Summary
Her presenterer vi en protokoll for å dyrke spesifikke hypotalamiske cellesubtyper i kultur. Cellene kan velges basert på hensiktsmessige / unike membranmarkører og brukes i mange applikasjoner, inkludert immunfluorescens, elektrofysiologiske og biokjemiske analyser.
Abstract
Hypothalamus regulerer grunnleggende metabolske prosesser ved å kontrollere funksjoner så varierte som matinntak, kroppstemperatur og hormonfrigivelse. Siden funksjonene til hypothalamus styres av spesifikke delmengder av nevronpopulasjoner, gir evnen til å isolere dem et viktig verktøy for å studere metabolske mekanismer. I denne forbindelse utgjør hypothalamus nevronale kompleksitet eksepsjonelle utfordringer.
Av disse grunner har nye teknikker, som magnetisk-aktivert cellesortering (MACS), blitt utforsket. Dette papiret beskriver en ny anvendelse av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) ved hjelp av mikroperleteknologi for å isolere en målrettet nevronpopulasjon fra prenatale mushjerner. Teknikken er enkel og garanterer en svært ren og levedyktig primær hypotalamisk nevronkultur med høy reproduserbarhet. Hypothalamus dissosieres forsiktig, nevroner isoleres selektivt og separeres fra glialceller, og til slutt, ved bruk av et spesifikt antistoff for en celleoverflatemarkør, velges populasjonen av interesse.
Når de er isolert, kan målrettede nevroner brukes til å undersøke deres morfologiske, elektriske og endokrine egenskaper og deres responser under normale eller patologiske forhold. Videre, gitt hypothalamusens varierte roller i regulering av fôring, metabolisme, stress, søvn og motivasjon, kan en nærmere titt på målrettede og regionspesifikke nevroner gi innsikt i deres oppgaver i dette komplekse miljøet.
Introduction
Hypothalamus er et flerdelt område av hjernen som formidler endokrine, autonome, viscerale og atferdsfunksjoner, inkludert fôring, metabolisme, søvn, kroppstemperatur, sosial atferd og sexlyst 1,2,3,4,5. Funksjonell heterogenitet oppnås ved en synergistisk kombinasjon av biokjemiske og elektriske mekanismer: hypotalamiske nevroner brannaksjonspotensialer og utskiller og frigjør hormoner og nevropeptider for å modulere hjernegrupper og organer i kroppen. Til slutt oversetter hypotalamiske nevroner homeostatiske meldinger fra kroppen, reagerer med langsiktig og kortsiktig tilbakemelding og feedforward-forskrifter6.
Det komplekse nevronmiljøet i hypothalamus inkluderer magnocellulære endokrine nevroner, frigjør oksytocin og vasopressin; parvocellulære nevroner, primært involvert i den systemiske hormonelle reguleringen, frigjør for eksempel tyrotropinfrigivelseshormon (TRH) og kortikotropinfrigivelseshormon (CRH) til hypofysen; store peptiderge projeksjonsneuroner, frigjør oreksin og melaninkonsentrerende hormon (MCH); og parvocellulære peptiderge nevroner i Arcuate Nucleus (ARC) som frigjør POMC (proopiomelanocortin) og AgRP (agouti-relatert protein), kalt henholdsvis ARCPOMC og ARCAgRP. Sammen med sekretoriske celler er andre eksitatoriske og hemmende nevroner, inkludert dopaminerge, glutaminerge og GABAerge nevroner 7, involvert i å danne intrahypotalamiske og ekstrahypotalamiske kretser, og derved skape storskala koordinerte nettverk med betydelig cellulær heterogenitet8.
Hypothalamus mangfold har vært en utfordring som forskere har forsøkt å overvinne de siste 50 årene. For å studere denne heterogeniteten i utviklende, modne og aldrende hypotalami har etterforskere på den ene side benyttet enkeltcelle RNA-sekvensering for å utforske nevronorganisasjon, samt molekylære og transkriptomiske signaturer. Denne innsatsen har gitt et innsiktsfullt innblikk i de varierte rollene til hypotalamiske nevroner og har adressert forbindelser mellom cellulær identitet og dens mulige rolle i det fysiologiske systemet 8,9,10. På den annen side har nevronfunksjoner blitt undersøkt ved optogenetiske manipulasjoner og fiberfotometri atferdsmessige tilnærminger, noe som gir en nærmere titt på kretsstrukturen. I løpet av de siste to tiårene har Cre-recombinase-teknologien gjort det mulig for forskere å ontogenetisk stimulere eller hemme en målrettet gruppe nevroner mens de observerer endringer i atferd og kroppsresponser 6,11,12.
Imidlertid undersøker disse tilnærmingene hypotalamiske funksjoner fra et generelt perspektiv uten å dykke dypere inn i de spesifikke cellulære mekanismene eller det biologiske grunnlaget for deres rolle i det komplekse hypotalamiske miljøet. For å løse dette har svært få studier fokusert på å undersøke molekylære, biokjemiske og elektriske egenskaper ved hjelp av heterogene primære hypotalamiske kulturer. Disse studiene forsøkte å dissekere spesifikke nevronprosesser i et komplekst miljø og genererte integrerende modeller av fysiologiske mekanismer13,14,15. Likevel utgjør uspesifikke kulturer betydelige utfordringer. For eksempel blir nevronenes fysiologiske tilkobling og anatomiske fordeling forstyrret av plating nevroner fra forskjellige hypotalamiske regioner som normalt ikke ville interagere, noe som skaper forvirrende effekter. I tillegg har hver region forskjellige roller og varierte nevronpopulasjoner, noe som gjør det vanskelig å studere enkle biologiske prosesser.
For å møte disse utfordringene har det i det siste tiåret blitt implementert nye tilnærminger for å isolere nevroner av interesse, for eksempel immunopanning, fluorescent-aktivert cellesortering (FACS) og magnetisk-aktivert cellesortering (MACS). Immunopanning er en strategi som brukes til å rense målrettede celler ved hjelp av antistoffbelagte retter for en rekke ikke-neuronale (negative) og neuronale (positive) seleksjoner. Selv om denne teknikken i prinsippet kan generere rensede cellekulturer med høy avkastning, brukes den i praksis mest til astrocytter og oligodendrocytter, siden disse cellene kan motstå timer med manipulasjon16,17. FACS-teknologi er et kraftig verktøy for å sortere celler basert på fluorescerende markører og cellulære egenskaper ved hjelp av flowcytometri18,19,20. Imidlertid brukte svært få studier denne metoden for å isolere celler for cellekultur. Teknikken er dyr og krever høyt kvalifisert personell til å bruke og vedlikeholde; I tillegg er det utfordrende å opprettholde levedyktige og sterile celler ved slutten av sorteringsprosedyren21. Samlet sett ser MACS ut til å være en enkel, ikke-kostbar teknikk for å oppnå svært rene og levedyktige kulturer av hypotalamiske primære nevroner. Metoden benytter magnetiske perler koblet til cellene via et antistoff. Dette gjør at cellene kan isoleres ved hjelp av magnetfeltet i kolonnen.
Her beskriver vi en metode basert på MACS-teknologi, som vanligvis brukes med kortikale nevroner. Denne protokollen gjør det mulig å isolere, i prinsippet, levedyktige og svært rene hypotalamiske nevroner. I denne studien forbereder vi primære kulturer av nevroner som uttrykker Leptin Receptor (LepR), som ARCPOMC og ARCAgRP nevroner, som bare er tilstede i Arcuate Nucleus. Disse nevronene reagerer på leptin, et anoreksigent hormon som utskilles av fettvevet, på biokjemiske og elektriske måter. Derfor tillater isoleringen av denne gruppen av nevroner i kultur studier av deres hormonelle, metabolske og elektriske egenskaper in vitro.
Protocol
MERK: En generell oversikt over den eksperimentelle prosedyren er grafisk illustrert i figur 1A. Alle eksperimenter med mus utført i denne studien ble godkjent av vår institusjons Animal Care and Use Committee (IACUC). Vi brukte 3 måneder gamle C57BL6 / J-mus, som ble plassert i en forening for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC) -godkjent vivarium, under omsorg av en veterinær. Musene levde i store bur, med en 12 timers lys-mørk syklus, og ble matet ad libitum.
1. Conception og graviditetsbekreftelse
- Plasser mus av hvilken som helst bakgrunn og genotype av interesse for avl. Registrer datoen og vekten av kvinnen før unnfangelsen.
- Etter 6 timer, inspiser kvinnen for en plakett med en sonde. Hvis plakkene er til stede, skille kvinnen fra hannen. Hvis plakkene ikke er til stede, hold kvinnen i buret til neste dag, og skill deretter musene.
- På dagene 7, 10 og 14 etter unnfangelsen, veier kvinnen for å bekrefte graviditet.
2. Media, 24-brønns plate og materialforberedelse
- På dagen for celleisolering, plasser, klar til bruk, poly-D-lysinbelagt glassdeksel (se materialfortegnelse) i en 24-brønnplate som følger:
- Under en biologisk hette, steriliser en enkelt pakke som inneholder 15 coverslips med 70% etanol og la tørke. Åpne pakningen og legg dekslene i en 60 mm plate. Rist platen horisontalt for å skille dekslene. Deretter snur du platen for å plukke opp enkle deksler som skal plasseres i brønnene på en 24-brønnsplate.
- Vask dekslene én gang med 1,0 ml steril Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) i 5 minutter.
- I mellomtiden må du forberede 20,0 ml pletteringsmedier som følger: til 18,31 ml BME (Basal Medium Eagle, + Earle's Salts), supplert med 1,0 ml varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS), tilsett 200 μL natriumpyruvat (fra en 100x lager), 200 μL glutamin (fra en 200 nM-lager) og 100 μL penicillin / streptomycin (fra en 200x lager).
- Bytt ut HBSS i brønnene med 1,0 ml pletteringsmedier og plasser platen i inkubatoren ved 37 °C.
- Bruk en Bunsen-brenner til å polere tre Pasteur-pipetter i minkende diametre. Hold pipeten med en hånd, sett spissen inn i flammen og fjern den raskt. Gjenta prosessen til spissen blir jevnere og diameteren reduseres til ønsket diameter (vurderes med øyet).
3. Reagensforberedelse for nevralvevsdissosiasjon, etter instruksjonene i Neural Dissociation-settet
- Etter oppvarming av fordøyelsesbufferen 1 ved romtemperatur, tilbered Enzyme Mix 1 ved å blande 50 μL enzym 1 med 1,91 ml buffer 1 og enzymblanding 2 ved å blande 15 μL enzym 2 med 30 μL fordøyelsesbuffer 2. Blandingene er nok til å brukes til alle embryoers hjernevev.
- Forbered 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i HBSS, for eksempel 0,25 g i 50,0 ml HBSS.
4. Embryo ekstraksjon
- Autoklav to rette fine tanger, en buet punkttang og ett par fin kirurgisk saks og steriliser dem med 70% etanol før bruk. Fyll deretter petriskålene med HBSS.
- Avlive en E14-E16 graviddam i CO2 -kammeret og utføre cervikal dislokasjon.
MERK: Følgende trinn må utføres under hetten under sterile forhold: - Steriliser magen med 70% etanol. Klipp opp bukhulen fra kjønnssymfysen til xiphoidprosessen i ribbeholderen med kirurgisk saks og tang.
- Trekk ut livmorhornet og legg det i en 100 mm tallerken fylt med iskald HBSS og vask grundig.
- Trekk ut og separer alle embryoer fra livmoren med fine tang. Halshugg embryoene raskt med fin kirurgisk saks og/eller tang. Legg hodene i 60 mm petriskålen fylt med HBSS.
5. Hypothalamus ekstraksjon, samling, og vev dissosiasjon
- Plasser en fin tang i øyehulen for å holde hjernen. Bruk de andre fine tangene, fjern huden og skallen ved å skrelle til hjernen er synlig. Distinguish hjernen fra andre vev basert på sitt hvite utseende. Hud og hodeskalle er rosa og rik på vaskulatur.
- Fjern hjernen fra skallen ved å bruke de buede punkttangene og øs ut hjernen fra olfaktoriske pærer, snu den opp ned.
- Nå er cortex ventral, og hypothalamus er synlig dorsalt på overkroppen (figur 1B). Med de buede tangene, fjern laget av hjernehinner og blodkar til hjernen ser hvit og klar ut.
- Med de buede tangene, skille det hypotalamiske området fra resten av hjernen.
- Skjær hypothalamus i 3-4 små biter og overfør bitene til et 15 ml rør med en pipette.
- Gjenta trinnene for de andre embryoene mens røret er på is.
- Fyll tuben med 6,0 ml HBSS og la vevet sette seg, fjern supernatanten og tilsett Enzyme Mix 1. Bland forsiktig og beveg røret for å forhindre vevet.
- Bikk slangen i et vannbad på 37 °C i 15 minutter og beveg vevet hvert 5. minutt for å resuspendere vevet.
- Etter 15 min, tilsett 30 μL enzymblanding 2. Dissosiere hjernevevet ved å bruke pipetten Pasteur med størst diameter (<1 mm). Pipet opp og ned 10x uten å danne bobler.
- Inkuber i 10 minutter ved 37 °C i vannbadet. Rist forsiktig på røret for å resuspendere vevet hvert 5. minutt.
- Etter 10 minutter, tilsett de resterende 15 μL enzymblanding 2. Dissosiere vevet 10x med de to andre brannpolerte pipettene med avtagende diameter, opp og ned uten å danne bobler.
- Til røret med det dissosierte vevet, tilsett umiddelbart 10,0 ml HBSS-0,5% BSA og sentrifuge ved 300 × g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 1,0 ml HBS-0,5% BSA.
6. Cell telling
- Fortynn cellesuspensjonen 1:5 med HBSS-0,5 % BSA.
- Plasser 10 μL av den fortynnede cellesuspensjonen i et Neubauer tellekammer.
- Under et lysfeltmikroskop teller du bare cellene som er i hjørnefirkantene i de fire kammerene. Beregn gjennomsnittet og multipliser med 5 × 104.
MERK: Forsikre deg om at det er >106 celler for å fortsette til celleisolasjon; Det optimale celletallet er 107.
7. Negativt utvalg
MERK: Negativt utvalg gjør det mulig for brukere å oppnå en ren primær nevronkultur ved å separere nevrale og ikke-nevronale celler. Bruk forkjølte løsninger.
- Sentrifuge cellesuspensjonen ved 300 × g i 3 minutter (sentrifugering kan forlenges opptil 10 minutter). Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender pelleten til en konsentrasjon på 107 celler i 80 μL HBSS-0,5% BSA.
- Tilsett 20 μL ikke-nevroncelle biotin-antistoffcocktail og inkuber i 5 minutter ved 4 °C.
- Vask cellene for å fjerne fritt antistoff med 2,0 ml HBSS-0,5% BSA og sentrifuge ved 300 × g i 3 minutter.
- Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender pelleten i 80 mikrol HBSS-0,5 % BSA. Tilsett 20 μL anti-biotin mikroperler, bland godt og inkuber i 10 minutter ved 4 °C.
- Tilsett 0,5 ml HBSS-0,5% BSA for opptil 107 celler og vent til magnetkolonnen er klar.
8. Magnetisk separasjon, negativt utvalg
MERK: Magnetisk separasjon er et avgjørende skritt som tillater separasjon av de ikke-nevronale cellene fra nevroncellene. Prøven som inneholder nevronale og ikke-nevronale celler føres gjennom magnetfeltet, og de ikke-nevronale cellene, som er bundet til et biotin-antistoff-magnetisk perlekompleks, fanges i kolonnen (figur 1C). De frie nevroncellene elueres gjennom kolonnen og samles i et 15 ml rør.
- Forbered stativet (inkludert i settet) med skilletegnet og MS-kolonnen som vist i figur 1C.
- Åpne kolonnen og sett opp stativet bare når cellene er klare til å skilles.
- Skyll kolonnen med 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Vent til løsningen slutter å dryppe.
- For å samle nevronceller, plasser et 15 ml rør under kolonnen og pass 0,5 ml av cellesuspensjonen gjennom kolonnen. Samle eluatet i røret til det slutter å dryppe. For å fange gjenværende nevronceller, vask kolonnen 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
- For å samle ikke-nevronale celler, fjern kolonnen fra magneten og plasser den inne i et nytt 15 ml rør. Legg til 1,0 ml HBSS - 0,5% BSA til kolonnen og bruk stempelet til å samle de magnetisk merkede ikke-nevronale cellene.
- Sentrifuge nevronale og ikke-nevronale celler ved 300 × g i 3 minutter. Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender cellene i 1,0 ml HBSS-0,5 % BSA. Tell cellene som beskrevet tidligere i avsnitt 6.
- Om nødvendig, plate de ikke-nevronale cellene i en 24-brønnsplate; Kast dem ellers.
9. Positivt utvalg
MERK: Når en ren nevroncellesuspensjon er oppnådd, utføres positivt utvalg for å isolere de målrettede cellene. Celler kan isoleres ved å bruke et spesifikt biotinkonjugert antistoff for et overflateantigen. Antistoffet gjenkjennes av anti-biotin magnetiske perler. Ved å strømme cellesuspensjonen gjennom kolonnen, blir bare cellene av interesse fanget i magnetfeltet.
- Sentrifuge den rene nevroncellesuspensjonen ved 300 × g i 3 minutter. Aspirer supernatanten forsiktig og resuspender pelleten i 80 mikrol HBSS-0,5 % BSA. Tilsett det spesifikke antistoffet i henhold til produsentens instruksjoner og inkuber ved 4 °C i 10 minutter.
MERK: Hvis celler som uttrykker LepR er søkt, foreslår vi en mus Leptin R biotinylert antistoff (se tabell over materialer) i en konsentrasjon på 0,50 μg/106 celler. - Vask av overflødig antistoff med 2,0 ml HBSS-0,5% BSA og sentrifuge ved 300 × g i 3 minutter.
- Fjern supernatanten, resuspender pelleten i 80 μL HBSS-0,5% BSA, og tilsett 20 μL anti-biotinmikroperler. Inkuber ved 4 °C i 10 minutter.
- For hver 107 celler, legg til 0,5 ml HBSS-0,5% BSA og vent til magnetkolonnen er klar.
10. Magnetisk separasjon, positivt utvalg
- Forbered stativet med separatoren og MS-kolonnen. Skyll MS-kolonnen med 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Vent til dryppingen stopper.
- Plasser et 15 ml rør under kolonnen, pass 0,5 ml av cellesuspensjonen gjennom kolonnen, og samle eluatet som omfatter de ikke-spesifikke nevroncellene. For å rengjøre kolonnen av gjenværende ikke-spesifikke nevronceller, vask med 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
- Fjern kolonnen fra magneten, plasser den i et nytt 15 ml rør, og tilsett 1,0 ml HBSS-0,5% BSA. Bruk stempelet til å skylle ut de målrettede cellene.
- Sentrifuge begge rørene ved 300 × g i 3 minutter. Fjern supernatanten forsiktig og oppløs den i 0,5 ml pletteringsmedium.
- Tell cellene som tidligere beskrevet i avsnitt 6.
- Plate både målrettede celler som den positive kontrollen og ikke-spesifikke celler som den negative kontrollen ved 120.000-200.000 celler / mm3 tetthet i 24-brønnplaten som tidligere ble fremstilt som beskrevet i avsnitt 2 og inkubere ved 37 ° C i 5% CO 2, 9% O2 og 95% fuktighet i 12 timer.
11. Vedlikehold av cellekultur
- Forbered 20 ml kulturmedium med 19,2 ml Neuronal Culture Medium, 400 μL B27-tilskudd (fra en 50x lager), 200 μL glutamin (fra en 200 μM-stam) og 100 μL penicillin / streptomycin (fra en 200x lager).
- Bytt ut pletteringsmedier fra de 24 brønnplatene som inneholder nevrale eller ikke-nevronale celler.
- Vask med 2 x 1,0 ml HBSS.
- Legg til 1,0 ml kulturmedier.
- Oppdater mediet hver 2/3 dag ved å erstatte 0,5 ml gamle medier med 0,5 ml nye medier.
MERK: Celler kan opprettholdes i kultur og brukes i opptil 21 dager in vitro (DIV21).
12. Neuron immunfluorescens farging
- Tolv timer før fargingen, lag en oppløsning bestående av 50/50 metanol og aceton og avkjøl den ved -20 °C over natten.
- Vask nevronene i 24-brønnsplaten med 2 x 1,0 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i 5 minutter.
- Erstatt PBS-oppløsningen med 1,0 ml av 50/50-løsningen og inkuber i is i 20 minutter.
- Vask med 1x PBS i 3 x 5 min.
- Blokker nevronene med 3% BSA i 1x PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Forbered den primære antistoffoppløsningen i 3% BSA i 1x PBS, ved bruk av antistoffkonsentrasjonen nevnt i produsentens instruksjoner. Antistoffene og konsentrasjonene som brukes er oppført i materialfortegnelsen.
- Erstatt den blokkerende oppløsningen med den primære antistoffoppløsningen og inkuber ved 4 °C over natten.
- Vask cellene i 3 x 10 min med 1x PBS.
- Forbered den sekundære antistoffoppløsningen med 3% BSA i 1x PBS, ved hjelp av konsentrasjonene av antistoffene i henhold til produsentens instruksjoner. De sekundære antistoffene som brukes er oppført i materialfortegnelsen.
- Inkuber cellene med den sekundære antistoffoppløsningen ved romtemperatur i 1 time.
- Vask cellene i 3 x 10 min med 1x PBS.
- La nevronene ligge i 1x PBS under monteringsprosedyren. Plasser en liten dråpe monteringsmedium (med eller uten 4',6-diamidino-2-fenylindol for nukleær identifikasjon) på mikroskoplysbildet. Trekk ut ett glassdeksel som inneholder nevroner med tang og trykk på siden av dekselet på et papirvev for å tørke overflødig PBS. Vend dekselet på monteringsmediet, og sørg for at nevronene vender mot mikroskoplysbildene; Trykk og fjern det overflødige monteringsmediet forsiktig med silkepapir.
- Mikroskoplysbildene er klare til å bli analysert med et lysfelt eller et konfokalmikroskop.
Representative Results
Denne artikkelen beskriver en protokoll for isolering av målrettede nevroner i hypothalamus (figur 1). Omfanget av metoden er å studere spesifikke nevronegenskaper i en kontrollert og isolert sammenheng. Dermed ble museembryoer hentet fra de gravide dammene ved E14-E16. Hjernehinnene ble fjernet, og hypothalamus ble isolert fra resten av hjernen. Vevet ble forsiktig dissosiert med to blandinger av enzymer ferskt tilberedt ved hjelp av det refererte dissosiasjonssettet. Først ble ikke-neuronale celler skilt fra nevronceller-glia, mikroglia og nevroner ble samlet i samme enkeltcellesuspensjon. Til dette formål ble ikke-neuronale celler merket ved hjelp av en cocktail av antistoffer som gjenkjenner ikke-neuronale overflateepitoper. Etter inkubering ble antistoffcellekomplekset konjugert med magnetiske mikroperler og deretter passert gjennom en magnetisk kolonne for å fange de ikke-nevronale cellene.
Dette trinnet ga to cellesuspensjoner, en som inneholdt ikke-nevronale og den andre inneholdt nevronceller. Begge suspensjonene kunne belegges umiddelbart. Alternativt kan nevroncellesuspensjonen manipuleres ytterligere for å skille en nevronal subpopulasjon (målrettet suspensjon) fra resten ved hjelp av samme strategi. Basert på eksperimentet av interesse, kan nevroncellene bli belagt fra 125.000 til 200.000 celler / mm3. De mindre tette kulturer kan brukes til å analysere nevroner ved enkeltcelleoppløsning: fra aksonal utvikling, synaptisk dannelse og overføring til elektrofysiologi. De tettere kulturene kan brukes til biokjemiske analyser, inkludert DNA- og RNA-ekstraksjon, western blot, Southern blot, Northern blot, real-time PCR og RNA-sekvensering.
I denne studien ble LepR målrettet for å isolere nevroner involvert i melanokortinsystemet, som ARCPOMC og ARCAgRP nevroner. Celler ble belagt med tettheter fra 120 000 celler / mm 3, for LepR + nevroner, til 200 000 celler / mm3 for generiske nevronpopulasjoner. Etter 48 timer begynte LepR+-nevroner å danne nevritter (figur 2). Ved DIV4 viste aksonale utvidelser fremgang, mens dendritiske prosesser begynte å vises. Ved DIV6 var nevronene tilstrekkelig utviklet og var derfor klare til å bli analysert. Immunfluorescenseksperimenter på LepR+-nevroner viste 99 % ekspresjon av LepR (grønn, figur 3A). Ingen gliaceller eller andre ikke-neuronale celler ble observert, noe som bekreftet renheten til den primære nevronkulturen. Cellens nevronale natur ble bekreftet ved mikrotubuli-assosiert protein 2 (MAP2) farging, med identifisering av aksoner og dendritiske fremspring (figur 3B). Ved DIV10 uttrykte 30 % av LepR+-cellene POMC (rød). Dette forventes ettersom flertallet av LepR + -celler uttrykker enten POMC eller AgRP. Figur 3C,D illustrerer samlokalisering mellom POMC- og LepR-signaler. Merk at samlokaliseringen var fremtredende ved og rundt kjernen, som forventet.
Generelle kulturer som inneholder heterogene hypotalamiske nevronpopulasjoner ble brukt til kontroll. Immunfluorescens viste synaptisk tilkobling og funksjonalitet, vurdert ved synapsin-1 (grønn) og PSD 95 (rød) co-farging (figur 4A,B). Antallet LepR + nevroner tilstede i den generelle kulturen var ~ 5%, en prosentandel i samsvar med forestillingen om at flertallet av LepR-uttrykkende nevroner hadde blitt valgt under den magnetiske separasjonsprosessen (representative LepR + -celler er illustrert i figur 4C, D). Alle data generert eller analysert i løpet av denne studien er tilgjengelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c.
Figur 1: Eksperimentelt flytskjema og oppsett . (A) Grafisk fremstilling av eksperimentell prosedyre. Go-no-go: ≥106 celler er nødvendige for å fortsette til celleisolasjon; Det optimale celletallet er 107. (B) Representativt bilde av en E16 embryohjerne. Hypothalamus og meninges er indikert. (C) MACS-oppsett som brukes til separasjon og isolering av målrettede celler. Magnetisk stativ, magnetisk separator og kolonne er indikert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nevrondyrkning mellom DIV2 og DIV6. (A) LepR + -celler oppnådd fra det positive utvalget viser redusert celletetthet og tilkobling, men normal utvikling av nevritter (røde piler), aksoner (blå piler) og dendritter (grønne piler). Cellene ble belagt med en tetthet på 120 000 celler/mm3. Skala bar = 100 μm. (B) Generiske hypotalamiske nevroner, belagt med en tetthet på 200 000 celler / mm3, viser normale utviklings- og vekstfunksjoner og tilkobling (svarte piler). Skala bar = 100 μm. Forkortelser: DIV = dager in vitro; LepR = leptinreseptor. Alle data generert eller analysert for å konstruere dette tallet er tilgjengelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: In vivo nevroner rekapituleres av dyrkede LepR+-nevroner. (A) Representative bilder av en kultur av nevroner som uttrykker LepR (grønn; DAPI er blå). Nitti-ni prosent av cellene uttrykte LepR. Nevroner ble belagt med 120 000 celler/mm3 tetthet. Ved DIV7 presenterte nevronene langstrakte aksoner, dendritisk modning og nevronal tilkobling (piler). Skala bar = 40 μm. (B) Immunfluorescens med anti-MAP2 ble brukt til å bekrefte cellens nevronale natur. Nevronspesifikke morfologier som aksoner, dendritter og fremspring er demonstrert (piler). Skala bar = 40 μm. (C) Forstørrelse av LepR + celler. LepR i grønt og DAPI i blått. Skala bar = 10 μm. (D) Co-farging med LepR (grønn) og POMC (rød). Omtrent 30% av LepR + nevroner var co-immunoreaktive til POMC, som ble detektert på nivået av kjernen (røde piler). Skala bar = 10 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; MAP2 = mikrotubuli-assosiert protein 2; POMC = proopiomelanokortin; LepR = leptinreseptor. Alle data generert eller analysert for å konstruere dette tallet er tilgjengelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: In vivo-celler rekapituleres av dyrkede generiske hypotalamiske nevroner. (A) Representative bilder av generisk hypotalamisk nevronkultur farget med Synapsin 1 (grønn), PSD95 (rød) og DAPI (blå). Nevronene viste velutviklet tilkobling og synaptisk funksjonalitet (piler). Skala bar = 40 μm. (B) Forstørrelse av boksen i (A), som viser samlokalisering av Synapsin 1 (grønn) og PSD95 (rød, piler). Skala bar = 20 μm. (C,D) Representative bilder som viser LepR+-celler i en generell kultur. LepR + celler (grønn) utgjorde ~ 5% av totalen. Representative LepR+-celler er angitt med piler. Skala bar = 40 μm. (E,F) Forstørrelser av boksene i (C,D) som viser grønne puncta leptinreseptorer lokalisert ved soma. Skala bar = 20 μm. Alle data generert eller analysert for å konstruere dette tallet er tilgjengelige på https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Undersøkelse av de biokjemiske og elektriske egenskapene til hypotalamiske nevroner er nøkkelen til å forstå det molekylære grunnlaget for metabolisme, termoregulering, humørstyring, fôringsadferd og mer. Imidlertid gjør hypothalamus nevronale heterogenitet denne innsatsen utfordrende, og metoder for å isolere og studere spesifikke hypotalamiske underpopulasjoner er nødvendig.
In vivo teknikker benytter CRE-rekombinase, optogenetisk, fiberfotometri og kalsiumavbildning. Disse tilnærmingene tillater primært studier av de elektriske egenskapene til hypotalamiske nevroner, og svært få metoder er for tiden tilgjengelige for å undersøke deres ikke-elektriske egenskaper. MACS-teknologien utviklet i denne studien kan gi en teknikk som er egnet til å isolere spesifikke hypotalamiske nevronale subpopulasjoner in vitro, og dermed gi målrettede behandlinger og analyser. Nevrale kulturer er enklere å håndtere sammenlignet med samkulturer av forskjellige nevronpopulasjoner. I tillegg unngår rene kulturer forvirrende effekter som stammer fra tilstedeværelsen av glia og mikroglia. Dermed kan nevroner fra samme hypotalamiske region og type studeres som respons på spesifikke metabolske og hormonelle innganger.
I denne protokollen valgte vi hypotalamiske nevroner som uttrykker LepR. Isolerte LepR + -celler ble dyrket for å undersøke deres cellulære, morfologiske, og molekylære egenskaper som er vanskelige å studere in vivo. Kulturens renhet var 99%, noe som støtter nøyaktigheten av metoden. I tillegg var LepR + -cellene sunne og levedyktige ved DIV7 til DIV21.
Denne teknikken har imidlertid noen begrensninger. E18 eller eldre rene nevronkulturer er utfordrende å vedlikeholde. Derfor er utvinningsvinduet begrenset til E14-E16. Dette innebærer at celleforandringer som oppstår etter E16 blir oversett. For eksempel øker ekspresjonen av leptinreseptoren i ARC-nevroner i den tidlige postnatalperioden22. Prosedyren for isolasjonen må utføres så raskt som mulig for å redusere cellulær stress og død og forbedre utbyttet. Prosedyren kan ta opptil 5 timer; Derfor er det viktig å opprettholde sterile forhold og redusere manipulering til det minimum som er nødvendig. Det positive utvalget kan føre til lavt utbytte på grunn av de lave mengdene tilgjengelig vev, og begrense antall eksperimenter som kan utføres med et enkelt preparat. Forhøyet nevrondød ble observert, sannsynligvis på grunn av lav celletetthet og redusert nevronal tilkobling og intranevronal støtte.
Videre må antistoffet rettet mot antigenet av interesse binde seg til celleoverflaten for å garantere en korrekt separasjon; vanligvis er antistoffer som brukes til flowcytometri egnet for MACS-teknikken. Hvis antistoffet ikke har blitt brukt før i celleseparasjonsmetoder, er det nødvendig med validerings- og titreringseksperimenter for å bestemme den ideelle bruken og konsentrasjonen. Ekstraksjonen av målrettede celler krever en celleoverflatemarkør. Her brukte vi et biotinylert antistoff, men i prinsippet kunne antistoffer konjugert med andre molekyler, som FITC (fluoresceinisotiocyanat) og PE (renset antifykoerytrin), også brukes. MACS-teknologi kan også brukes på nevroner som uttrykker en fluorofor, for eksempel GFP eller et annet Tag-protein, noe som potensielt øker spesifisiteten og utbyttet. Hvis en fluorofor ikke er anvendt, ville alternativet være å bekrefte uttrykket av molekylet av interesse ved immunfluorescens før du utfører levende celleforsøk. Fremtidige studier vil teste gyldigheten av disse alternativene.
Et viktig aspekt som denne studien ikke adresserte, gjelder "troskap" av de subneuronale populasjonene. Vi konstaterte at de dyrkede LepR + -nevronene uttrykte POMC, som er en signatur av innfødte ARCPOMC-nevroner . Imidlertid vil flere tester være nødvendige for å konkludere med at LepR + nevronkulturer rekapitulerer deres opprinnelige in vivo-kolleger . Samlet sett kan MACS neuronal isolasjonsprotokoll presentert her gi en gyldig og effektiv metode for å studere in vitro hypotalamiske mekanismer som ellers ville være vanskelig å undersøke in vivo.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Grafiske figurer ble laget med BioRender.com. Dette arbeidet ble støttet av et NIA-stipend (R01AG060919) og et NSF-stipend (2030348) til FS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo extraction | |||
| 1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
| 1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
| 60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Bench pads | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Cell Culture | |||
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
| Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
| Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
| Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
| Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
| Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
| Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
| MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit - Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
| Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
| Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
| Staining | |||
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
| Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
| POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
| PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
| Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
| Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
References
- Cone, R. D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nature Neuroscience. 8 (5), 571-578 (2005).
- Clarke, I. J. Hypothalamus as an endocrine organ. Comprehensive Physiology. 5 (1), 217-253 (2015).
- Mignot, E., Taheri, S., Nishino, S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. Nature Neuroscience. 5 Suppl, 1071-1075 (2002).
- Baird, A. D., Wilson, S. J., Bladin, P. F., Saling, M. M., Reutens, D. C. Neurological control of human sexual behaviour: insights from lesion studies. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (10), 1042-1049 (2007).
- Caria, A., Dall, O. G. Functional neuroimaging of human hypothalamus in socioemotional behavior: a systematic review. Brain Sciences. 12 (6), 707 (2022).
- Andermann, M. L., Lowell, B. B. Toward a wiring diagram understanding of appetite control. Neuron. 95 (4), 757-778 (2017).
- Romanov, R. A., Alpar, A., Hokfelt, T., Harkany, T. Unified classification of molecular, network, and endocrine features of hypothalamic neurons. Annual Review of Neuroscience. 42, 1-26 (2019).
- Hajdarovic, K. H., Yu, D., Webb, A. E. Understanding the aging hypothalamus, one cell at a time. Trends in Neurosciences. 45 (12), 942-954 (2022).
- Zhang, Y. H., et al. Cascade diversification directs generation of neuronal diversity in the hypothalamus. Cell Stem Cell. 28 (8), 1483-1499 (2021).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-cell RNA-seq reveals hypothalamic cell diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Ma, C., et al. Neural pathways from hypothalamic orexin neurons to the ventrolateral preoptic area mediate sleep impairments induced by conditioned fear. Frontiers in Neuroscience. 17, 1122803 (2023).
- Wang, F., et al. A parabrachial to hypothalamic pathway mediates defensive behavior. Elife. 12, e85450 (2023).
- Cowley, M. A., et al. Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature. 411 (6836), 480-484 (2001).
- Parekh, R. U., et al. Hypothalamic kinin B1 receptor mediates orexin system hyperactivity in neurogenic hypertension. Scientific Reports. 11 (1), 21050 (2021).
- Schmidt, C. X., Tsang, A. H., Oster, H. Generation of mouse primary hypothalamic neuronal cultures for circadian bioluminescence assays. Bio-protocol. 11 (5), e3944 (2021).
- Foo, L. C. Purification of rat and mouse astrocytes by immunopanning. 2013 (5), Cold Spring Harbor Protocols. 421-432 (2013).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. 2013 (9), Cold Spring Harbor Protocols. 854-868 (2013).
- Zhao, H., et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea. International Journal of Molecular Sciences. 12 (3), 1862-1875 (2011).
- Zhang, Z. M., et al. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chinese Medical Journal. 124 (12), 1813-1817 (2011).
- Drake, S. S., Zaman, A., Simas, T., Fournier, A. E. Comparing RNA-sequencing datasets from astrocytes, oligodendrocytes, and microglia in multiple sclerosis identifies novel dysregulated genes relevant to inflammation and myelination. WIREs Mechanisms of Disease. 15 (2), e1594 (2023).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Cottrell, E. C., et al. Developmental changes in hypothalamic leptin receptor: relationship with the postnatal leptin surge and energy balance neuropeptides in the postnatal rat. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296 (3), R631-R639 (2009).
