Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att odla specifika hypotalamuscellsubtyper i odling. Cellerna kan väljas ut baserat på lämpliga/unika membranmarkörer och användas i många applikationer, inklusive immunofluorescens, elektrofysiologiska och biokemiska analyser.
Abstract
Hypotalamus reglerar grundläggande metaboliska processer genom att kontrollera funktioner så varierande som matintag, kroppstemperatur och hormonfrisättning. Eftersom hypotalamus funktioner styrs av specifika undergrupper av neuronala populationer, ger förmågan att isolera dem ett viktigt verktyg för att studera metaboliska mekanismer. I detta avseende utgör hypotalamus neuronala komplexitet exceptionella utmaningar.
Av dessa skäl har nya tekniker, såsom Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), utforskats. Denna artikel beskriver en ny tillämpning av magnetaktiverad cellsortering (MACS) med hjälp av mikropärlteknik för att isolera en riktad neuronal population från prenatala mösshjärnor. Tekniken är enkel och garanterar en mycket ren och livskraftig primär hypotalamisk neuronkultur med hög reproducerbarhet. Hypotalamus dissocieras försiktigt, neuroner isoleras selektivt och separeras från gliaceller, och slutligen, med hjälp av en specifik antikropp för en cellytemarkör, väljs den intressanta populationen.
När de väl har isolerats kan riktade neuroner användas för att undersöka deras morfologiska, elektriska och endokrina egenskaper och deras svar under normala eller patologiska tillstånd. Dessutom, med tanke på hypotalamus olika roller för att reglera matning, ämnesomsättning, stress, sömn och motivation, kan en närmare titt på riktade och regionspecifika neuroner ge insikt i deras uppgifter i denna komplexa miljö.
Introduction
Hypotalamus är ett mångsidigt område i hjärnan som förmedlar endokrina, autonoma, viscerala och beteendemässiga funktioner, inklusive matning, ämnesomsättning, sömn, kroppstemperatur, socialt beteende och sexlust 1,2,3,4,5. Funktionell heterogenitet uppnås genom en synergistisk kombination av biokemiska och elektriska mekanismer: hypotalamiska neuroner avfyrar aktionspotentialer och utsöndrar och frigör hormoner och neuropeptider för att modulera hjärnregioner och organ i kroppen. Slutligen översätter hypotalamus neuroner homeostatiska meddelanden från kroppen och svarar med långsiktig och kortsiktig feedback och feedforward-regleringar6.
Den komplexa neuronala miljön i hypotalamus inkluderar magnocellulära endokrina neuroner, som frigör oxytocin och vasopressin; parvocellulära nervceller, som främst är involverade i den systemiska hormonregleringen, frisätter till exempel tyreotropinfrisättningshormon (TRH) och kortikotropinfrisättningshormon (CRH) till hypofysen; stora peptiderga projektionsneuroner, frisättning av orexin och melaninkoncentrerande hormon (MCH); och parvocellulära peptiderga neuroner i Arcuate Nucleus (ARC) som frisätter POMC (proopiomelanocortin) och AgRP (agouti-relaterat protein), benämnda ARCPOMC respektive ARCAgRP. Tillsammans med sekretoriska celler är andra excitatoriska och hämmande neuroner, inklusive dopaminerga, glutaminerga och GABAerga neuroner 7, involverade i att bilda intrahypotalamus och extrahypotalamus kretsar, vilket skapar storskaliga samordnade nätverk av betydande cellulär heterogenitet8.
Hypotalamisk mångfald har varit en utmaning som forskare har försökt övervinna under de senaste 50 åren. För att studera denna heterogenitet i utvecklande, mogen och åldrande hypotalami har forskare å ena sidan använt encells-RNA-sekvensering för att utforska neuronal organisation, såväl som molekylära och transkriptomiska signaturer. Denna ansträngning har gett en insiktsfull inblick i de olika rollerna för hypotalamus neuroner och har tagit upp kopplingar mellan cellulär identitet och dess möjliga roll i det fysiologiska systemet 8,9,10. Å andra sidan har neuronala funktioner undersökts genom optogenetiska manipulationer och fiberfotometribeteendemetoder, vilket ger en närmare titt på kretsstrukturen. Under de senaste två decennierna har Cre-recombinas-tekniken gjort det möjligt för forskare att ontogenetiskt stimulera eller hämma en riktad grupp av neuroner samtidigt som de observerar förändringar i beteenden och kroppsreaktioner 6,11,12.
Dessa tillvägagångssätt undersöker dock hypotalamiska funktioner ur ett generellt perspektiv utan att dyka djupare in i de specifika cellulära mekanismerna eller den biologiska grunden för deras roll i den komplexa hypotalamusmiljön. För att ta itu med detta har mycket få studier fokuserat på att undersöka molekylära, biokemiska och elektriska egenskaper med hjälp av heterogena primära hypotalamuskulturer. Dessa studier syftade till att dissekera specifika neuronala processer i en komplex miljö och genererade integrativa modeller av fysiologiska mekanismer13,14,15. Icke desto mindre innebär icke-specifika kulturer betydande utmaningar. Till exempel störs neuronernas fysiologiska konnektivitet och anatomiska distribution av plätering av neuroner från olika hypotalamusregioner som normalt inte skulle interagera, vilket skapar förväxlingseffekter. Dessutom har varje region olika roller och brokiga neuronala populationer, vilket gör det svårt att studera enkla biologiska processer.
För att ta itu med dessa utmaningar har nya metoder under det senaste decenniet implementerats för att isolera neuroner av intresse, såsom immunpanorering, fluorescerande-aktiverad-cellsortering (FACS) och magnetisk-aktiverad-cellsortering (MACS). Immunpanorering är en strategi som används för att rena målceller med hjälp av antikroppsbelagda skålar för en serie icke-neuronala (negativa) och neuronala (positiva) urval. Även om denna teknik i princip skulle kunna generera högavkastande renade cellkulturer, används den i praktiken mest för astrocyter och oligodendrocyter eftersom dessa celler kan motstå timmar av manipulation16,17. FACS-tekniken är ett kraftfullt verktyg för att sortera celler baserat på fluorescerande markörer och cellulära egenskaper med hjälp av flödescytometri18,19,20. Mycket få studier använde dock denna metod för att isolera celler för cellodling. Tekniken är dyr och kräver högkvalificerad personal för att använda och underhålla; Dessutom är det en utmaning att upprätthålla livskraftiga och sterila celler i slutet av sorteringsproceduren21. Sammantaget verkar MACS vara en enkel, icke-dyr teknik för att erhålla mycket rena och livskraftiga kulturer av hypotalamus primära neuroner. Metoden använder magnetiska kulor som är kopplade till cellerna via en antikropp. Detta gör att cellerna kan isoleras med hjälp av kolonnens magnetfält.
Här beskriver vi en metod baserad på MACS-teknik, som vanligtvis används med kortikala nervceller. Detta protokoll gör det möjligt att i princip isolera livskraftiga och mycket rena hypotalamusneuroner. I denna studie förbereder vi primära kulturer av neuroner som uttrycker Leptinreceptorn (LepR), såsom ARCPOMC och ARCAgRP-neuroner , som endast finns i Arcuate Nucleus. Dessa nervceller reagerar på leptin, ett anorexigent hormon som utsöndras av fettvävnaden, på biokemiska och elektriska sätt. Därför möjliggör isoleringen av denna grupp av neuroner i odling studier av deras hormonella, metaboliska och elektriska egenskaper in vitro.
Protocol
OBS: En allmän bild av försöksförfarandet illustreras grafiskt i figur 1A. Alla försök med möss som utfördes i denna studie godkändes av vår institutions Animal Care and Use Committee (IACUC). Vi använde 3 månader gamla C57BL6/J-möss, som var inhysta i ett AAALAC-godkänt vivarium som godkänts av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC), under vård av en veterinär. Mössen levde i stora burar, med en 12 timmars ljus-mörker-cykel, och matades ad libitum.
1. Befruktning och graviditetsverifiering
- Placera möss av vilken bakgrund och genotyp som helst för avel. Anteckna datum och honans vikt före befruktningen.
- Efter 6 timmar inspekterar du honan för att se om det finns ett plack med en sond. Om det finns plack, separera honan från hanen. Om placket inte finns, håll honan i buren till nästa dag och separera sedan mössen.
- På dag 7, 10 och 14 efter befruktningen ska du väga honan för att bekräfta dräktigheten.
2. Media, 24-hålsplatta och materialberedning
- På dagen för cellisolering, placera bruksfärdiga, poly-D-lysinbelagda glastäcken (se materialförteckning) i en 24-hålsplatta enligt följande:
- Sterilisera en enda förpackning med 15 täckglas med 70 % etanol under en biologisk huv och låt torka. Öppna förpackningen och placera täckglasen i en 60 mm platta. Skaka plattan horisontellt för att separera täckglasen. Vänd sedan plattan för att plocka upp enstaka täckglas som ska placeras i brunnarna på en 24-hålsplatta.
- Tvätta täckglasen en gång med 1,0 ml steril Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) i 5 minuter.
- Under tiden bereds 20,0 ml pläteringsmedium enligt följande: till 18,31 ml BME (Basal Medium Eagle, + Earle's Salts), kompletterat med 1,0 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), tillsätt 200 μL natriumpyruvat (från en 100x stam), 200 μL glutamin (från en 200 nM-stam) och 100 μL penicillin/streptomycin (från en 200x-stam).
- Byt ut HBSS i brunnarna mot 1.0 ml pläteringsmedia och placera plattan i inkubatorn vid 37 °C.
- Använd en bunsenbrännare för att eldpolera tre Pasteurpipetter i minskande diametrar. Håll pipetten med ena handen, sätt in spetsen i lågan och ta snabbt bort den. Upprepa processen tills spetsen slätas ut och diametern reduceras till önskad diameter (bedöms med ögat).
3. Reagensberedning för neural vävnadsdissociation, enligt anvisningarna i neurala dissociationssatsen
- Efter att ha värmt uppslutningsbuffert 1 vid rumstemperatur, bered enzymblandning 1 genom att blanda 50 μl enzym 1 med 1,91 ml buffert 1 och enzymblandning 2 genom att blanda 15 μl enzym 2 med 30 μl uppslutningsbuffert 2. Blandningarna är tillräckliga för att användas för alla embryons hjärnvävnad.
- Bered 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) i HBSS, till exempel 0,25 g i 50,0 ml HBSS.
4. Extraktion av embryon
- Autoklavera två raka fina pincetter, en böjd spetspincett och ett par fina kirurgiska saxar och sterilisera dem med 70 % etanol före användning. Fyll sedan petriskålarna med HBSS.
- Avliva en E14-E16 dräktig hona i CO2 -kammaren och utför cervikal dislokation.
OBS: Följande steg måste utföras under huven under sterila förhållanden: - Sterilisera buken med 70 % etanol. Skär upp bukhålan från blygdbenssymfysen till xiphoid-processen i bröstkorgen med kirurgisk sax och pincett.
- Dra ut livmoderhornet och lägg det i en 100 mm platta fylld med iskall HBSS och tvätta noggrant.
- Extrahera och separera alla embryon från livmodern med en fin pincett. Halshugg snabbt embryona med en fin kirurgisk sax och/eller pincett. Lägg huvudena i 60 mm petriskålen fylld med HBSS.
5. Hypotalamus extraktion, uppsamling och dissociation av vävnad
- Placera en fin pincett i ögonhålan för att hålla hjärnan. Använd den andra fina pincetten och ta bort huden och skallen genom att skala tills hjärnan är synlig. Skilj hjärnan från andra vävnader baserat på dess vita utseende. Hud och skalle är rosa och rika på kärl.
- Ta bort hjärnan från skallen med hjälp av den böjda punktpincetten och skopa ut hjärnan från luktbulberna och vänd den upp och ner.
- Nu är cortex ventral och hypotalamus är synlig dorsalt på den övre ytan (Figur 1B). Med den böjda pincetten tar du bort lagret av hjärnhinnor och blodkärl tills hjärnan ser vit och klar ut.
- Med den böjda pincetten separerar du hypotalamusområdet från resten av hjärnan.
- Skär hypotalamus i 3-4 små bitar och överför bitarna till ett 15 ml rör med en pipett.
- Upprepa stegen för de andra embryona medan röret ligger på is.
- Fyll tuben med 6,0 ml HBSS och låt vävnaden sätta sig, ta bort supernatanten och tillsätt Enzyme Mix 1. Blanda försiktigt och skaka röret för att förhindra vävnaden.
- Inkubera röret i ett 37 °C vattenbad i 15 minuter och skaka om vävnaden var 5:e minut för att återsuspendera vävnaden.
- Efter 15 minuter, tillsätt 30 μL Enzyme mix 2. Dissociera hjärnvävnaden med hjälp av pipetten Pasteur med den största diametern (<1 mm). Pipeta upp och ner 10 gånger utan att bilda bubblor.
- Inkubera i 10 minuter vid 37 °C i vattenbadet. Rör försiktigt om röret för att återsuspendera vävnaden var 5:e minut.
- Efter 10 minuter, tillsätt resterande 15 μL av Enzyme mix 2. Dissociera vävnaden 10 gånger med de andra två eldpolerade pipetterna med minskande diameter, upp och ner utan att bilda bubblor.
- Tillsätt omedelbart 10,0 ml HBSS-0,5 % BSA till röret med den dissocierade vävnaden och centrifugera vid 300 × g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1,0 ml HBS-0,5 % BSA.
6. Cellräkning
- Späd cellsuspensionen 1:5 med HBSS-0,5 % BSA.
- Placera 10 μl av den utspädda cellsuspensionen i en Neubauer-räknekammare.
- Under ett ljusfältsmikroskop räknar du bara de celler som finns i de fyra kammarens hörnrutor. Beräkna medelvärdet och multiplicera med 5 × 104.
OBS: Se till att det finns >106 celler för att gå vidare till cellisolering; Det optimala celltalet är 107.
7. Negativt urval
OBS: Negativ selektion gör det möjligt för användare att erhålla en ren primär neuronkultur genom att separera neuronala och icke-neuronala celler. Använd förkylda lösningar.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 × g i 3 minuter (centrifugeringen kan förlängas upp till 10 minuter). Aspirera försiktigt supernatanten och återsuspendera pelleten till en koncentration av 107 celler i 80 μL HBSS-0,5 % BSA.
- Tillsätt 20 μl Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail och inkubera i 5 minuter vid 4 °C.
- Tvätta cellerna för att avlägsna fria antikroppar med 2,0 ml HBSS-0,5 % BSA och centrifugera vid 300 × g i 3 minuter.
- Aspirera försiktigt supernatanten och återsuspendera pelleten i 80 μL HBSS-0,5 % BSA. Tillsätt 20 μl mikropärlor av antibiotin, blanda ordentligt och inkubera i 10 minuter vid 4 °C.
- Tillsätt 0,5 ml HBSS-0,5 % BSA för upp till 107 celler och vänta tills magnetpelaren är klar.
8. Magnetisk separering, negativt urval
OBS: Magnetisk separation är ett avgörande steg som möjliggör separation av de icke-neuronala cellerna från neuronala celler. Provet som innehåller neuronala och icke-neuronala celler passerar genom magnetfältet och de icke-neuronala cellerna, som är bundna till ett biotin-antikropps-magnetiskt pärlkomplex, fångas i kolonnen (figur 1C). De fria neuronala cellerna elueras genom kolonnen och samlas i ett 15 ml rör.
- Förbered stativet (ingår i satsen) med separatorn och MS-kolonnen som visas i figur 1C.
- Öppna pelaren och ställ upp stativet först när cellerna är redo att separeras.
- Skölj kolonnen med 0,5 ml HBSS-0,5 % BSA. Vänta tills lösningen slutar droppa.
- För att samla neuronala celler, placera ett 15 ml rör under kolonnen och passera 0,5 ml av cellsuspensionen genom kolonnen. Samla upp eluatet i röret tills det slutar droppa. För att fånga upp kvarvarande neuronala celler, tvätta kolonnen 3 x 0,5 ml HBSS-0,5 % BSA.
- För att samla icke-neuronala celler, ta bort kolonnen från magneten och placera den i ett nytt 15 ml rör. Tillsätt 1,0 ml HBSS - 0,5 % BSA till kolonnen och använd kolven för att samla upp de magnetiskt märkta icke-neuronala cellerna.
- Centrifugera de neuronala och icke-neuronala cellerna vid 300 × g i 3 minuter. Aspirera försiktigt supernatanten och återsuspendera cellerna i 1,0 ml HBSS-0,5 % BSA. Räkna cellerna enligt beskrivningen tidigare i avsnitt 6.
- Om det behövs, platta de icke-neuronala cellerna i en 24-brunnars platta; annars kassera dem.
9. Positivt urval
OBS: När en ren neuronal cellsuspension erhålls, utförs positivt urval för att isolera målcellerna. Celler kan isoleras genom att använda en specifik biotinkonjugerad antikropp för ett ytantigen. Antikroppen känns igen på anti-biotin magnetiska pärlor. Genom att låta cellsuspensionen flöda genom kolonnen fångas endast de celler som är av intresse i magnetfältet.
- Centrifugera den rena neuronala cellsuspensionen med 300 × g i 3 minuter. Aspirera försiktigt supernatanten och återsuspendera pelleten i 80 μL HBSS-0,5 % BSA. Tillsätt den specifika antikroppen enligt tillverkarens anvisningar och inkubera vid 4 °C i 10 minuter.
OBS: Om celler som uttrycker LepR söks, föreslår vi en biotinylerad antikropp av leptin R hos möss (se materialförteckning) med en koncentration av 0,50 μg/106 celler. - Tvätta bort överskottet av antikroppar med 2,0 ml HBSS-0,5 % BSA och centrifugera vid 300 × g i 3 minuter.
- Ta bort supernatanten, återsuspendera pelleten i 80 μL HBSS-0.5% BSA och tillsätt 20 μL anti-biotinmikrokulor. Inkubera vid 4 °C i 10 min.
- För varje 107 celler, tillsätt 0,5 ml HBSS-0,5 % BSA och vänta tills magnetpelaren är klar.
10. Magnetisk separering, positivt urval
- Förbered stativet med separatorn och MS-kolonnen. Skölj MS-kolonnen med 0.5 ml HBSS-0.5% BSA. Vänta tills droppandet slutar.
- Placera ett 15 ml rör under kolonnen, passera 0,5 ml av cellsuspensionen genom kolonnen och samla upp eluatet som består av de icke-specifika neuronala cellerna. För att rengöra kolonnen med kvarvarande icke-specifika neuronala celler, tvätta med 3 x 0.5 ml HBSS-0.5% BSA.
- Ta bort kolonnen från magneten, placera den i ett nytt 15 ml rör och tillsätt 1.0 ml HBSS-0.5% BSA. Använd kolven för att spola ut målcellerna.
- Centrifugera båda rören med 300 × g i 3 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och återsuspendera den i 0,5 ml pläteringsmedium.
- Räkna cellerna enligt beskrivningen i avsnitt 6.
- Platta både målcellerna som den positiva kontrollen och icke-specifika celler som den negativa kontrollen vid densiteten 120 000–200 000 celler/mm3 i den 24-hålsplatta som tidigare beretts enligt beskrivningen i avsnitt 2 och inkubera vid 37 °C i 5 % CO 2 %, 9 % O2 och 95 % luftfuktighet i 12 timmar.
11. Underhåll av cellodling
- Bered 20 ml odlingsmedium med 19,2 ml neuronalt odlingsmedium, 400 μl B27-tillskott (från ett 50x-lager), 200 μL glutamin (från ett 200 μM-lager) och 100 μL penicillin/streptomycin (från ett 200x-lager).
- Byt ut pläteringsmedia från de 24 brunnarna som innehåller neuronala eller icke-neuronala celler.
- Tvätta med 2 x 1,0 ml HBSS.
- Tillsätt 1,0 ml odlingsmedia.
- Uppdatera materialet var 2:e eller 3:e dag genom att byta ut 0,5 ml gammalt material mot 0,5 ml nytt material.
OBS: Cellerna kan hållas i odling och användas i upp till 21 dagar in vitro (DIV21).
12. Neuron immunofluorescensfärgning
- Tolv timmar före färgningen bereds en lösning bestående av 50/50 metanol och aceton och svalnar vid -20 °C över natten.
- Tvätta neuronerna i 24-hålsplattan med 2 x 1,0 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i 5 minuter.
- Byt ut PBS-lösningen mot 1,0 ml 50/50-lösningen och inkubera i is i 20 minuter.
- Tvätta med 1x PBS i 3 x 5 min.
- Blockera neuronerna med 3 % BSA i 1x PBS i 1 timme vid rumstemperatur.
- Bered den primära antikroppslösningen i 3 % BSA i 1x PBS, med hjälp av den antikroppskoncentration som anges i tillverkarens anvisningar. De antikroppar och koncentrationer som används anges i materialförteckningen.
- Byt ut den blockerande lösningen mot den primära antikroppslösningen och inkubera vid 4 °C över natten.
- Tvätta cellerna i 3 x 10 min med 1x PBS.
- Bered den sekundära antikroppslösningen med 3 % BSA i 1x PBS, med hjälp av antikropparnas koncentrationer enligt tillverkarens instruktioner. De sekundära antikroppar som används listas i materialförteckningen.
- Inkubera cellerna med den sekundära antikroppslösningen vid rumstemperatur i 1 timme.
- Tvätta cellerna i 3 x 10 min med 1x PBS.
- Lämna neuronerna i 1x PBS under monteringsproceduren. Placera en liten droppe monteringsmedium (med eller utan 4',6-diamidino-2-fenylindol för nukleär identifiering) på objektglaset. Ta ut ett glastäcke som innehåller neuroner med en pincett och knacka sidan av täckglaset på en pappersduk för att torka överflödig PBS. Vänd täckglaset på monteringsmediet och se till att neuronerna är vända mot mikroskopglasen; Tryck försiktigt på och ta bort överflödigt monteringsmaterial med silkespapper.
- Objektglasen är redo att analyseras med ett ljusfält eller ett konfokalmikroskop.
Representative Results
Denna artikel beskriver ett protokoll för isolering av riktade neuroner i hypotalamus (Figur 1). Metodens syfte är att studera specifika neuronala egenskaper i en kontrollerad och isolerad kontext. Således extraherades musembryon från de dräktiga mödrarna vid E14-E16. Hjärnhinnorna avlägsnades och hypotalamus isolerades från resten av hjärnan. Vävnaden dissocierades försiktigt med två blandningar av enzymer som nyligen preparerats med hjälp av det refererade dissociationssatsen. Först separerades icke-neuronala celler från neuronala celler - glia, mikroglia och neuroner samlades i samma encellssuspension. För detta ändamål märktes icke-neuronala celler med hjälp av en cocktail av antikroppar som känner igen icke-neuronala ytepitoper. Efter inkubationen konjugerades antikroppscellkomplexet med magnetiska mikropärlor och passerade därefter genom en magnetisk pelare för att fånga de icke-neuronala cellerna.
Detta steg gav två cellsuspensioner, en innehållande icke-neuronal och den andra innehållande neuronala celler. Båda fjädringarna kunde pläteras omedelbart. Alternativt kan den neuronala cellsuspensionen manipuleras ytterligare för att separera en neuronal subpopulation (riktad suspension) från resten med samma strategi. Baserat på det intressanta experimentet kan neuronalcellerna pläteras från 125 000 till 200 000 celler/mm3. De mindre täta odlingarna kan användas för att analysera neuroner med encellsupplösning: från axonal utveckling, synaptisk bildning och överföring till elektrofysiologi. De tätare kulturerna kan användas för biokemiska analyser, inklusive DNA- och RNA-extraktion, western blot, southern blot, Northern blot, realtids-PCR och RNA-sekvensering.
I denna studie var LepR inriktad på att isolera neuroner som är involverade i melanokortinsystemet, såsom ARCPOMC- och ARCAgRP-neuroner. Cellerna pläterades med densiteter från 120 000 celler/mm3 för LepR+-neuroner till 200 000 celler/mm3 för generiska neuronala populationer. Efter 48 timmar började LepR+-neuroner bilda neuriter (Figur 2). Vid DIV4 visade axonala extensioner framsteg, medan dendritiska processer började dyka upp. Vid DIV6 var nervcellerna tillräckligt utvecklade och var därför redo att analyseras. Immunofluorescensexperiment på LepR+-neuroner visade 99 % uttryck av LepR (grönt, figur 3A). Inga gliaceller eller andra icke-neuronala celler observerades, vilket bekräftar renheten hos den primära neuronala kulturen. Cellernas neuronala natur bekräftades genom mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP2) färgning, med identifiering av axoner och dendritiska utskott (Figur 3B). Vid DIV10 uttryckte 30 % av LepR+-cellerna POMC (rött). Detta är förväntat eftersom majoriteten av LepR+-cellerna uttrycker antingen POMC eller AgRP. Figur 3C,D illustrerar samlokalisering mellan POMC- och LepR-signaler. Observera att samlokaliseringen var framträdande vid och runt kärnan, som förväntat.
Generella odlingar med heterogena hypotalamus neuronala populationer användes för kontroll. Immunofluorescens uppvisade synaptisk konnektivitet och funktionalitet, bedömd med Synapsin-1 (grön) och PSD 95 (röd) samfärgning (Figur 4A,B). Antalet LepR+-neuroner som fanns i den allmänna kulturen var ~5 %, en procentsats som överensstämmer med uppfattningen att majoriteten av LepR-uttryckande neuroner hade valts ut under den magnetiska separationsprocessen (representativa LepR+-celler illustreras i figur 4C,D). All data som genererats eller analyserats under denna studie finns tillgänglig på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c.
Figur 1: Experimentellt flödesschema och uppställning. (A) Grafisk representation av det experimentella förfarandet. Go-no-go: ≥106 celler är nödvändiga för att gå vidare till cellisolering; Det optimala celltalet är 107. (B) Representativ bild av en E16-embryohjärna. Hypotalamus och hjärnhinnor är indicerade. C) MACS-uppställning som används för separation och isolering av målceller. Magnetiskt stativ, magnetisk separator och kolonn anges. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Neuronal odling mellan DIV2 och DIV6. (A) LepR+-celler erhållna från det positiva urvalet visar minskad celltäthet och konnektivitet, men normal utveckling av neuriter (röda pilar), axoner (blå pilar) och dendriter (gröna pilar). Cellerna pläterades med en densitet av 120 000 celler/mm3. Skalstapel = 100 μm. (B) Generiska hypotalamusneuroner, pläterade med en densitet av 200 000 celler/mm3, uppvisar normala utvecklings- och tillväxtegenskaper och konnektivitet (svarta pilar). Skalstapel = 100 μm. Förkortningar: DIV = dagar in vitro; LepR = leptinreceptor. Alla data som genereras eller analyseras för att konstruera denna siffra finns tillgängliga på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: In vivo-neuroner rekapituleras av odlade LepR+-neuroner. (A) Representativa bilder av en kultur av neuroner som uttrycker LepR (grön; DAPI är blått). Nittionio procent av cellerna uttryckte LepR. Neuronerna pläterades med en densitet på 120 000 celler/mm3. Vid DIV7 uppvisade neuronerna långsträckta axoner, dendritisk mognad och neuronal konnektivitet (pilar). Skalstapel = 40 μm. (B) Immunofluorescens med anti-MAP2 användes för att bekräfta cellernas neuronala natur. Neuronalspecifika morfologier såsom axoner, dendriter och utsprång demonstreras (pilar). Skalstapel = 40 μm. (C) Förstoring av LepR+-celler. LepR i grönt och DAPI i blått. Skalstapel = 10 μm. (D) Samfärgning med LepR (grön) och POMC (röd). Ungefär 30 % av LepR+-neuronerna var co-immunreaktiva mot POMC, vilket detekterades på kärnnivå (röda pilar). Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; MAP2 = mikrotubuliassocierat protein 2; POMC = proopiomelanokortin; LepR = leptinreceptor. Alla data som genereras eller analyseras för att konstruera denna siffra finns tillgängliga på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: In vivo-celler rekapituleras av odlade generiska hypotalamusneuroner. (A) Representativa bilder av generisk hypotalamisk neuronal kultur färgad med Synapsin 1 (grön), PSD95 (röd) och DAPI (blå). Nervcellerna uppvisade välutvecklad konnektivitet och synaptisk funktionalitet (pilar). Skalstapel = 40 μm. (B) Förstoring av rutan i (A), som visar samlokalisering av Synapsin 1 (grön) och PSD95 (röd, pilar). Skalstapel = 20 μm. (C,D) Representativa bilder som visar LepR+-celler i en allmän odling. LepR+-celler (gröna) stod för ~5% av totalen. Representativa LepR+-celler indikeras med pilar. Skalstapel = 40 μm. (E,F) Förstoringar av rutorna i (C,D) som visar gröna puncta leptinreceptorer lokaliserade vid soma. Skalstapel = 20 μm. Alla data som genereras eller analyseras för att konstruera denna siffra finns tillgängliga på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Att undersöka de biokemiska och elektriska egenskaperna hos hypotalamus neuroner är nyckeln till att förstå den molekylära grunden för metabolism, termoreglering, humörhantering, ätbeteende och mer. Den neuronala heterogeniteten hos hypotalamus gör dock detta arbete utmanande, och metoder för att isolera och studera specifika hypotalamus subpopulationer behövs.
In vivo-tekniker använder CRE-rekombinas, optogenetisk, fiberfotometri och kalciumavbildning. Dessa tillvägagångssätt möjliggör främst studier av de elektriska egenskaperna hos hypotalamus neuroner, och mycket få metoder finns för närvarande tillgängliga för att undersöka deras icke-elektriska egenskaper. MACS-tekniken som utvecklats i denna studie kan ge en teknik som är mottaglig för att isolera specifika hypotalamus neuronala subpopulationer in vitro, vilket möjliggör riktade behandlingar och analyser. Neuronala kulturer är enklare att hantera jämfört med samkulturer av olika neuronala populationer. Dessutom undviker renkulturer förväxlingseffekter som härrör från närvaron av glia och mikroglia. Således kunde neuroner från samma hypotalamusregion och typ studeras som svar på specifika metaboliska och hormonella insatser.
I detta protokoll valde vi hypotalamiska neuroner som uttrycker LepR. Isolerade LepR+-celler odlades för att undersöka deras cellulära, morfologiska och molekylära egenskaper som är svåra att studera in vivo. Kulturernas renhet var 99 %, vilket stöder metodens noggrannhet. Dessutom var LepR+-cellerna friska och livskraftiga vid DIV7 fram till DIV21.
Denna teknik har dock vissa begränsningar. E18 eller äldre rena neuronkulturer är utmanande att upprätthålla. Därför är extraktionsfönstret begränsat till E14-E16. Detta innebär att cellulära förändringar som uppstår efter E16 missas. Till exempel ökar uttrycket av leptinreceptorn i ARC-neuroner under den tidiga postnatala perioden22. Proceduren för isoleringen måste utföras så snabbt som möjligt för att minska cellulär stress och död och förbättra avkastningen. Proceduren kan ta upp till 5 timmar; Därför är det viktigt att upprätthålla sterila förhållanden och minska manipulationen till ett minimum. Det positiva urvalet kan leda till låg avkastning på grund av de låga mängderna tillgänglig vävnad, vilket begränsar antalet experiment som kan utföras med ett enda preparat. Förhöjd neuronal död observerades, troligen på grund av låg celltäthet och minskad neuronal konnektivitet och intraneuronalt stöd.
Dessutom måste den antikropp som riktar sig mot antigenet av intresse binda till cellytan för att garantera en korrekt separation. Vanligtvis är antikroppar som används för flödescytometri lämpliga för MACS-tekniken. Om antikroppen inte har använts tidigare i cellseparationsmetoder behövs validerings- och titreringsexperiment för att bestämma den ideala användningen och koncentrationen. Extraktionen av målceller kräver en cellytemarkör. Här använde vi en biotinylerad antikropp men i princip kunde även antikroppar konjugerade med andra molekyler, såsom FITC (fluoresceinisotiocyanat) och PE (renat antikvariat), användas. MACS-tekniken kan också tillämpas på nervceller som uttrycker en fluorofor, såsom GFP eller ett annat Tag-protein, vilket kan öka specificiteten och utbytet. Om en fluorofor inte används skulle alternativet vara att bekräfta uttrycket av den aktuella molekylen genom immunofluorescens innan experiment med levande celler utförs. Framtida studier kommer att testa giltigheten av dessa alternativ.
En viktig aspekt som denna studie inte tog upp gäller "troheten" hos de subneuronala populationerna. Vi konstaterade att de odlade LepR+-neuronerna uttryckte POMC, vilket är en signatur för nativaARC POMC-neuroner . Fler tester kommer dock att behövas för att dra slutsatsen att LepR+ neuronala kulturer rekapitulerar sina inhemska in vivo-motsvarigheter . Sammantaget kan MACS neuronala isoleringsprotokoll som presenteras här ge en giltig och effektiv metod för att studera in vitro hypotalamusmekanismer som annars skulle vara svåra att undersöka in vivo.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Grafiska figurer skapades med BioRender.com. Detta arbete stöddes av ett NIA-anslag (R01AG060919) och ett NSF-anslag (2030348) till FS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo extraction | |||
| 1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
| 1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
| 60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Bench pads | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Cell Culture | |||
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
| Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
| Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
| Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
| Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
| Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
| Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
| MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit - Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
| Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
| Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
| Staining | |||
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
| Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
| POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
| PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
| Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
| Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
References
- Cone, R. D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nature Neuroscience. 8 (5), 571-578 (2005).
- Clarke, I. J. Hypothalamus as an endocrine organ. Comprehensive Physiology. 5 (1), 217-253 (2015).
- Mignot, E., Taheri, S., Nishino, S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. Nature Neuroscience. 5 Suppl, 1071-1075 (2002).
- Baird, A. D., Wilson, S. J., Bladin, P. F., Saling, M. M., Reutens, D. C. Neurological control of human sexual behaviour: insights from lesion studies. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (10), 1042-1049 (2007).
- Caria, A., Dall, O. G. Functional neuroimaging of human hypothalamus in socioemotional behavior: a systematic review. Brain Sciences. 12 (6), 707 (2022).
- Andermann, M. L., Lowell, B. B. Toward a wiring diagram understanding of appetite control. Neuron. 95 (4), 757-778 (2017).
- Romanov, R. A., Alpar, A., Hokfelt, T., Harkany, T. Unified classification of molecular, network, and endocrine features of hypothalamic neurons. Annual Review of Neuroscience. 42, 1-26 (2019).
- Hajdarovic, K. H., Yu, D., Webb, A. E. Understanding the aging hypothalamus, one cell at a time. Trends in Neurosciences. 45 (12), 942-954 (2022).
- Zhang, Y. H., et al. Cascade diversification directs generation of neuronal diversity in the hypothalamus. Cell Stem Cell. 28 (8), 1483-1499 (2021).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-cell RNA-seq reveals hypothalamic cell diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Ma, C., et al. Neural pathways from hypothalamic orexin neurons to the ventrolateral preoptic area mediate sleep impairments induced by conditioned fear. Frontiers in Neuroscience. 17, 1122803 (2023).
- Wang, F., et al. A parabrachial to hypothalamic pathway mediates defensive behavior. Elife. 12, e85450 (2023).
- Cowley, M. A., et al. Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature. 411 (6836), 480-484 (2001).
- Parekh, R. U., et al. Hypothalamic kinin B1 receptor mediates orexin system hyperactivity in neurogenic hypertension. Scientific Reports. 11 (1), 21050 (2021).
- Schmidt, C. X., Tsang, A. H., Oster, H. Generation of mouse primary hypothalamic neuronal cultures for circadian bioluminescence assays. Bio-protocol. 11 (5), e3944 (2021).
- Foo, L. C. Purification of rat and mouse astrocytes by immunopanning. 2013 (5), Cold Spring Harbor Protocols. 421-432 (2013).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. 2013 (9), Cold Spring Harbor Protocols. 854-868 (2013).
- Zhao, H., et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea. International Journal of Molecular Sciences. 12 (3), 1862-1875 (2011).
- Zhang, Z. M., et al. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chinese Medical Journal. 124 (12), 1813-1817 (2011).
- Drake, S. S., Zaman, A., Simas, T., Fournier, A. E. Comparing RNA-sequencing datasets from astrocytes, oligodendrocytes, and microglia in multiple sclerosis identifies novel dysregulated genes relevant to inflammation and myelination. WIREs Mechanisms of Disease. 15 (2), e1594 (2023).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Cottrell, E. C., et al. Developmental changes in hypothalamic leptin receptor: relationship with the postnatal leptin surge and energy balance neuropeptides in the postnatal rat. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296 (3), R631-R639 (2009).
