T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo
Summary
Bakteriophagen (Phagen), Viren, die Bakterien infizieren, sind ein integraler Bestandteil des Darmmikrobioms. Obwohl diese symbiotischen Bewohner die bakterielle Fitness und Populationsdynamik vorantreiben, ist wenig darüber bekannt, wie sie sich auf die Darmhomöostase und -krankheit auswirken. Dieses Protokoll untersucht isolierte T4-Phagen in einem Mausmodell, die an andere Phagen-Bakterien-Paare angepasst werden können.
Abstract
Bakteriophagen (Phagen) sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und die am häufigsten vorkommenden biologischen Einheiten in allen bekannten Ökosystemen sind. Innerhalb von Bakteriengemeinschaften, wie sie in der Darmmikrobiota vorkommen, sind Phagen an der Regulierung der Populationsdynamik der Mikrobiota und der Förderung der bakteriellen Evolution beteiligt. In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung wieder gestiegen, zum Teil aufgrund der wirtsspezifischen Abtötungsfähigkeiten lytischer Phagen, die ein vielversprechendes Instrument bieten, um der zunehmenden Bedrohung durch antibiotikaresistente Bakterien entgegenzuwirken. Darüber hinaus deuten neuere Studien, die zeigen, dass Phagen am Darmschleim haften, darauf hin, dass sie eine schützende Rolle bei der Verhinderung des bakteriellen Eindringens in das darunter liegende Epithel spielen könnten. Wichtig ist, dass gestörte Phageome wie bakterielle Mikrobiome mit verschlechterten Ergebnissen bei Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Phagen das Mikrobiom von Tieren und Menschen durch Stuhlfiltrattransplantationen modulieren können, was der Gesundheit des Wirts zugute kommt. Mit dieser jüngsten Forschungswelle geht die Notwendigkeit einher, Protokolle für die Untersuchung von Phagen im Kontext des Darmmikrobioms zu erstellen und zu standardisieren. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung isolierter T4-Phagen und ihres bakteriellen Wirts, Escherichia coli, im Kontext des murinen Magen-Darm-Trakts. Die hier beschriebenen Methoden beschreiben, wie man von einem Phagenlysat ausgeht, es Mäusen verabreicht und die Auswirkungen auf bakterielle Wirts- und Phagenspiegel bewertet. Dieses Protokoll kann modifiziert und auf andere Phagen-Bakterien-Paare angewendet werden und bietet einen Ausgangspunkt für die Untersuchung der Wirt-Phagen-Dynamik in vivo.
Introduction
Bakteriophagen oder Phagen sind Viren, die Bakterien mit Spezies- und Stammspezifität infizieren und abtöten1. Phagen spielen eine wichtige Rolle in komplexen Bakteriengemeinschaften wie der Darmmikrobiota, wo sie an der Regulierung der Populationsdynamik und der Förderung der bakteriellen Fitness beteiligt sind2. In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Phagenforschung aufgrund des Aufkommens antimikrobiell resistenter Krankheitserreger3 und des Potenzials der Phagentherapie als alternative Behandlungsstrategie wieder gestiegen. In den letzten Jahren wurden lytische Phagencocktails mit einigem Erfolg bei schweren, antibiotikaresistenten bakteriellen septischen Infektionen beim Menschen intravenös eingesetzt 3,4. Die orale Phagentherapie wurde auch als potenzielle Alternative zu Antibiotika zur Behandlung von Darminfektionen und Entzündungen vorgeschlagen. Darüber hinaus wurden Phagen mit dem Erfolg von fäkalen Filtrattransplantationen (FFT) in Verbindung gebracht, bei denen es sich um fäkale Mikrobiota-Präparate handelt, die gefiltert wurden, um Bakterien zu entfernen, bei der Behandlung von rezidivierenden Clostridioides difficile-Infektionen (rCDI)5,6, entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)7,8 und nekrotisierender Enterokolitis bei Frühgeborenen9. Angesichts dieser Ergebnisse ist es wichtig, Wechselwirkungen sowohl zwischen Phagen und der Darmmikrobiota als auch zwischen Phagen und dem Säugetierwirt zu berücksichtigen, da die Hinzufügung neuer Phagen in eine bereits bestehende Gemeinschaft indirekte Auswirkungen auf die Gemeinschaft als Ganzes und nicht nur auf ihre Zielbakterien haben kann 2,10.
Die Untersuchung von Phageninteraktionen mit ihren Zielbakterien in vitro hat sich als nützlich erwiesen, um die Mechanismen und Auswirkungen von Phagen- und Bakterieninteraktionen im Darm zu verstehen. In diesem Setting wurde gezeigt, dass Escherichia coli-spezifische T4-Phagen der Ordnung Caudovirales Immunglobulin (Ig)-ähnliche Domänen benötigen, die sich in hochantigenen äußeren Kapsidproteinen (Hoc) auf der Virionoberfläche befinden, um am Darmschleimzu haften 11. Darüber hinaus haben Transwell-Assays gezeigt, dass T4-Phagen in der Lage sind, mit Epithelzellkulturen zu interagieren und durch Makropinozytose durch Zellschichten zu translozieren12,13. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Phagen mit ihrem metazoischen Wirt interagieren können, obwohl sie nicht in der Lage sind, eukaryotische Zellen zu infizieren. Diese Modelle sind zwar nützlich, aber es fehlt ihnen die gesamte Bandbreite komplexer Interaktionen, die in einem Darmökosystem auftreten und für eine umfassende Untersuchung der dreigliedrigen Interaktion zwischen Phagen, Bakterien und dem Metazoenwirt erforderlich sind.
Mausmodelle sind ein wichtiges Werkzeug, um Phagen in komplexen Umgebungen zu untersuchen. Eine wünschenswerte Anwendung der Phagenverabreichung ist eine alternative Strategie zur Behandlung von antibiotikaresistenten Infektionen oder Pathobionten, die mit chronischen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich CED, assoziiert sind. Neue Literatur deutet jedoch darauf hin, dass das Verhalten von Phagen in vitro die Funktionen in vivo nicht vollständig abbildet. Buttimer et al.14 zeigten, dass ein Phagencocktail in der Lage war, die Zielbakterien in einem vereinfachten menschlichen Mikrobiota-Konsortium in vitro zu depletieren, aber nicht in vivo in gnotobiotischen Mäusen repliziert werden konnte, die mit demselben Bakterien-Phagen-Konsortium besiedelt waren. Darüber hinaus führte der T7-Phage in einem konventionellen Mausmikrobiom zu einer selektiven Erschöpfung seiner Zieldarmbakterien, obwohl im Laufe der Zeit eine allmähliche Erholung beobachtet wurde, was auf eine entwickelte Resistenz hinweist15. Andere Studien haben die Koexistenz von oral verabreichten Phagen und ihren Zielbakterienstämmen in vivo nachgewiesen 2,16. Tatsächlich führte die Phagenverabreichung über die Koexistenz von Phagen und Bakterien hinaus zu weitreichenden Veränderungen in der Gesamtzusammensetzung und -funktion der Mikrobiota-Gemeinschaft 2,16. Dies ist für Krankheitssituationen relevant, da mehrere Studien Assoziationen zwischen einer erhöhten relativen Abundanz von Caudovirales und IBD gefunden haben 7,8,17, die unabhängig von Veränderungen der bakteriellen Abundanz waren7. Es ist nicht bekannt, ob dies ein Treiber oder eine Folge der Krankheitspathogenese ist.
Der historische Schwerpunkt der Phagenforschung lag auf der Beziehung zwischen einem Phagen und seinem Zielbakterium. Es ist jedoch auch wichtig, mögliche Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Schleimhaut, dem Epithel und dem Immunsystem des Metazoenwirts zu berücksichtigen. Diese Wechselwirkungen spielen alle eine wichtige Rolle bei der Gesamtreaktion auf Darmphageninfektionen. Um dies zu demonstrieren, wurden Phagen mit keimfreien (GF) Mäusen untersucht, um ihre Auswirkungen auf das Immunsystem ohne Eingriffe der Mikrobiota aufzuklären8. In diesem System wurden Phagen-Nukleinsäuren durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) nachgewiesen, die sich in Endosomen phagozytärer Immunzellen (Makrophagen und dendritische Zellen) befinden. Dies aktivierte die nachgeschaltete Signalübertragung und stimulierte die T-Zell-abhängige Produktion von Interferon (IFN)-γ8 oder Typ I IFNs18. Darüber hinaus implizierten Flückiger et al.19 Gedächtnis-CD8+ T-Zellen bei der Erkennung von Phagen-kodierten (Prophagen-) Antigenen, was zu einer T-Zell-Kreuzreaktivität mit Tumorantigenen führte, was zu einer verringerten Tumorlast führte. Schließlich wurde die Phagen-spezifische Antikörperproduktion in Mausstudien dokumentiert, in denen Phagen kontinuierlich über Trinkwasser 8,20 oder durch wiederholte orale Sonde über mehrere Monate hinweg an Tiermodelle abgegeben wurden20, was die Fähigkeit von Phagenproteinen zur Förderung humoraler Immunantworten zeigt. Obwohl diese Arten der Phageninokulation eine optimale und kontinuierliche Vorbereitung des Immunsystems ermöglichen, repräsentieren sie möglicherweise nicht die natürlich vorkommenden Wechselwirkungen zwischen Phagen und der Darmumgebung oder die Kinetik der oral angewendeten Phagentherapie. Bisher hat eine begrenzte Anzahl von Studien die Interaktionen von Phagen mit einer einzigen Bakterienart in monokolonisierten Mausmodellen untersucht21. Monokolonisierte Mäuse erwiesen sich jedoch als entscheidend für die Entschlüsselung mikrobenspezifischer Effekte einzelner Spezies auf den Magen-Darm-Trakt und die Immunentwicklung 22,23,24, und sie könnten sich noch als nützlich erweisen, um dreigliedrige Interaktionen zwischen Phagen, ihren Zielbakterien und dem Metazoenwirt zu verstehen.
Spannenderweise gibt es noch viel über die Wechselwirkungen zwischen Darmphagen und Darmkommensalbakterien sowie über die Wechselwirkungen zwischen dem Metazoen-Wirt und den darin befindlichen Phagen zu lernen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Verfahren zur Untersuchung von isolierten T4-Phagen und seinem bakteriellen Gegenstück, E. coli (K-12, BW25113), unter Verwendung eines gnotobiotischen Mausmodells. Diese standardisierten Verfahren bieten auch eine Grundlage für die Optimierung anderer Phagen/Bakterien-Dyaden, indem die Wachstumsparameter an die interessierenden Paare angepasst werden. Die hier beschriebenen Methoden skizzieren: (1) Herstellung von T4-Phagen- und Vehikellysaten für orale Sonden von Mäusen; (2) Orale Verabreichung von T4-Phagen an monokolonisierte gnotobiotische Mäuse von E. coli ; (3) Überwachung der T4-Phagenspiegel in Mäusekot und -gewebe im Laufe der Zeit.
Für die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse wurden gereinigte T4-Phagenlysate aus Phagenbankbeständen des Rohwer Lab vermehrt. Die Phagen-on-Tap-Methode zur Vermehrung von T4-Phagen wurde angepasst25, wie in diesem Protokoll referenziert. Die Methode liefert innerhalb von drei Tagen Phagenbestände mit hohem Titer und niedrigem Endotoxingehalt. Mit diesem Ansatz wurden routinemäßig 10 ml ≥ 1010 plaquebildende Einheiten (pfu)/ml T4-Phagen mit < 0,5 Endotoxineinheiten (EU)/ml gesammelt. Die empfohlenen Endotoxingehalte für die orale oder intravenöse Verabreichung an Mäuse liegen bei ≤ 20 EU/ml bzw. ≤ 5 EU/kg/h (bzw. 0,1 EU über 1 h für eine 20-g-Maus), was dies zu einer geeigneten Methode der Phagenpräparation für die In-vivo-Inokulation macht. Alle Phagenbestände wurden bei 4 °C in salzhaltigem Magnesium (SM)-Phagenpuffer gelagert (Rezeptur in Schritt 1.1.5.1). E. coli wurde in LB-Medien kultiviert. Für verschiedene Phagen-Bakterien-Paare können verschiedene Nährmedien und Wachstumsbedingungen aus diesem Protokoll angepasst werden. Phagen können auch aus der Umwelt wie Abwasser, Meerwasser, Boden und Darminhalt stammen und können gemäß Sambrook und Russell26 vor der Herstellung unter den geeigneten Wachstums- und Vermehrungsbedingungen für jedes Phagen-Wirt-Paarvon Interesse 25 isoliert und gereinigt werden. Alternativ können Phagen aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle) oder aus Phagenbanken bezogen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung von Phagen im Mikrobiom stellt im Vergleich zu ihren bakteriellen Gegenstücken eine große Herausforderung dar. Insbesondere enthalten Phagen keinen konservierten phylogenetischen Marker, der allen Phagen gemeinsam ist, ähnlich den ribosomalen 16S- und 18S-Untereinheiten, die die Sequenzierung und Identifizierung von prokaryotischen bzw. eukaryotischen Spezies erleichtern42. Mit den Fortschritten bei den Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation, einschließlich der Erhö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen an, dass das Land, an dem sie diese Forschung durchgeführt haben, das traditionelle, angestammte und nicht abgetretene Territorium der xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation ist. Das Land, auf dem es sich befindet, war schon immer ein Ort des Lernens für das Volk der Musqueam, das seit Jahrtausenden seine Kultur, Geschichte und Traditionen an diesem Ort von einer Generation zur nächsten weitergegeben hat. Wir ermutigen andere, mehr über die Heimatländer zu erfahren, in denen sie bei https://native-land.ca leben und arbeiten. Die Autoren danken der Unterstützung durch die Canadian Graduate Scholarships – Master (N.P.), den Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, an MH), das Discovery Grants Program des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RGPIN-2019-04591 bis C.T., RGPIN-2016-04282 bis LCO), das Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, an C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, an C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 an LCO) und die Canadian Foundation for Innovation (34673 an LCO und 38277 an CT). Wir sind dankbar für die technische Unterstützung durch das UBC Centre for Disease Modelling und ubcFLOW, das von der UBC GREx Biological Resilience Initiative unterstützt wird, sowie für die Mitglieder der Labore Osborne und Tropini für kritische Diskussionen und die Bewertung des Manuskripts. Abbildung 1A und Abbildung 2A wurden mit Biorender.com erstellt.
Materials
| 1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
| Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® Tubes, SST | BD Medical | 365967 | |
| Bioexclusion airtight cages (ISO cages) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk | Andwin Scientific | 16812612 | |
| Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) | Fisher | C298-500 | |
| Copper coated steel beads (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 Incubated Shaker | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Parafilm sealing film | Bemis | PM-996 | |
| Phage stocks | Carolina Biological Supply | n/a | |
| PicoLab® Mouse Diet 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552S | |
| RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
| Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) | Fisher scentific | n/a | |
| Sterile flexible film isolator | Class Biologically Clean | n/a | |
| SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | AAJ22638AE | |
| Water, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
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