Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo
Summary
Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.
Abstract
Les bactériophages (phages) sont des virus qui infectent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche et sont les entités biologiques les plus abondantes dans tous les écosystèmes connus. Au sein des communautés bactériennes, telles que celles que l’on trouve dans le microbiote intestinal, les phages sont impliqués dans la régulation de la dynamique des populations de microbiote et dans l’évolution bactérienne. La recherche sur les phages a connu un regain d’intérêt au cours de la dernière décennie, en partie en raison des capacités de destruction spécifiques à l’hôte des phages lytiques, qui offrent un outil prometteur pour contrer la menace croissante des bactéries résistantes aux antimicrobiens. De plus, des études récentes démontrant que les phages adhèrent au mucus intestinal suggèrent qu’ils pourraient avoir un rôle protecteur dans la prévention de l’invasion bactérienne dans l’épithélium sous-jacent. Il est important de noter que, comme les microbiomes bactériens, les phagéomes perturbés ont été associés à une aggravation des résultats dans des maladies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin. Des études antérieures ont démontré que les phages peuvent moduler le microbiome des animaux et des humains grâce à des greffes de filtrat fécal, ce qui est bénéfique pour la santé de l’hôte. Cette récente vague de recherche s’accompagne de la nécessité d’établir et de normaliser des protocoles pour étudier les phages dans le contexte du microbiome intestinal. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier les phages T4 isolés et leur hôte bactérien, Escherichia coli, dans le contexte du tractus gastro-intestinal murin. Les méthodes décrites ici décrivent comment partir d’un lysat de phage, l’administrer à des souris et évaluer les effets sur l’hôte bactérien et les niveaux de phages. Ce protocole peut être modifié et appliqué à d’autres paires phage-bactérie et fournit un point de départ pour étudier la dynamique hôte-phage in vivo.
Introduction
Les bactériophages, ou phages, sont des virus qui infectent et tuent les bactéries avec une spécificité au niveau de l’espèce et de la souche1. Les phages jouent un rôle important dans les communautés bactériennes complexes telles que le microbiote intestinal, où ils ont été impliqués dans la régulation de la dynamique des populations et la conduite de la fitness bactérienne2. Au cours de la dernière décennie, il y a eu un regain d’intérêt pour la recherche sur les phages en raison de l’augmentation des agents pathogènes résistants aux antimicrobiens3 et du potentiel de la phagothérapie comme stratégie de traitement alternative. Ces dernières années, les cocktails de phages lytiques ont été utilisés par voie intraveineuse avec un certain succès dans les infections septiques bactériennes graves et résistantes aux antibiotiques chez l’homme 3,4. La phagothérapie orale a également été proposée comme alternative potentielle aux antibiotiques pour traiter les infections intestinales et l’inflammation. De plus, les phages ont été impliqués dans le succès des greffes de filtrat fécal (FFT), qui sont des préparations de microbiote fécal filtrées pour éliminer les bactéries, dans le traitement de l’infection récurrente à Clostridioides difficile (ICDr)5,6, des troubles inflammatoires de l’intestin (MICI)7,8 et de l’entérocolite nécrosante chez les porcs prématurés9. Compte tenu de ces résultats, il est important de prendre en compte les interactions entre les phages et le microbiote intestinal, et entre les phages et l’hôte mammifère, car l’ajout de nouveaux phages dans une communauté préexistante peut avoir des effets indirects sur la communauté dans son ensemble, et pas seulement sur ses bactéries cibles 2,10.
L’étude in vitro des interactions des phages avec leurs bactéries cibles s’est avérée utile pour comprendre les mécanismes et les impacts des interactions phages et bactéries dans l’intestin. Dans ce contexte, il a été démontré que les phages T4 spécifiques d’Escherichia coli de l’ordre des Caudovirales ont besoin de domaines de type immunoglobuline (Ig) situés dans des protéines de capside externe (Hoc) hautement antigéniques à la surface du virion pour adhérer au mucus intestinal11. De plus, des tests transwell ont montré que les phages T4 sont capables d’interagir avec les cultures de cellules épithéliales et de se déplacer à travers les couches cellulaires par macropinocytose12,13. Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle les phages peuvent interagir avec leur hôte métazoaire, même s’ils sont incapables d’infecter les cellules eucaryotes. Ces modèles, bien qu’utiles, ne disposent pas de toute la gamme d’interactions complexes qui se produisent dans un écosystème intestinal et qui sont nécessaires à une exploration complète de l’interaction tripartite entre les phages, les bactéries et l’hôte métazoaire.
Les modèles murins sont un outil important pour étudier les phages dans des environnements complexes. Une application souhaitable de l’administration de phages est une stratégie alternative pour traiter les infections résistantes aux antimicrobiens ou les agents pathogènes associés aux maladies inflammatoires chroniques, y compris les MICI. Cependant, la littérature émergente suggère que le comportement des phages in vitro ne représente pas pleinement les fonctions in vivo. Buttimer et al.14 ont démontré qu’un cocktail de phages était capable d’épuiser les bactéries ciblées dans un consortium simplifié de microbiote humain in vitro, mais ne pouvait pas être répliqué in vivo chez des souris gnotobiotiques colonisées par le même consortium bactéries-phages. De plus, dans un microbiome de souris conventionnel, le phage T7 a entraîné un épuisement sélectif de ses bactéries intestinales cibles, bien qu’une récupération progressive ait été observée au fil du temps, indiquant une résistance évoluée15. D’autres études ont démontré la coexistence de phages administrés par voie orale et de leurs souches bactériennes cibles in vivo 2,16. En effet, au-delà de la coexistence phage/bactérie, l’administration de phages a entraîné des changements généralisés dans la composition et la fonction globales de la communauté du microbiote 2,16. Ceci est pertinent dans les contextes pathologiques, car plusieurs études ont trouvé des associations entre l’augmentation de l’abondance relative des Caudovirales et des MICI 7,8,17 qui étaient indépendantes des changements dans l’abondance bactérienne7. On ne sait pas encore s’il s’agit d’un facteur ou d’une conséquence de la pathogenèse de la maladie.
L’objectif historique de l’étude des phages a été la relation entre un phage et sa bactérie cible. Cependant, il est également important de prendre en compte les interactions potentielles entre le phage et la muqueuse, l’épithélium et le système immunitaire de l’hôte métazoaire. Ces interactions jouent toutes un rôle important dans la réponse globale à l’infection intestinale par les phages. Pour le démontrer, des phages ont été étudiés sur des souris sans germes (GF) afin d’élucider leur impact sur le système immunitaire sans interférence du microbiote8. Dans ce système, les acides nucléiques des phages ont été détectés par des récepteurs de type Toll (TLR) situés dans les endosomes des cellules immunitaires phagocytaires (macrophages et cellules dendritiques). Cela a activé la signalisation en aval et stimulé la production d’interféron (IFN)-γ8 ou d’IFNs de type I18 dépendant des lymphocytes T. De plus, Fluckiger et al.19 ont impliqué les lymphocytes T CD8+ mémoires dans la reconnaissance des antigènes codés par des phages (prophages), ce qui a entraîné une réactivité croisée des lymphocytes T avec les antigènes tumoraux, ce qui a entraîné une réduction de la charge tumorale. Enfin, la production d’anticorps spécifiques aux phages a été documentée dans des études sur des souris où des phages ont été délivrés à des modèles animaux de manière continue par l’eau potable 8,20, ou par gavage oral répété pendant plusieurs mois20, démontrant la capacité des protéines des phages à promouvoir des réponses immunitaires humorales. Bien que ces modes d’inoculation des phages permettent un amorçage optimal et continu du système immunitaire, ils peuvent ne pas représenter les interactions naturelles entre les phages et l’environnement intestinal, ni la cinétique de la phagothérapie appliquée par voie orale. Jusqu’à présent, un nombre limité d’études ont examiné les interactions d’un phage avec une seule espèce bactérienne dans des modèles murins monocolonisés21. Cependant, les souris monocolonisées se sont avérées essentielles pour déchiffrer les effets spécifiques des microbes des espèces individuelles sur le tractus gastro-intestinal (GI) et le développement immunitaire 22,23,24, et elles peuvent encore s’avérer utiles pour comprendre les interactions tripartites entre les phages, leurs bactéries cibles et l’hôte métazoaire.
Il est passionnant de constater qu’il reste encore beaucoup à apprendre sur les interactions entre les phages intestinaux et les bactéries commensales intestinales, ainsi que sur les interactions qui se produisent entre l’hôte métazoaire et les phages qui y résident. Ce protocole fournit un ensemble de procédures pour étudier le phage T4 isolé et son homologue bactérien, E. coli (K-12, BW25113), à l’aide d’un modèle murin gnotobiotique. Ces procédures standardisées fournissent également une base pour optimiser d’autres dyades phage/bactérie en adaptant les paramètres de croissance aux paires d’intérêt. Les méthodes décrites ici décrivent : (1) la préparation de lysats de phages et de véhicules T4 pour le gavage oral de souris ; (2) Administration orale de phage T4 à des souris gnotobiotiques monocolonisées par E. coli ; (3) Surveillance des niveaux de phages T4 dans les excréments et les tissus de souris au fil du temps.
Pour les résultats représentatifs présentés ici, des lysats de phages T4 purifiés ont été propagés à partir de stocks de banques de phages maintenus par le laboratoire Rohwer. La méthode Phage-on-Tap pour la propagation du phage T4 a été adaptée25, comme indiqué dans ce protocole. La méthode permet d’obtenir des stocks de phages à titre élevé et à faible teneur en endotoxines en trois jours. En utilisant cette approche, 10 mL de ≥ 1010 unités formant des plaques (UFP)/mL de phage T4 avec < 0,5 unité d’endotoxine (UE)/mL ont été collectés régulièrement. Les teneurs en endotoxines recommandées pour l’administration orale ou intraveineuse chez la souris sont respectivement de ≤ 20 UE/ml et ≤ de 5 UE/kg/h (ou 0,1 UE administrée en 1 heure pour une souris de 20 g), ce qui en fait une méthode appropriée de préparation de phages pour l’inoculation in vivo . Tous les stocks de phages ont été stockés à 4 °C dans un tampon de magnésium salin (SM) (recette fournie à l’étape 1.1.5.1). E. coli a été cultivé dans des milieux LB. Pour diverses paires phage-bactérie, divers milieux de culture et conditions de croissance peuvent être adaptés à partir de ce protocole. Les phages peuvent également provenir de l’environnement, comme les eaux usées, l’eau de mer, le sol et le contenu intestinal, et peuvent être isolés et purifiés selon Sambrook et Russell26 avant la préparation en utilisant les conditions de croissance et de propagation appropriées pour chaque paire phage-hôte d’intérêt25. Les phages peuvent également être obtenus auprès de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) ou de banques de phages.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étude des phages dans le microbiome présente un défi important par rapport à leurs homologues bactériens. Plus précisément, les phages ne contiennent pas de marqueur phylogénétique conservé commun à tous les phages apparenté aux sous-unités ribosomales 16S et 18S qui permettent de faciliter le séquençage et l’identification des espèces procaryotes et eucaryotes, respectivement42. Cependant, avec les progrès des approches de séquençage de nouvelle génération, y compris l?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent que les terres sur lesquelles ils ont effectué cette recherche sont le territoire traditionnel, ancestral et non cédé de la nation xwməθkwəy̓əm (Musqueam). La terre sur laquelle il est situé a toujours été un lieu d’apprentissage pour le peuple Musqueam, qui depuis des millénaires transmet sa culture, son histoire et ses traditions d’une génération à l’autre sur ce site. Nous encourageons les autres à en apprendre davantage sur les terres autochtones dans lesquelles ils vivent et travaillent à https://native-land.ca. Les auteurs remercient le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) pour le soutien des bourses d’études supérieures du Canada – maîtrise (N.P.), de la bourse de stagiaire Michael Smith Health Research BC (RT-2023-3174, à MH), du Programme de subventions à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RGPIN-2019-04591 à C.T., RGPIN-2016-04282 à la CDO), de l’Institut canadien de recherches avancées / L’humain et le microbiome (FL-001253 Appt 3362, à C.T.), la bourse de boursier de la Fondation Michael-Smith pour la recherche en santé (18239, à C.T.), les Instituts de recherche en santé du Canada (PJT-159458 à la CDO) et la Fondation canadienne pour l’innovation (34673 à la CDO et 38277 à CT). Nous sommes reconnaissants du soutien technique du Centre de modélisation des maladies de l’Université de la Colombie-Britannique et d’ubcFLOW, qui est soutenu par l’initiative de résilience biologique GREx de l’Université de la Colombie-Britannique, ainsi que des membres des laboratoires Osborne et Tropini pour les discussions critiques et l’évaluation du manuscrit. Les figures 1A et 2A ont été créées à l’aide de Biorender.com.
Materials
| 1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
| Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® Tubes, SST | BD Medical | 365967 | |
| Bioexclusion airtight cages (ISO cages) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk | Andwin Scientific | 16812612 | |
| Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) | Fisher | C298-500 | |
| Copper coated steel beads (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 Incubated Shaker | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Parafilm sealing film | Bemis | PM-996 | |
| Phage stocks | Carolina Biological Supply | n/a | |
| PicoLab® Mouse Diet 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552S | |
| RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
| Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) | Fisher scentific | n/a | |
| Sterile flexible film isolator | Class Biologically Clean | n/a | |
| SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | AAJ22638AE | |
| Water, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
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