Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Summary

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull’omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all’interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Abstract

I batteriofagi (fagi) sono virus che infettano i batteri con specificità a livello di specie e ceppo e sono le entità biologiche più abbondanti in tutti gli ecosistemi conosciuti. All’interno delle comunità batteriche, come quelle che si trovano nel microbiota intestinale, i fagi sono implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione del microbiota e nel guidare l’evoluzione batterica. Nell’ultimo decennio c’è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi, in parte a causa delle capacità di uccisione dei fagi litici specifici per l’ospite, che offrono uno strumento promettente per contrastare la crescente minaccia dei batteri resistenti agli antimicrobici. Inoltre, recenti studi che dimostrano che i fagi aderiscono al muco intestinale suggeriscono che potrebbero avere un ruolo protettivo nel prevenire l’invasione batterica nell’epitelio sottostante. È importante sottolineare che, come i microbiomi batterici, i fageomi interrotti sono stati associati a esiti peggiori in malattie come le malattie infiammatorie intestinali. Studi precedenti hanno dimostrato che i fagi possono modulare il microbioma degli animali e degli esseri umani attraverso trapianti di filtrato fecale, a beneficio della salute dell’ospite. Con questa recente ondata di ricerca arriva la necessità di stabilire e standardizzare protocolli per lo studio dei fagi nel contesto del microbioma intestinale. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare i fagi T4 isolati e il loro ospite batterico, Escherichia coli, nel contesto del tratto gastrointestinale murino. I metodi qui descritti delineano come partire da un lisato fagico, somministrarlo ai topi e valutare gli effetti sui livelli di ospite batterico e fagico. Questo protocollo può essere modificato e applicato ad altre coppie fago-batterio e fornisce un punto di partenza per lo studio delle dinamiche ospite-fago in vivo.

Introduction

I batteriofagi, o fagi, sono virus che infettano e uccidono i batteri con specificità a livello di specie e ceppo¹. I fagi svolgono un ruolo importante all’interno di comunità batteriche complesse come il microbiota intestinale, dove sono stati implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione e nel guidare la fitness batterica². Nel corso dell’ultimo decennio, c’è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi a causa dell’aumento dei patogeni resistenti agli antimicrobici³ e del potenziale della terapia fagica come strategia di trattamento alternativa. Negli ultimi anni, i cocktail di fagi litici sono stati utilizzati per via endovenosa con un certo successo nelle infezioni settiche batteriche gravi e resistenti agli antibiotici nell’uomo ^3,4. La terapia fagica orale è stata anche proposta come potenziale alternativa agli antibiotici per il trattamento delle infezioni intestinali e delle infiammazioni. Inoltre, i fagi sono stati implicati nel successo dei trapianti di filtrato fecale (FFT), che sono preparati del microbiota fecale che sono stati filtrati per rimuovere i batteri, nel trattamento dell’infezione ricorrente da Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, dei disturbi infiammatori intestinali (IBD)^7,8 e dell’enterocolite necrotizzante nei suini prematuri⁹. Alla luce di questi risultati, è importante considerare le interazioni sia tra i fagi e il microbiota intestinale, sia tra i fagi e l’ospite mammifero, poiché l’aggiunta di nuovi fagi in una comunità preesistente può avere effetti indiretti sulla comunità nel suo complesso, e non solo sui suoi batteri bersaglio ^2,10.

Lo studio delle interazioni dei fagi con i loro batteri bersaglio in vitro si è dimostrato utile per comprendere i meccanismi e gli impatti delle interazioni tra fagi e batteri nell’intestino. In questo contesto, è stato dimostrato che i fagi T4 specifici per Escherichia coli dell’ordine Caudovirales richiedono domini simili alle immunoglobuline (Ig) situati all’interno di proteine del capside esterno (Hoc) altamente antigeniche sulla superficie del virione per aderire al muco intestinale¹¹. Inoltre, i saggi transwell hanno dimostrato che i fagi T4 sono in grado di interagire con colture cellulari epiteliali e di traslocare attraverso gli strati cellulari mediante macropinocitosi^12,13. Questi risultati supportano l’ipotesi che i fagi possano interagire con il loro ospite metazoico, anche se non sono in grado di infettare le cellule eucariotiche. Questi modelli, sebbene utili, mancano dell’intera gamma di interazioni complesse che si verificano in un ecosistema intestinale che sono necessarie per un’esplorazione completa dell’interazione tripartita tra fagi, batteri e l’ospite metazoo.

I modelli murini sono uno strumento importante per lo studio dei fagi all’interno di ambienti complessi. Un’applicazione auspicabile della somministrazione di fagi è come strategia alternativa per il trattamento di infezioni resistenti agli antimicrobici o patobionti associati a malattie infiammatorie croniche, tra cui l’IBD. Tuttavia, la letteratura emergente suggerisce che il comportamento dei fagi in vitro non rappresenta pienamente le funzioni in vivo. Buttimer et ^al.14 hanno dimostrato che un cocktail di fagi era in grado di esaurire i batteri bersaglio in un consorzio di microbiota umano semplificato in vitro, ma non poteva essere replicato in vivo in topi gnotobiotici colonizzati con lo stesso consorzio batterio-fago. Inoltre, in un microbioma murino convenzionale, il fago T7 ha portato a una deplezione selettiva dei suoi batteri intestinali bersaglio, sebbene sia stato osservato un graduale recupero nel tempo, indicativo di resistenza evoluta¹⁵. Altri studi hanno dimostrato la coesistenza di fagi somministrati per via orale e dei loro ceppi batterici bersaglio in vivo ^2,16. Infatti, al di là della coesistenza fagi/batteri, la somministrazione di fagi ha portato a cambiamenti diffusi nella composizione e nella funzione complessiva della comunità del microbiota ^2,16. Ciò è rilevante in contesti patologici poiché diversi studi hanno trovato associazioni tra l’aumento dell’abbondanza relativa di Caudovirales e IBD ^7,8,17 che erano indipendenti dai cambiamenti nell’abbondanza batterica⁷. Non è noto se questo sia un fattore trainante o una conseguenza della patogenesi della malattia.

L’obiettivo storico dell’indagine sui fagi è stato la relazione tra un fago e il suo batterio bersaglio. Tuttavia, è anche importante considerare le potenziali interazioni tra il fago e la mucosa, l’epitelio e il sistema immunitario dell’ospite metazoico. Tutte queste interazioni svolgono un ruolo importante nella risposta globale all’infezione fagica intestinale. Per dimostrarlo, i fagi sono stati studiati utilizzando topi privi di germi (GF) per chiarire il loro impatto sul sistema immunitario senza interferenze da parte del microbiota⁸. In questo sistema, gli acidi nucleici fagici sono stati rilevati dai recettori Toll-like (TLR) situati all’interno degli endosomi delle cellule immunitarie fagocitiche (macrofagi e cellule dendritiche). Ciò ha attivato la segnalazione a valle e stimolato la produzione dipendente dalle cellule T di interferone (IFN)-γ⁸ o IFN^{di tipo I 18}. Inoltre, Fluckiger et ^al.19 hanno implicato le cellule T CD8⁺ della memoria nel riconoscimento degli antigeni codificati dai fagi (profagi), che hanno portato alla cross-reattività delle cellule T con gli antigeni tumorali, con conseguente riduzione del carico tumorale. Infine, la produzione di anticorpi fagico-specifici è stata documentata in studi sui topi in cui i fagi sono stati somministrati a modelli animali in modo continuo attraverso l’acqua potabile ^8,20 o mediante somministrazione orale ripetuta per diversi mesi²⁰, dimostrando la capacità delle proteine fagiche di promuovere le risposte immunitarie umorali. Sebbene queste modalità di inoculazione dei fagi consentano un innesco ottimale e continuo del sistema immunitario, potrebbero non rappresentare le interazioni naturali tra i fagi e l’ambiente intestinale, né la cinetica della terapia fagica applicata per via orale. Finora, un numero limitato di studi ha esaminato le interazioni del fago con una singola specie batterica in modelli murini monocolonizzati²¹. Tuttavia, i topi monocolonizzati si sono dimostrati fondamentali nel decifrare gli effetti microbo-specifici delle singole specie sul tratto gastrointestinale (GI) e sullo sviluppo immunitario 22,23,24 e possono ancora rivelarsi utili nella comprensione delle interazioni tripartite tra i fagi, i loro batteri bersaglio e l’ospite metazoico.

Entusiasmantemente, c’è ancora molto da imparare sulle interazioni tra fagi intestinali e batteri commensali intestinali, nonché sulle interazioni che si verificano tra l’ospite metazoico e i fagi che risiedono al suo interno. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare il fago T4 isolato e la sua controparte batterica, E. coli (K-12, BW25113), utilizzando un modello murino gnotobiotico. Queste procedure standardizzate forniscono anche una base per l’ottimizzazione di altre diadi fagi/batteri adattando i parametri di crescita alle coppie di interesse. I metodi qui descritti delineano: (1) Preparazione di lisati fagici e veicoli T4 per il gavage orale di topi; (2) Somministrazione orale di fago T4 a topi gnotobiotici monocolonizzati da E. coli ; (3) Monitoraggio dei livelli di fagi T4 nelle feci e nei tessuti di topo nel tempo.

Per i risultati rappresentativi qui presentati, i lisati fagici T4 purificati sono stati propagati da stock di banche fagiche mantenute dal Rohwer Lab. Il metodo Phage-on-Tap per la propagazione del fago T4 è stato adattato²⁵, come indicato in questo protocollo. Il metodo produce titoli fagici ad alto titolo, a basso contenuto di endotossine entro tre giorni. Utilizzando questo approccio, sono stati raccolti di routine 10 ml di ≥^{10 10} unità formanti placca (pfu)/mL di fago T4 con < 0,5 unità di endotossine (EU)/mL. I livelli raccomandati di endotossine per la somministrazione orale o endovenosa nei topi sono rispettivamente ≤ 20 EU/mL e ≤ 5 EU/kg/h (o 0,1 EU somministrati in 1 ora per un topo di 20 g), il che lo rende un metodo adatto di preparazione dei fagi per l'inoculazione in vivo . Tutti gli stock fagici sono stati conservati a 4 °C in tampone fagico salino di magnesio (SM) (ricetta fornita al punto 1.1.5.1). E. coli è stato coltivato in terreni LB. Per varie coppie fagi-batteri, diversi terreni di coltura e condizioni di crescita possono essere adattati da questo protocollo. I fagi possono anche essere reperiti dall’ambiente, come le acque reflue, l’acqua marina, il suolo e il contenuto intestinale e possono essere isolati e purificati secondo Sambrook e Russell²⁶ prima della preparazione utilizzando le condizioni di crescita e propagazione appropriate per ciascuna coppia fago-ospite di interesse²⁵. In alternativa, i fagi possono essere ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) o da banche di fagi.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida stabilite dai protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali dell’UBC e dal Comitato per la sicurezza biologica (A23-0113, B19-0038). I topi sono stati ospitati presso l’Università della British Columbia in condizioni prive di agenti patogeni presso il Center for Disease Modelling. I topi C57BL/6 sono stati allevati all’interno della struttura in un isolatore sterile a film flessibile, dotato di dieta sterile per topi, acqua, lettie…

Representative Results

Per studiare le interazioni tra la diade fago T4/E. coli nell’intestino murino, sono stati preparati, puliti e purificati i lisati del fago T4 e del veicolo (Figura 1A). I lisati fagici T4 sono stati titolati mediante test a placca e diluiti a 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/topo) in tampone SM. I lisati del veicolo sono stati anche titolati per confermare l’assenza di fagi vitali e diluiti nello stesso volume di tampone SM del lisato fagico T4. I livelli di endoto…

Discussion

Lo studio dei fagi nel microbioma presenta una sfida significativa rispetto alle loro controparti batteriche. In particolare, i fagi non contengono un marcatore filogenetico conservato comune a tutti i fagi affini alle subunità ribosomiali 16S e 18S che consentono la facilità di sequenziamento e identificazione delle specie procariotiche ed eucariotiche,^{rispettivamente.} Tuttavia, con i progressi negli approcci di sequenziamento di nuova generazione, tra cui l’aumento della lunghezza di lettura, …

Materials

1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100