x voorraad) toe.
- Vervang de HBSS in de putjes door 1,0 ml platingmedia en plaats de plaat bij 37 °C in de incubator.
- Met behulp van een Bunsen-brander worden drie Pasteur-pipetten in afnemende diameters gepolijst. Houd de pipet met één hand vast, steek de punt in de vlam en verwijder deze snel. Herhaal het proces totdat de punt gladder wordt en de diameter is teruggebracht tot de gewenste diameter (beoordeeld met het oog).
3. Reagenspreparaat voor neurale weefseldissociatie, volgens de aanwijzingen van de neurale dissociatiekit
- Na het opwarmen van de digestiebuffer 1 bij kamertemperatuur, bereidt u Enzymmix 1 door 50 μL enzym 1 te mengen met 1,91 ml buffer 1 en enzymmix 2 door 15 μl enzym 2 te mengen met 30 μl digestiebuffer 2. De mixen zijn voldoende om te worden gebruikt voor het hersenweefsel van alle embryo's.
- Bereid 0,5% runderserumalbumine (BSA) in HBSS, bijvoorbeeld 0,25 g in 50,0 ml HBSS.
4. Embryo-extractie
- Autoclaaf twee rechte fijne tangen, een gebogen punttang en een paar fijne chirurgische scharen en steriliseer ze met 70% ethanol voor gebruik. Vul vervolgens de petrischaaltjes met HBSS.
- Euthanaseer één E14-E16 zwangere moeder in de CO2-kamer en voer cervicale dislocatie uit.
OPMERKING: De volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden onder de motorkap worden uitgevoerd: - Steriliseer de buik met 70% ethanol. Knip de buikholte open van de schaamsymfyse tot het xiphoid-proces van de ribbenkast met een chirurgische schaar en tang.
- Haal de baarmoederhoorn eruit en plaats deze in een plaat van 100 mm gevuld met ijskoud HBSS en was grondig.
- Extraheer en scheid alle embryo's van de baarmoeder met een fijne tang. Onthoofd de embryo's snel met een fijne chirurgische schaar en/of tang. Plaats de koppen in de 60 mm petrischaal gevuld met HBSS.
5. Hypothalamus extractie, verzameling, en weefsel dissociatie
- Plaats een fijne tang in de oogholte om de hersenen vast te houden. Verwijder met de andere fijne tang de huid en de schedel door te pellen totdat de hersenen zichtbaar zijn. Onderscheid de hersenen van andere weefsels op basis van het witte uiterlijk. Huid en schedel zijn roze en rijk aan vasculatuur.
- Verwijder de hersenen uit de schedel met behulp van de gebogen punttang en schep de hersenen uit de reukbollen en draai deze ondersteboven.
- Nu is de cortex ventraal en is de hypothalamus dorsaal zichtbaar op het superieure oppervlak (figuur 1B). Verwijder met de gebogen tang de laag hersenvliezen en bloedvaten totdat de hersenen er wit en helder uitzien.
- Met de gebogen tang scheidt u het hypothalamusgebied van de rest van de hersenen.
- Snijd de hypothalamus in 3-4 kleine stukjes en breng met een pipet de stukjes over in een buis van 15 ml.
- Herhaal de stappen voor de andere embryo's terwijl de buis op ijs ligt.
- Vul de buis met 6,0 ml HBSS en laat het weefsel bezinken, verwijder het supernatant en voeg Enzym Mix 1 toe. Meng en roer de buis voorzichtig om het weefsel te voorkomen.
- Incubeer de buis gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C en roer het weefsel om de 5 minuten om het weefsel te resuspenderen.
- Voeg na 15 minuten 30 μL enzymmengsel 2 toe. Dissocieer het hersenweefsel met behulp van de pipet Pasteur met de grootste diameter (<1 mm). Pipetteer 10x op en neer zonder bubbels te vormen.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in het waterbad. Roer de buis voorzichtig om het weefsel om de 5 minuten te resuspenderen.
- Voeg na 10 minuten de resterende 15 μL enzymmengsel 2 toe. Dissocieer het weefsel 10x met de andere twee vuurgepolijste pipetten met afnemende diameter, op en neer zonder belletjes te vormen.
- Voeg aan de buis met het gedissocieerde weefsel onmiddellijk 10,0 ml HBSS-0,5% BSA toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g .
- Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel in 1,0 ml HBS-0,5% BSA.
6. Celtelling
- Verdun de celsuspensie 1:5 met HBSS-0,5% BSA.
- Plaats 10 μL van de verdunde celsuspensie in een Neubauer-telkamer.
- Tel onder een brightfieldmicroscoop alleen de cellen die zich in de hoekvierkanten van de vier kamers bevinden. Bereken het gemiddelde en vermenigvuldig met 5 × 104.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er >106 cellen zijn om over te gaan tot celisolatie; Het optimale celnummer is 107.
7. Negatieve selectie
OPMERKING: Negatieve selectie stelt gebruikers in staat om een zuivere primaire neuroncultuur te verkrijgen door neuronale en niet-neuronale cellen te scheiden. Gebruik voorgekoelde oplossingen.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten op 300 × g (centrifugeren kan tot 10 minuten worden verlengd). Zuig het supernatant voorzichtig aan en resuspensie van de pellet tot een concentratie van 107 cellen in 80 μL HBSS-0,5% BSA.
- Voeg 20 μL Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Was de cellen om vrije antilichamen te verwijderen met 2,0 ml HBSS-0,5% BSA en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g .
- Zuig het supernatant voorzichtig aan en resuspensie van de pellet in 80 μL HBSS-0,5% BSA. Voeg 20 μL anti-biotine Microbeads toe, meng grondig en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Voeg 0,5 ml HBSS-0,5% BSA toe voor maximaal 107 cellen en wacht tot de magnetische kolom klaar is.
8. Magnetische scheiding, negatieve selectie
OPMERKING: Magnetische scheiding is een cruciale stap die de scheiding van de niet-neuronale cellen van de neuronale cellen mogelijk maakt. Het monster met neuronale en niet-neuronale cellen wordt door het magnetisch veld geleid en de niet-neuronale cellen, die gebonden zijn aan een biotine-antilichaam-magnetisch kralencomplex, worden gevangen in de kolom (figuur 1C). De vrije neuronale cellen worden door de kolom geëlueerd en worden verzameld in een buis van 15 ml.
- Bereid de standaard (meegeleverd in de kit) voor met de separator en de MS-kolom zoals weergegeven in figuur 1C.
- Open de kolom en stel de standaard alleen in wanneer de cellen klaar zijn om te worden gescheiden.
- Spoel de kolom af met 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Wacht tot de oplossing stopt met druppelen.
- Om neuronale cellen te verzamelen, plaatst u een buis van 15 ml onder de kolom en passeert u 0,5 ml van de celsuspensie door de kolom. Verzamel het eluaat in de buis totdat het stopt met druppelen. Om resterende neuronale cellen te vangen, wast u de kolom 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
- Om niet-neuronale cellen te verzamelen, verwijdert u de kolom van de magneet en plaatst u deze in een nieuwe buis van 15 ml. Voeg 1,0 ml HBSS - 0,5% BSA toe aan de kolom en gebruik de zuiger om de magnetisch gelabelde niet-neuronale cellen te verzamelen.
- Centrifugeer de neuronale en niet-neuronale cellen op 300 × g gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant voorzichtig op en resuspensie van de cellen in 1,0 ml HBSS-0,5% BSA. Tel de cellen zoals eerder beschreven in rubriek 6.
- Plaats indien nodig de niet-neuronale cellen in een 24-putplaat; gooi ze anders weg.
9. Positieve selectie
OPMERKING: Zodra een zuivere neuronale celsuspensie is verkregen, wordt positieve selectie uitgevoerd om de beoogde cellen te isoleren. Cellen kunnen worden geïsoleerd door een specifiek biotine-geconjugeerd antilichaam te gebruiken voor een oppervlakteantigeen. Het antilichaam wordt herkend door anti-biotine magnetische kralen. Door de celsuspensie door de kolom te laten stromen, worden alleen de cellen van belang gevangen in het magnetisch veld.
- Centrifugeer de zuivere neuronale celsuspensie op 300 × g gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant voorzichtig aan en resuspensie van de pellet in 80 μL HBSS-0,5% BSA. Voeg het specifieke antilichaam toe volgens de instructies van de fabrikant en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Als cellen die de LepR tot expressie brengen worden gezocht, stellen we een muis leptine R biotinylated antilichaam voor (zie tabel met materialen) in een concentratie van 0,50 μg / 106 cellen. - Was het overtollige antilichaam af met 2,0 ml HBSS-0,5% BSA en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g .
- Verwijder het supernatant, resuspensie van de pellet in 80 μL HBSS-0,5% BSA en voeg 20 μL anti-biotine microbeads toe. Incubeer bij 4 °C gedurende 10 min.
- Voeg voor elke 107 cellen 0,5 ml HBSS-0,5% BSA toe en wacht tot de magnetische kolom klaar is.
10. Magnetische scheiding, positieve selectie
- Bereid de stand voor met de separator en de MS-kolom. Spoel de MS-kolom af met 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Wacht tot het druppelen stopt.
- Plaats een buis van 15 ml onder de kolom, passeer 0,5 ml van de celsuspensie door de kolom en verzamel het eluaat bestaande uit de niet-specifieke neuronale cellen. Om de kolom van resterende niet-specifieke neuronale cellen te reinigen, wast u met 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
- Verwijder de kolom van de magneet, plaats deze in een nieuwe buis van 15 ml en voeg 1,0 ml HBSS-0,5% BSA toe. Gebruik de zuiger om de beoogde cellen weg te spoelen.
- Centrifugeer beide buizen op 300 × g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant voorzichtig en resuspensie het in 0,5 ml platingmedium.
- Tel de cellen zoals eerder beschreven in rubriek 6.
- Plaat zowel doelcellen als de positieve controle en niet-specifieke cellen als de negatieve controle bij 120.000-200.000 cellen/mm3 dichtheid in de 24-well plaat eerder bereid zoals beschreven in sectie 2 en incubeer bij 37 °C in 5% CO 2, 9% O2 en 95% vochtigheid gedurende 12 uur.
11. Onderhoud van celkweek
- Bereid 20 ml kweekmedium met 19,2 ml neuronaal kweekmedium, 400 μl B27-supplement (uit een 50x-stam), 200 μl glutamine (uit een voorraad van 200 μM) en 100 μl penicilline / streptomycine (uit een voorraad van 200x).
- Vervang plating media van de 24 putplaat met neuronale of niet-neuronale cellen.
- Wassen met 2 x 1,0 ml HBSS.
- Voeg 1,0 ml cultuurmedia toe.
- Ververs de media elke 2/3 dagen door 0,5 ml oude media te vervangen door 0,5 ml verse media.
OPMERKING: Cellen kunnen in cultuur worden gehouden en tot 21 dagen in vitro worden gebruikt (DIV21).
12. Neuron immunofluorescentie kleuring
- Bereid twaalf uur voor de kleuring een oplossing bestaande uit 50/50 methanol en aceton en koel deze een nacht af bij -20 °C.
- Was de neuronen in de 24-well plaat met 2 x 1,0 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 min.
- Vervang de PBS-oplossing door 1,0 ml van de 50/50-oplossing en incubeer gedurende 20 minuten in ijs.
- Wassen met 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
- Blokkeer de neuronen met 3% BSA in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid de primaire antilichaamoplossing in 3% BSA in 1x PBS, met behulp van de antilichaamconcentratie die wordt vermeld in de aanwijzingen van de fabrikant. De gebruikte antilichamen en concentraties zijn opgenomen in de materiaaltabel.
- Vervang de blokkerende oplossing door de primaire antilichaamoplossing en incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Was de cellen 3 x 10 min met 1x PBS.
- Bereid de secundaire antilichaamoplossing met 3% BSA in 1x PBS, met behulp van de concentraties van de antilichamen volgens de instructies van de fabrikant. De gebruikte secundaire antilichamen zijn opgenomen in de materiaaltabel.
- Incubeer de cellen met de secundaire antilichaamoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was de cellen 3 x 10 min met 1x PBS.
- Laat de neuronen in 1x PBS tijdens de montageprocedure. Plaats een kleine druppel montagemedium (met of zonder 4',6-diamidino-2-fenylindool voor nucleaire identificatie) op de microscoopglaas. Extraheer een glazen coverslip met neuronen met een tang en tik op de zijkant van de coverslip op een papieren tissue om de overtollige PBS te drogen. Draai de coverslip op het montagemedium en zorg ervoor dat de neuronen naar de microscoopglaasjes zijn gericht; Druk voorzichtig op de overtollige bevestigingsmedia en verwijder deze met tissuepapier.
- De microscoopglaasjes zijn klaar om geanalyseerd te worden met een brightfield of een confocale microscoop.
Representative Results
Dit artikel beschrijft een protocol voor de isolatie van gerichte neuronen van de hypothalamus (figuur 1). De reikwijdte van de methode is om specifieke neuronale kenmerken te bestuderen in een gecontroleerde en geïsoleerde context. Zo werden muizenembryo's geëxtraheerd uit de drachtige moederdieren bij E14-E16. De hersenvliezen werden verwijderd en de hypothalamus werd geïsoleerd van de rest van de hersenen. Het weefsel werd voorzichtig gedissocieerd met twee mengsels van enzymen vers bereid met behulp van de gerefereerde dissociatiekit. Eerst werden niet-neuronale cellen gescheiden van neuronale cellen - glia, microglia en neuronen werden verzameld in dezelfde eencellige suspensie. Hiertoe werden niet-neuronale cellen gelabeld met behulp van een cocktail van antilichamen die niet-neuronale oppervlakte-epitopen herkennen. Na incubatie werd het antilichaamcelcomplex geconjugeerd met magnetische microbeads en vervolgens door een magnetische kolom geleid om de niet-neuronale cellen te vangen.
Deze stap leverde twee celsuspensies op, een met niet-neuronale en de andere met neuronale cellen. Beide ophangingen konden direct worden verguld. Als alternatief kan de neuronale celsuspensie verder worden gemanipuleerd om een neuronale subpopulatie (gerichte suspensie) van de rest te scheiden met behulp van dezelfde strategie. Op basis van het experiment van belang kunnen de neuronale cellen worden geplateerd van 125.000 tot 200.000 cellen / mm3. De minder dichte culturen kunnen worden gebruikt om neuronen met eencellige resolutie te analyseren: van axonale ontwikkeling, synaptische vorming en transmissie tot elektrofysiologie. De dichtere culturen kunnen worden gebruikt voor biochemische analyses, waaronder DNA- en RNA-extractie, western blot, Southern blot, Northern blot, real-time PCR en RNA-sequencing.
In deze studie was LepR gericht op het isoleren van neuronen die betrokken zijn bij het melanocortinesysteem, zoals de ARCPOMC- en ARCAgRP-neuronen. Cellen werden geplateerd met dichtheden variërend van 120.000 cellen / mm 3, voor LepR + neuronen, tot 200.000 cellen / mm3 voor generieke neuronale populaties. Na 48 uur begonnen LepR+ neuronen neurieten te vormen (figuur 2). Bij DIV4 vertoonden axonale extensies vooruitgang, terwijl dendritische processen begonnen te verschijnen. Bij DIV6 waren de neuronen voldoende ontwikkeld en dus klaar om geanalyseerd te worden. Immunofluorescentie-experimenten op LepR+ neuronen toonden 99% expressie van LepR (groen, figuur 3A). Er werden geen gliacellen of andere niet-neuronale cellen waargenomen, wat de zuiverheid van de primaire neuronale cultuur bevestigde. De neuronale aard van de cellen werd bevestigd door microtubule-associated protein 2 (MAP2) kleuring, met de identificatie van axonen en dendritische uitsteeksels (figuur 3B). Bij DIV10 bracht 30% van de LepR+ cellen POMC (rood) tot expressie. Dit wordt verwacht omdat de meerderheid van de LepR + -cellen POMC of AgRP tot expressie brengen. Figuur 3C,D illustreert de colokalisatie tussen POMC- en LepR-signalen. Merk op dat de co-lokalisatie prominent aanwezig was op en rond de kern, zoals verwacht.
Algemene culturen met heterogene hypothalamische neuronale populaties werden gebruikt voor controle. Immunofluorescentie toonde synaptische connectiviteit en functionaliteit aan, zoals beoordeeld door Synapsin-1 (groen) en PSD 95 (rood) co-kleuring (figuur 4A,B). Het aantal LepR+ neuronen aanwezig in de algemene cultuur was ~5%, een percentage dat consistent is met het idee dat de meerderheid van de LepR-tot expressie brengende neuronen was geselecteerd tijdens het magnetische scheidingsproces (representatieve LepR+ cellen worden geïllustreerd in figuur 4C,D). Alle gegevens die tijdens dit onderzoek worden gegenereerd of geanalyseerd, zijn beschikbaar op https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c.
Figuur 1: Experimenteel stroomschema en opstelling . (A) Grafische weergave van de experimentele procedure. Go-no-go: ≥106 cellen zijn nodig om over te gaan tot celisolatie; Het optimale celnummer is 107. (B) Representatief beeld van een E16-embryobrein. De hypothalamus en hersenvliezen zijn geïndiceerd. (C) MACS-opstelling die wordt gebruikt voor de scheiding en isolatie van doelcellen. Magnetische standaard, magnetische afscheider en kolom zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Neuronale cultuur tussen DIV2 en DIV6. (A) LepR+-cellen verkregen uit de positieve selectie vertonen een verminderde celdichtheid en connectiviteit, maar een normale ontwikkeling van neurieten (rode pijlen), axonen (blauwe pijlen) en dendrieten (groene pijlen). Cellen werden geplateerd met een dichtheid van 120.000 cellen/mm3. Schaalbalk = 100 μm. (B) Generieke hypothalamische neuronen, geplateerd met een dichtheid van 200.000 cellen / mm3, vertonen normale ontwikkelings- en groeikenmerken en connectiviteit (zwarte pijlen). Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: DIV = days in vitro; LepR = leptinereceptor. Alle gegevens die worden gegenereerd of geanalyseerd om dit cijfer te construeren, zijn beschikbaar op https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In vivo neuronen worden samengevat door gekweekte LepR+ neuronen. (A) Representatieve beelden van een cultuur van neuronen die de LepR tot expressie brengen (groen; DAPI is blauw). Negenennegentig procent van de cellen drukte de LepR uit. Neuronen werden geplateerd met een dichtheid van 120.000 cellen / mm3 . Bij DIV7 vertoonden de neuronen langwerpige axonen, dendritische rijping en neuronale connectiviteit (pijlen). Schaalbalk = 40 μm. (B) Immunofluorescentie met anti-MAP2 werd gebruikt om de neuronale aard van de cellen te bevestigen. Neuronaal-specifieke morfologieën zoals axonen, dendrieten en uitsteeksels worden aangetoond (pijlen). Schaalbalk = 40 μm. (C) Vergroting van LepR+ cellen. LepR in groen en DAPI in blauw. Schaalbalk = 10 μm. (D) Co-kleuring met LepR (groen) en POMC (rood). Ongeveer 30% van de LepR+ neuronen was co-immunoreactief op POMC, dat werd gedetecteerd op het niveau van de kern (rode pijlen). Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; MAP2 = microtubule-geassocieerd eiwit 2; POMC = proopiomelanocortine; LepR = leptinereceptor. Alle gegevens die worden gegenereerd of geanalyseerd om dit cijfer te construeren, zijn beschikbaar op https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In vivo cellen worden gerecapituleerd door gekweekte generieke hypothalamische neuronen. (A) Representatieve beelden van generieke hypothalamische neuronale cultuur gekleurd met Synapsine 1 (groen), PSD95 (rood) en DAPI (blauw). De neuronen vertoonden goed ontwikkelde connectiviteit en synaptische functionaliteit (pijlen). Schaalbalk = 40 μm. (B) Vergroting van het vak onder (A), met colokalisatie van Synapsine 1 (groen) en PSD95 (rood, pijlen). Schaalbalk = 20 μm. (C,D) Representatieve afbeeldingen van LepR+ cellen in een algemene cultuur. LepR+ cellen (groen) waren goed voor ~5% van het totaal. Representatieve LepR+ cellen worden aangegeven met pijlen. Schaalbalk = 40 μm. (E,F) Vergrotingen van de vakken in (C,D) met groene puncta leptine receptoren gelokaliseerd bij de soma. Schaalbalk = 20 μm. Alle gegevens die worden gegenereerd of geanalyseerd om dit cijfer te construeren, zijn beschikbaar op https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het onderzoeken van de biochemische en elektrische eigenschappen van hypothalamische neuronen is de sleutel tot het begrijpen van de moleculaire basis van metabolisme, thermoregulatie, stemmingsbeheer, voedingsgedrag en meer. De neuronale heterogeniteit van de hypothalamus maakt deze inspanning echter uitdagend en methoden om specifieke hypothalamische subpopulaties te isoleren en te bestuderen zijn nodig.
In vivo technieken maken gebruik van CRE-recombinase, optogenetische, vezelfotometrie en calciumbeeldvorming. Deze benaderingen maken het voornamelijk mogelijk om de elektrische eigenschappen van hypothalamische neuronen te bestuderen, en er zijn momenteel zeer weinig methoden beschikbaar om hun niet-elektrische eigenschappen te onderzoeken. De MACS-technologie die in deze studie is ontwikkeld, zou een techniek kunnen bieden die geschikt is voor het isoleren van specifieke hypothalamische neuronale subpopulaties in vitro, waardoor gerichte behandelingen en analyses mogelijk worden. Neuronale culturen zijn eenvoudiger te beheren in vergelijking met co-culturen van verschillende neuronale populaties. Bovendien vermijden zuivere culturen verstorende effecten die voortvloeien uit de aanwezigheid van glia en microglia. Zo konden neuronen uit hetzelfde hypothalamische gebied en type worden bestudeerd als reactie op specifieke metabole en hormonale inputs.
In dit protocol selecteerden we hypothalamische neuronen die de LepR tot expressie brengen. Geïsoleerde LepR+ cellen werden gekweekt om hun cellulaire, morfologische en moleculaire kenmerken te onderzoeken die moeilijk in vivo te bestuderen zijn.De zuiverheid van de culturen was 99%, wat de nauwkeurigheid van de methode ondersteunt. Bovendien waren de LepR+ cellen gezond en levensvatbaar bij DIV7 tot DIV21.
Deze techniek heeft echter enkele beperkingen. E18 of oudere zuivere neuronculturen zijn een uitdaging om te onderhouden. Daarom is het extractievenster beperkt tot E14-E16. Dit impliceert dat cellulaire veranderingen die optreden na E16 worden gemist. De expressie van de leptinereceptor in ARC-neuronen neemt bijvoorbeeld toe tijdens de vroege postnatale periode22. De procedure voor de isolatie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om cellulaire stress en dood te verminderen en de opbrengst te verbeteren. De procedure kan tot 5 uur duren; Daarom is het essentieel om steriele omstandigheden te handhaven en manipulatie tot het noodzakelijke minimum te beperken. De positieve selectie kan leiden tot een lage opbrengst vanwege de lage hoeveelheden beschikbaar weefsel, waardoor het aantal experimenten dat met een enkel preparaat kan worden uitgevoerd, wordt beperkt. Verhoogde neuronale sterfte werd waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van lage celdichtheid en verminderde neuronale connectiviteit en intraneuronale ondersteuning.
Bovendien moet het antilichaam dat zich richt op het antigeen van belang binden aan het celoppervlak om een correcte scheiding te garanderen; meestal zijn antilichamen die worden gebruikt voor flowcytometrie geschikt voor de MACS-techniek. Als het antilichaam nog niet eerder is gebruikt in celscheidingsmethoden, zijn validatie- en titratie-experimenten nodig om het ideale gebruik en de ideale concentratie te bepalen. De extractie van gerichte cellen vereist een celoppervlakmarker. Hier gebruikten we een gebiotinyleerd antilichaam, maar in principe konden antilichamen geconjugeerd met andere moleculen, zoals FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) en PE (gezuiverd anti-fycoerythrin), ook worden gebruikt. MACS-technologie kan ook worden toegepast op neuronen die een fluorofoor tot expressie brengen, zoals GFP of een ander Tag-eiwit, waardoor de specificiteit en opbrengst mogelijk toenemen. Als een fluorofoor niet wordt gebruikt, zou het alternatief zijn om de expressie van het molecuul van belang te bevestigen door immunofluorescentie voordat levende celexperimenten worden uitgevoerd. Toekomstige studies zullen de validiteit van deze alternatieven testen.
Een belangrijk aspect dat deze studie niet behandelde, betreft de "getrouwheid" van de subneuronale populaties. We stelden vast dat de gekweekte LepR + -neuronen POMC tot expressie brachten, wat een handtekening is van inheemse ARCPOMC-neuronen . Er zullen echter meer tests nodig zijn om te concluderen dat de LepR + neuronale culturen hun inheemse in vivo tegenhangers recapituleren. Over het algemeen kan het hier gepresenteerde MACS-neuronale isolatieprotocol een geldige en effectieve methode bieden om in vitro hypothalamusmechanismen te bestuderen die anders moeilijk in vivo te onderzoeken zouden zijn.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Met BioRender.com werden grafische figuren gemaakt. Dit werk werd ondersteund door een NIA-subsidie (R01AG060919) en een NSF-subsidie (2030348) aan FS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo extraction | |||
| 1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
| 1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
| 60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Bench pads | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Cell Culture | |||
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
| Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
| Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
| Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
| Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
| Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
| Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
| MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit - Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
| Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
| Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
| Staining | |||
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
| Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
| POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
| PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
| Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
| Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
References
- Cone, R. D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nature Neuroscience. 8 (5), 571-578 (2005).
- Clarke, I. J. Hypothalamus as an endocrine organ. Comprehensive Physiology. 5 (1), 217-253 (2015).
- Mignot, E., Taheri, S., Nishino, S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. Nature Neuroscience. 5 Suppl, 1071-1075 (2002).
- Baird, A. D., Wilson, S. J., Bladin, P. F., Saling, M. M., Reutens, D. C. Neurological control of human sexual behaviour: insights from lesion studies. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (10), 1042-1049 (2007).
- Caria, A., Dall, O. G. Functional neuroimaging of human hypothalamus in socioemotional behavior: a systematic review. Brain Sciences. 12 (6), 707 (2022).
- Andermann, M. L., Lowell, B. B. Toward a wiring diagram understanding of appetite control. Neuron. 95 (4), 757-778 (2017).
- Romanov, R. A., Alpar, A., Hokfelt, T., Harkany, T. Unified classification of molecular, network, and endocrine features of hypothalamic neurons. Annual Review of Neuroscience. 42, 1-26 (2019).
- Hajdarovic, K. H., Yu, D., Webb, A. E. Understanding the aging hypothalamus, one cell at a time. Trends in Neurosciences. 45 (12), 942-954 (2022).
- Zhang, Y. H., et al. Cascade diversification directs generation of neuronal diversity in the hypothalamus. Cell Stem Cell. 28 (8), 1483-1499 (2021).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-cell RNA-seq reveals hypothalamic cell diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Ma, C., et al. Neural pathways from hypothalamic orexin neurons to the ventrolateral preoptic area mediate sleep impairments induced by conditioned fear. Frontiers in Neuroscience. 17, 1122803 (2023).
- Wang, F., et al. A parabrachial to hypothalamic pathway mediates defensive behavior. Elife. 12, e85450 (2023).
- Cowley, M. A., et al. Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature. 411 (6836), 480-484 (2001).
- Parekh, R. U., et al. Hypothalamic kinin B1 receptor mediates orexin system hyperactivity in neurogenic hypertension. Scientific Reports. 11 (1), 21050 (2021).
- Schmidt, C. X., Tsang, A. H., Oster, H. Generation of mouse primary hypothalamic neuronal cultures for circadian bioluminescence assays. Bio-protocol. 11 (5), e3944 (2021).
- Foo, L. C. Purification of rat and mouse astrocytes by immunopanning. 2013 (5), Cold Spring Harbor Protocols. 421-432 (2013).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. 2013 (9), Cold Spring Harbor Protocols. 854-868 (2013).
- Zhao, H., et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea. International Journal of Molecular Sciences. 12 (3), 1862-1875 (2011).
- Zhang, Z. M., et al. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chinese Medical Journal. 124 (12), 1813-1817 (2011).
- Drake, S. S., Zaman, A., Simas, T., Fournier, A. E. Comparing RNA-sequencing datasets from astrocytes, oligodendrocytes, and microglia in multiple sclerosis identifies novel dysregulated genes relevant to inflammation and myelination. WIREs Mechanisms of Disease. 15 (2), e1594 (2023).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Cottrell, E. C., et al. Developmental changes in hypothalamic leptin receptor: relationship with the postnatal leptin surge and energy balance neuropeptides in the postnatal rat. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296 (3), R631-R639 (2009).
