Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo
Summary
Os bacteriófagos (fagos), vírus que infectam bactérias, são um componente integral do microbioma intestinal. Embora esses habitantes simbióticos impulsionem a aptidão bacteriana e a dinâmica populacional, pouco se entende sobre como eles afetam a homeostase intestinal e a doença. Este protocolo estuda fagos isolados de T4 dentro de um modelo murino, adaptável a outros pares fago-bactérias.
Abstract
Bacteriófagos (fagos) são vírus que infectam bactérias com especificidade em nível de espécie e cepa e são as entidades biológicas mais abundantes em todos os ecossistemas conhecidos. Dentro de comunidades bacterianas, como as encontradas na microbiota intestinal, os fagos estão implicados na regulação da dinâmica populacional da microbiota e na condução da evolução bacteriana. Tem havido um interesse renovado na pesquisa de fagos na última década, em parte devido às capacidades de matar os fagos líticos específicos do hospedeiro, que oferecem uma ferramenta promissora para combater a crescente ameaça de bactérias resistentes a antimicrobianos. Além disso, estudos recentes demonstrando que os fagos aderem ao muco intestinal sugerem que eles podem ter um papel protetor na prevenção da invasão bacteriana no epitélio subjacente. É importante ressaltar que, assim como os microbiomas bacterianos, os fageomas interrompidos têm sido associados a desfechos piorados em doenças como a doença inflamatória intestinal. Estudos anteriores demonstraram que os fagos podem modular o microbioma de animais e humanos por meio de transplantes de filtrados fecais, beneficiando a saúde do hospedeiro. Com essa recente onda de pesquisas, surge a necessidade de estabelecer e padronizar protocolos para o estudo de fagos no contexto do microbioma intestinal. Este protocolo fornece um conjunto de procedimentos para estudar fagos isolados de T4 e seu hospedeiro bacteriano, Escherichia coli, no contexto do trato gastrointestinal murino. Os métodos descritos aqui descrevem como começar a partir de um lisado de fago, administrá-lo a camundongos e avaliar os efeitos sobre os níveis de hospedeiro bacteriano e fago. Este protocolo pode ser modificado e aplicado a outros pares fago-bactéria e fornece um ponto de partida para o estudo da dinâmica hospedeiro-fago in vivo.
Introduction
Bacteriófagos, ou fagos, são vírus que infectam e matam bactérias com especificidade em nível de espécie e cepa1. Os fagos desempenham papéis importantes dentro de comunidades bacterianas complexas, como a microbiota intestinal, onde têm sido implicados na regulação da dinâmica populacional e na condução da aptidão bacteriana2. Ao longo da última década, tem havido um interesse renovado na pesquisa de fagos devido ao aumento de patógenos resistentes a antimicrobianos3 e ao potencial da fagoterapia como estratégia alternativa de tratamento. Nos últimos anos, coquetéis de fagos líticos têm sido utilizados por via intravenosa com algum sucesso em infecções sépticas bacterianas graves e resistentes a antibióticos em humanos 3,4. A fagoterapia oral também tem sido proposta como uma alternativa potencial aos antibióticos para tratar infecções intestinais e inflamação. Além disso, fagos têm sido implicados no sucesso dos transplantes de filtrado fecal (FFT), que são preparações da microbiota fecal que foram filtradas para remover bactérias, no tratamento da infecção recorrente por Clostridioides difficile (rCDI)5,6, distúrbios inflamatórios intestinais (DII)7,8 e enterocolite necrosante em suínos prematuros9. Diante desses resultados, é importante considerar interações tanto entre fagos e a microbiota intestinal, quanto entre fagos e mamíferos hospedeiros, pois a adição de novos fagos a uma comunidade preexistente pode ter efeitos indiretos sobre a comunidade como um todo, e não apenas sobre suas bactérias-alvo 2,10.
O estudo das interações dos fagos com suas bactérias-alvo in vitro tem se mostrado útil para a compreensão dos mecanismos e impactos das interações entre fagos e bactérias no intestino. Nesse contexto, demonstrou-se que fagos T4 específicos de Escherichia coli da ordem Caudovirales necessitam de domínios semelhantes a imunoglobulinas (Ig) localizados dentro de proteínas altamente antigênicas do capsídeo externo (Hoc) na superfície do vírion para aderir ao muco intestinal11. Além disso, ensaios transwell mostraram que fagos T4 são capazes de interagir com culturas de células epiteliais e translocar através das camadas celulares por macropinocitose12,13. Estes resultados suportam a hipótese de que os fagos podem interagir com seus hospedeiros metazoários, mesmo sendo incapazes de infectar células eucarióticas. Esses modelos, embora úteis, carecem de toda a gama de interações complexas que ocorrem em um ecossistema intestinal que são necessárias para uma exploração abrangente da interação tripartite entre fagos, bactérias e o hospedeiro metazoário.
Modelos de camundongos são uma ferramenta importante para a investigação de fagos em ambientes complexos. Uma aplicação desejável da administração de fagos é como uma estratégia alternativa para tratar infecções resistentes a antimicrobianos ou patobiontes associados a doenças inflamatórias crônicas, incluindo DII. No entanto, a literatura emergente sugere que o comportamento dos fagos in vitro não representa completamente as funções in vivo. Buttimer et al.14 demonstraram que um coquetel de fagos foi capaz de esgotar as bactérias-alvo em um consórcio simplificado de microbiota humana in vitro, mas não pôde ser replicado in vivo em camundongos gnotobióticos colonizados com o mesmo consórcio bactéria-fago. Além disso, em um microbioma convencional de camundongos, o fago T7 levou à depleção seletiva de suas bactérias intestinais alvo, embora a recuperação gradual tenha sido observada ao longo do tempo, indicando resistência evoluída15. Outros estudos demonstraram a coexistência de fagos administrados por via oral e suas cepas bacterianas alvo in vivo 2,16. De fato, além da coexistência de fago/bactéria, a administração de fagos levou a mudanças generalizadas na composição e função geral da comunidade da microbiota 2,16. Isso é relevante em situações de doença, pois vários estudos encontraram associações entre o aumento da abundância relativa de caudovirais e DII 7,8,17 que foram independentes de mudanças na abundância bacteriana7. Ainda não se sabe se isso é um fator determinante ou consequência da patogênese da doença.
O foco histórico da investigação de fagos tem sido em torno da relação entre um fago e sua bactéria-alvo. No entanto, também é importante considerar potenciais interações entre o fago e a mucosa, o epitélio e o sistema imune do hospedeiro metazoário. Todas essas interações desempenham um papel importante na resposta global à infecção intestinal por fago. Para demonstrar isso, fagos têm sido estudados utilizando camundongos germ-free (GF) para elucidar seu impacto no sistema imune sem interferência da microbiota8. Nesse sistema, os ácidos nucléicos dos fagos foram detectados por receptores do tipo Toll (TLRs) localizados dentro de endossomos de células imunes fagocíticas (macrófagos e células dendríticas). Isso ativou a sinalização a jusante e estimulou a produção dependente de células T de interferon (IFN)-γ 8 ou IFNs tipo I18. Além disso, Fluckiger et al.19 implicaram células T CD8+ de memória no reconhecimento de antígenos codificados por fagos (prófagos), o que resultou em reatividade cruzada de células T com antígenos tumorais, resultando em redução da carga tumoral. Finalmente, a produção de anticorpos fago-específicos foi documentada em estudos em camundongos onde fagos foram entregues a modelos animais de forma contínua através da água potável 8,20, ou por gavagem oral repetida ao longo de vários meses20, demonstrando a capacidade das proteínas dos fagos em promover respostas imunes humais. Embora esses modos de inoculação de fagos permitam o priming ótimo e contínuo do sistema imunológico, eles podem não representar as interações naturais entre fagos e o ambiente intestinal, nem a cinética da terapia fagológica aplicada por via oral. Até o momento, um número limitado de estudos examinou as interações do fago com uma única espécie bacteriana em modelos de camundongos monocolonizados21. No entanto, camundongos monocolonizados mostraram-se críticos para decifrar os efeitos micróbio-específicos de espécies individuais sobre o trato gastrointestinal (GI) e o desenvolvimento imunológico 22,23,24, e ainda podem ser úteis na compreensão das interações tripartites entre fagos, suas bactérias-alvo e o hospedeiro metazoário.
De forma empolgante, ainda há muito a aprender sobre as interações entre fagos intestinais e bactérias comensais intestinais, bem como as interações que ocorrem entre o hospedeiro metazoário e os fagos que residem nele. Este protocolo fornece um conjunto de procedimentos para estudar o fago isolado de T4 e sua contraparte bacteriana, E. coli (K-12, BW25113), usando um modelo gnotobiótico em camundongos. Esses procedimentos padronizados também fornecem uma base para otimizar outras díades de fago/bactéria, adaptando os parâmetros de crescimento aos pares de interesse. Os métodos aqui descritos descrevem: (1) Preparação de fagos T4 e lisados veiculares para gavagem oral de camundongos; (2) Administração oral de fago T4 a camundongos monocolonizados de E. coli gnotobióticos; (3) Monitoramento dos níveis de fagos T4 em fezes e tecidos de camundongos ao longo do tempo.
Para os resultados representativos aqui apresentados, lisados purificados de fagos T4 foram propagados a partir de estoques de bancos de fagos mantidos pelo Rohwer Lab. O método Phage-on-Tap para propagação de fago T4 foi adaptado25, conforme referenciado neste protocolo. O método produz altos títulos e baixos estoques de fago com endotoxina em três dias. Utilizando essa abordagem, 10 mL de ≥ 1010 unidades formadoras de placa (pfu)/mL de fago T4 com < 0,5 unidades de endotoxina (EU)/mL foram rotineiramente coletados. Os níveis recomendados de endotoxinas para administração oral ou intravenosa em ratinhos são ≤ 20 EU/ml e ≤ 5 EU/kg/h (ou 0,1 EU administrados durante 1 h para um ratinho de 20 g), respetivamente, tornando este um método adequado de preparação de fagos para inoculação in vivo . Todos os estoques de fago foram armazenados a 4 °C em tampão fagogênico salino magnésio (SM) (receita fornecida na etapa 1.1.5.1). E. coli foi cultivada em meio LB. Para vários pares de fagos-bactérias, diversos meios de cultura e condições de crescimento podem ser adaptados a partir deste protocolo. Os fagos também podem ser obtidos do ambiente, tais como águas residuais, água marinha, solo e conteúdo intestinal, e podem ser isolados e purificados conforme Sambrook e Russell26 antes da preparação, usando as condições apropriadas de crescimento e propagação para cada par fago-hospedeiro de interesse25. Alternativamente, os fagos podem ser obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) ou de bancos de fagos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O estudo de fagos no microbioma apresenta um desafio significativo em comparação com seus homólogos bacterianos. Especificamente, os fagos não contêm um marcador filogenético conservado comum a todos os fagos, semelhante às subunidades ribossomais 16S e 18S, que permita a facilidade no sequenciamento e identificação de espécies procarióticas e eucarióticas, respectivamente42. No entanto, com os avanços nas abordagens de sequenciamento de próxima geração, incluindo o aumento do comp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem que a terra em que realizaram esta pesquisa é o território tradicional, ancestral e não cedido da Nação xwməθkwəy̓əm (Musqueam). A terra em que está situado sempre foi um lugar de aprendizado para o povo Musqueam, que por milênios transmitiu em sua cultura, história e tradições de uma geração para a outra neste local. Encorajamos outras pessoas a aprender mais sobre as terras nativas em que vivem e trabalham em https://native-land.ca. Os autores agradecem o apoio do Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) Canadian Graduate Scholarships – Master’s (N.P.), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, para MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 to C.T., RGPIN-2016-04282 to LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, para C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, para C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 para LCO) e Canadian Foundation for Innovation (34673 para LCO e 38277 para CT). Agradecemos o apoio técnico do UBC Centre for Disease Modelling e do ubcFLOW, que é apoiado pela UBC GREx Biological Resilience Initiative, e aos membros dos laboratórios Osborne e Tropini pelas discussões críticas e avaliação do manuscrito. A Figura 1A e a Figura 2A foram criadas usando Biorender.com.
Materials
| 1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
| Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® Tubes, SST | BD Medical | 365967 | |
| Bioexclusion airtight cages (ISO cages) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk | Andwin Scientific | 16812612 | |
| Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) | Fisher | C298-500 | |
| Copper coated steel beads (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
| HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 Incubated Shaker | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
| Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Parafilm sealing film | Bemis | PM-996 | |
| Phage stocks | Carolina Biological Supply | n/a | |
| PicoLab® Mouse Diet 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552S | |
| RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
| RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
| Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) | Fisher scentific | n/a | |
| Sterile flexible film isolator | Class Biologically Clean | n/a | |
| SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
| T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | AAJ22638AE | |
| Water, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
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