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Biochemistry

Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66023
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

L’application de couches de support aux grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) permet d’augmenter la densité des particules, de limiter les interactions avec l’interface air-eau, de réduire les mouvements induits par les faisceaux et d’améliorer la distribution des orientations des particules. Cet article décrit un protocole robuste pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène afin d’améliorer la préparation des échantillons cryogéniques.

Abstract

En microscopie électronique cryogénique (cryoEM), des macromolécules purifiées sont appliquées sur une grille portant une feuille de carbone trouée ; Les molécules sont ensuite tamponnées pour éliminer l’excès de liquide et rapidement congelées dans une couche de glace vitreuse d’environ 20 à 100 nm d’épaisseur, suspendue à travers des trous de feuille d’environ 1 μm de large. L’échantillon obtenu est imagé à l’aide de la microscopie électronique à transmission cryogénique et, après traitement de l’image à l’aide d’un logiciel approprié, des structures de résolution quasi atomique peuvent être déterminées. Malgré l’adoption généralisée de la cryoEM, la préparation des échantillons reste un goulot d’étranglement important dans les flux de travail cryoEM, les utilisateurs rencontrant souvent des problèmes liés au mauvais comportement des échantillons dans la glace vitrée en suspension. Récemment, des méthodes ont été développées pour modifier les grilles cryoEM avec une seule couche continue de graphène, qui agit comme une surface d’appui qui augmente souvent la densité des particules dans la zone d’imagerie et peut réduire les interactions entre les particules et l’interface air-eau. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour l’application du graphène aux grilles cryoEM et pour évaluer rapidement l’hydrophilie relative des grilles résultantes. De plus, nous décrivons une méthode basée sur EM pour confirmer la présence de graphène en visualisant son diagramme de diffraction caractéristique. Enfin, nous démontrons l’utilité de ces supports de graphène en reconstruisant rapidement une carte de densité d’une résolution de 2,7 Å d’un complexe Cas9 à l’aide d’un échantillon pur à une concentration relativement faible.

Introduction

La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est devenue une méthode largement utilisée pour visualiser les macromolécules biologiques1. Alimentée par les progrès de la détection directe d’électrons 2,3,4, de l’acquisition de données5 et des algorithmes de traitement d’images 6,7,8,9,10, la cryoEM est désormais capable de produire des structures 3D à résolution quasi atomique d’un nombre croissant de macromolécules11. De plus, en tirant parti de la nature monomoléculaire de l’approche, les utilisateurs peuvent déterminer plusieurs structures à partir d’un seul échantillon 12,13,14,15, ce qui souligne la promesse d’utiliser les données générées pour comprendre des ensembles structurels hétérogènes16,17. Malgré ces progrès, des goulots d’étranglement persistent dans la préparation des grilles cryo-échantillonnées.

Pour la caractérisation structurale par cryoEM, les échantillons biologiques doivent être bien dispersés dans une solution aqueuse, puis doivent être surgelés par un processus appelé vitrification18,19. L’objectif est de capturer les particules dans une couche uniformément mince de glace vitrifiée en suspension à travers des trous régulièrement espacés qui sont généralement découpés en une couche de carbone amorphe. Cette feuille de carbone amorphe à motifs est soutenue par une grille TEM portant un maillage de barres de support en cuivre ou en or. Dans les flux de travail standard, les grilles sont rendues hydrophiles à l’aide d’un traitement plasma à décharge luminescente avant l’application de l’échantillon. L’excès de liquide est tamponné avec du papier filtre, ce qui permet à la solution protéique de former un mince film liquide à travers les trous qui peut être facilement vitrifié pendant la congélation en plongée. Les défis les plus courants comprennent la localisation des particules à l’interface air-eau (AWI) et la dénaturation subséquente 20,21,22 ou l’adoption d’orientations préférées 23,24,25, l’adhérence des particules à la feuille de carbone plutôt que de migrer dans les trous, et le regroupement et l’agrégation des particules à l’intérieur des trous 26. L’épaisseur non uniforme de la glace est une autre préoccupation ; La glace épaisse peut entraîner des niveaux plus élevés de bruit de fond dans les micrographies en raison de l’augmentation de la diffusion des électrons, tandis que la glace extrêmement mince peut exclure les particules plus grosses27.

Pour relever ces défis, une variété de films de support minces ont été utilisés pour recouvrir les surfaces de la grille, permettant aux particules de reposer sur ces supports et, idéalement, d’éviter les interactions avec l’interface air-eau. Les supports en graphène se sont révélés très prometteurs, en partie en raison de leur résistance mécanique élevée associée à leur section efficace de diffusion minimale, ce qui réduit le signal de fond ajouté par la couche de support28. En plus de sa contribution minimale au bruit de fond, le graphène présente également une conductivité électrique et thermique remarquable29. Il a été démontré que les grilles recouvertes de graphène et d’oxyde de graphène permettent d’obtenir une densité de particules plus élevée, une distribution plus uniforme des particules30 et une localisation réduite dans l’AWI22. De plus, le graphène fournit une surface d’appui qui peut être modifiée pour : 1) ajuster les propriétés physico-chimiques de la surface de la grille par fonctionnalisation 31,32,33 ; ou 2) coupler des agents de liaison qui facilitent la purification par affinité des protéines d’intérêt 34,35,36.

Dans cet article, nous avons modifié une procédure existante pour recouvrir les grilles cryoEM d’une seule couche uniforme de graphène30. Les modifications visent à minimiser la manipulation du réseau tout au long du protocole, dans le but d’augmenter le rendement et la reproductibilité. De plus, nous discutons de notre approche pour évaluer l’efficacité de divers traitements UV/ozone pour rendre les grilles hydrophiles avant la plongée. Cette étape de la préparation d’échantillons cryoEM à l’aide de grilles recouvertes de graphène est essentielle, et nous avons trouvé utile notre méthode simple pour quantifier l’hydrophilie relative des grilles résultantes. À l’aide de ce protocole, nous démontrons l’utilité d’utiliser des grilles recouvertes de graphène pour la détermination de la structure en générant une reconstruction 3D à haute résolution de S. pyogenes Cas9 catalytiquement inactif en complexe avec l’ARN guide et l’ADN cible.

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Protocol

1. Préparation du graphène CVD

  1. Préparez la solution de gravure au graphène comme décrit ci-dessous.
    1. Dissoudre 4,6 g de persulfate d’ammonium (APS) dans 20 mL d’eau de qualité moléculaire dans un bécher de 50 mL pour obtenir une solution de 1 M et couvrir de papier d’aluminium. Laissez l’APS se dissoudre complètement tout en passant à l’étape 1.2.
  2. Préparez une section de graphène CVD pour le revêtement en méthacrylate de méthyle (MMA). Coupez soigneusement une section carrée de graphène CVD. Transférez le carré sur une lamelle (50 mm x 24 mm) dans une boîte de Pétri propre et couvrez-la pendant le transport vers l’enrobeuse.
    REMARQUE : Un carré de 18 mm x 18 mm devrait donner 25 à 36 grilles recouvertes de graphène.

2. Revêtement du graphène CVD avec du MMA

  1. Réglez les réglages de l’enrobeuse par essorage sur une vitesse d’essorage élevée de 60 s à 2 500 tr/min. Placez délicatement le graphène CVD sur le mandrin de taille appropriée.
    REMARQUE : Idéalement, le graphène CVD s’étendra de 1 à 2 mm sur le bord du mandrin sélectionné pour empêcher l’aspiration de MMA dans le système de vide.
  2. Appuyez sur le bouton Take/Absorb pour engager la pompe à vide et fixez le graphène CVD sur le mandrin. Appliquez le MMA au centre du carré de graphène CVD, fermez le couvercle et appuyez immédiatement sur le bouton Start/Stop . Pour un carré de graphène CVD de 18 mm x 18 mm, 40 μL de MMA suffisent.
  3. Une fois l’essorage arrêté, débrayez la pompe à vide et récupérez soigneusement le graphène CVD revêtu de MMA à l’aide d’une pince à épiler. Retournez le graphène CVD de manière à ce que le côté revêtu de MMA soit orienté vers le bas et replacez-le sur la lamelle de verre.

3. Gravure au plasma de la face arrière du graphène

  1. Transférez le graphène CVD sur la lamelle dans le déchargeur lumineux et déchargez-le pendant 30 s à 25 mA à l’aide d’une pince à épiler à pointe plate.
  2. Remettez le graphène CVD sur la lamelle de Pétri dans la boîte de Pétri et couvrez-la pendant le transport vers la zone de gravure sur cuivre. Le revêtement MMA protégera la couche supérieure de graphène de la gravure au plasma.

4. Découpe de carrés de graphène CVD revêtus de MMA de la taille d’une grille

  1. Utilisez deux paires de pinces à épiler pour soutenir le carré de graphène CVD. Prenez note de l’orientation du carré de graphène CVD, gardez le côté MMA vers le haut lorsqu’il est attaché à la pince à épiler (CRITIQUE).
  2. Coupez le graphène CVD en carrés d’environ 3 mm x 3 mm. Utilisez deux jeux de pinces à action inversée pour cette étape afin de maintenir le carré de graphène CVD à l’endroit et de l’ancrer en position, ainsi que pour maintenir le bord d’un carré de 3 mm x 3 mm après l’avoir coupé du reste du carré.

5. Dissoudre le substrat de cuivre du graphène CVD revêtu de MMA

  1. Faites flotter soigneusement chaque carré de 3 mm x 3 mm dans la solution APS. Entrez en contact avec la surface de la solution APS avant de libérer chaque carré. Inclinez le bécher de manière à ce que chaque carré puisse être placé dans la solution à un angle peu profond ; Cela permet de s’assurer que la place ne s’enfonce pas.
  2. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et incuber toute la nuit à 25 °C.

6. Retrait des films MMA/graphène de l’APS

  1. Utilisez une lamelle en verre de dimensions 12 mm x 50 mm et extrayez les carrés MMA/graphène de l’APS en plongeant doucement la lamelle verticalement dans l’APS, puis en déplaçant la lamelle latéralement de manière à ce qu’elle bute un carré flottant MMA/graphène.
  2. Retirez soigneusement la lamelle et assurez-vous que l’équerre adhère complètement au côté de la lamelle lors du retrait.
  3. Transférer les carrés de MMA/graphène dans un bécher propre de 50 ml rempli d’eau de qualité moléculaire pendant 20 minutes. Plongez doucement la lamelle avec un carré MMA/graphène fixé verticalement dans l’eau et assurez-vous que le carré se déloge de la lamelle lors de l’interaction avec la surface de l’eau. Répétez l’opération pour tous les carrés MMA/graphène.

7. Collage du graphène sur les grilles

  1. À l’aide d’une pince à épiler à action négative, plongez doucement une grille verticalement dans l’eau avec le côté carbone face à un carré flottant MMA/graphène. Une fois en contact avec le carré, retirez soigneusement la grille et assurez-vous que la grille adhère complètement au côté carbone de la grille lors du retrait. Minimisez le mouvement latéral de la grille lorsqu’elle est immergée dans l’eau pour éviter d’endommager les carrés de la grille (CRITIQUE).
  2. Placez les grilles sur une lamelle propre, côté MMA/graphène vers le haut, et séchez à l’air libre pendant 1 à 2 min. Transférez les grilles revêtues de graphène/MMA sur une plaque chauffante réglée à 130 °C à l’aide d’une pince à épiler à pointe plate.
  3. Couvrir avec le dessus d’une boîte de Pétri en verre et incuber pendant 20 min. Retirer du feu et laisser refroidir à température ambiante pendant 1 à 2 min.
    ATTENTION : Faites preuve de prudence car le dessus de la boîte de Pétri sera extrêmement chaud.

8. Dissoudre le MMA avec de l’acétone

  1. Transférer la lamelle entière dans une boîte de Pétri remplie de 15 mL d’acétone. Incuber pendant 30 min.
  2. À l’aide d’une pipette sérologique en verre propre, transférez l’acétone, dans laquelle les grilles ont été incubées, dans un conteneur à déchets. Ajouter délicatement 15 mL d’acétone fraîche dans la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette sérologique en verre propre. Incuber pendant 30 min.
  3. Répétez ces étapes de lavage pour un total de 3 lavages à l’acétone.

9. Élimination de l’acétone résiduelle avec de l’isopropanol

  1. Après 3 lavages à l’acétone, retirer l’acétone et la remplacer par 15 mL d’isopropanol à l’aide d’une pipette sérologique en verre propre. Incuber pendant 20 min.
  2. Répétez 3 fois pour un total de 4 lavages à l’isopropanol. Retirez délicatement les grilles de l’isopropanol et séchez-les à l’air libre sur une lamelle propre à l’aide d’une pince à épiler.
    REMARQUE : L’isopropanol résiduel peut rendre difficile le détachement des grilles de la pince à épiler. Le contact entre la grille et la lamelle propre avant de libérer la grille de la pince à épiler peut atténuer ce problème.
  3. Évaporez les matières organiques résiduelles en transférant la lamelle avec des grilles recouvertes de graphène sur une plaque chauffante réglée à 100 °C pendant 10 min. Laisser refroidir à température ambiante et conserver sous vide jusqu’à utilisation.

10. Traitement UV/ozone des grilles revêtues de graphène

  1. À l’aide d’une pince à épiler à action inversée, placez délicatement les grilles dans une zone d’éclairage propre d’un nettoyant UV/ozone avec le côté recouvert de graphène vers le haut.
  2. Faites glisser la zone d’éclairage fermée et allumez la machine. Tournez le cadran de l’heure sur le temps de traitement désigné pour commencer le traitement UV/ozone des grilles.
    REMARQUE : La durée du traitement est un paramètre réglable, l’excès de traitement ayant le potentiel d’endommager le réseau. Han et al.30 recommandent 10 min de traitement UV/ozone, et nous avons également trouvé qu’un traitement de 10 min suffisait. Reportez-vous à l’étape 12 pour obtenir des conseils sur le réglage de cette durée de traitement.
  3. Procéder directement à la plongée d’un échantillon cryoEM sur les grilles traitées en suivant les étapes de plongée décrites dans Koh et al.37.
    REMARQUE : Les hydrocarbures atmosphériques peuvent s’accumuler à la surface de la grille après un traitement UV/ozone et augmenter l’hydrophobicité de la surface du graphène38,39. Pour éviter cela, plongez immédiatement les grilles traitées aux UV/ozone. Il peut être avantageux de traiter les grilles par lots, par exemple, en traitant six grilles par UV/ozone et en plongeant immédiatement ces six grilles, puis en traitant les UV/ozone avec un deuxième lot de grilles, suivi de la plongée du deuxième lot.

11. Capture d’une image de diffraction

  1. Assurez-vous que le microscope est bien réglé avec un éclairage parallèle établi et réglez la défocalisation finale à -0,2 μm.
  2. Insérez l’écran fluorescent et le faisceau s’arrête complètement. Passez en mode diffraction pour visualiser clairement les taches de diffraction.
  3. Acquérir une image à l’aide d’une caméra CCD et l’évaluer à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
    NOTE : Les taches de diffraction les plus facilement observables et identifiables générées par une monocouche de graphène sont 6 taches correspondant à une fréquence spatiale de 2,13 Å. Utilisez un outil de mesure pour estimer la distance entre le centre du faisceau diffracté et l’un de ces points de diffraction en unités réciproques. Notamment 2,13 Å Equation 1 0,47 Å-1.

12. Évaluation de l’hydrophilie du réseau

  1. Préparez la configuration de l’imagerie. Localisez un support de téléphone, une surface d’imagerie de table, un téléphone avec appareil photo, une lamelle en verre et un film de paraffine. Les images présentées ici ont été obtenues à l’aide d’un support de téléphone et d’une surface d’imagerie de table qui ont été imprimées en 3D à l’aide des fichiers .stl fournis, ce qui a permis d’obtenir des mesures d’angle de contact plus facilement reproductibles et quantifiables (figure supplémentaire 1A).
  2. Posez une lamelle de verre sur la surface plane, puis découpez un carré de film de paraffine de 1 cm sur 1 cm et placez-le sur la lamelle de verre. Placez le téléphone sur le support du téléphone, en l’orientant de manière à ce que l’appareil photo soit dans le plan de la lamelle en verre. Fixez le téléphone dans cette position à l’aide d’élastiques (Figure supplémentaire 1B). Prenez un exemple de photo pour vérifier que l’appareil photo est aligné avec la surface d’imagerie.
  3. Directement après le traitement UV/ozone des grilles recouvertes de graphène, placez une seule grille sur le carré de film de paraffine sur la lamelle en verre. Assurez-vous que le côté graphène est orienté vers le haut. Ajoutez une goutte d’eau de 2 μL au centre de la surface de la grille à l’aide d’une pipette et prenez immédiatement une photo.
    REMARQUE : Répétez cette étape après : i) les intervalles souhaités de traitement UV/ozone pour déterminer une durée suffisante de traitement ; ou ii) les intervalles de temps souhaités après le traitement UV/ozone pour mesurer combien de temps après le traitement, la surface du réseau conserve son caractère hydrophile.
  4. Calculez les angles de contact à partir de photos en les important dans ImageJ43 et en utilisant le plug-in d’angle de contact.

13. Analyse d’une seule particule de l’ensemble de données complexes dCas9

REMARQUE : Tous les traitements d’image décrits dans ce protocole ont été effectués à l’aide de cryoSPARC version 4.2.1.

  1. Prétraitez les films à l’aide des tâches de correction de mouvement de patch et d’estimation CTF de patch. Effectuez le prélèvement de particules à l’aide du travail de sélection d’objets blob, à l’aide d’un objet blob sphérique dont le diamètre est compris entre 115 Å et 135 Å.
  2. Extrayez les particules à l’aide de la tâche Extraire à partir de micrographies, à l’aide du coefficient de corrélation normalisé (NCC) et des seuils de puissance, ce qui donne environ 200 à 300 particules par micrographie. Notez que les seuils appropriés et le nombre de particules qui en résulte peuvent varier, et que les utilisateurs doivent inspecter la qualité du prélèvement à l’aide d’une gamme de micrographies pour identifier les conditions appropriées.
  3. Effectuez des reconstructions initiales multiclasses à l’aide de la tâche de reconstruction Ab-initio, nécessitant trois classes. Deux des trois classes contiendront probablement des particules autres que le Cas9, y compris des contaminants de surface. Sélectionnez la classe ressemblant à dCas9 pour un traitement ultérieur.
    REMARQUE : Des cycles supplémentaires de reconstruction Ab-initio multiclasse ou d’affinement hétérogène peuvent être appliqués pour affiner davantage la pile de particules.
  4. Effectuez un affinement 3D à l’aide de la tâche Affinement non uniforme en sélectionnant les paramètres par défaut. Estimez la résolution de la reconstruction à l’aide des tâches de validation (FSC) et de ThreeDFSC, en utilisant les cartes et le masque de l’affinement 3D final.

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Representative Results

La fabrication réussie de grilles cryoEM recouvertes de graphène à l’aide de l’équipement (Figure 1) et du protocole (Figure 2) décrits ici se traduira par une monocouche de graphène recouvrant les trous de la feuille qui peut être confirmée par son motif de diffraction caractéristique. Pour favoriser l’adsorption des protéines à la surface du graphène, un traitement UV/ozone peut être utilisé pour rendre la surface hydrophile en installant des groupes fonctionnels contenant de l’oxygène. Cependant, les contaminants hydrocarbonés présents dans l’air peuvent s’adsorber sur la surface du graphène dès 5 minutes après le traitement UV/ozone et contrecarrer cet effet38,39. Il est important de noter que la durée du traitement UV/ozone et le temps écoulé entre le traitement et la plongée peuvent affecter la qualité de l’échantillon. Nous démontrons ces effets à l’aide d’une méthode simple d’évaluation du caractère hydrophile de la grille revêtue en fonction de l’angle de contact de la surface (Figure 3 ; voir étape 12).

Pour démontrer l’utilisation de supports de graphène dans la cryoEM à particule unique, nous avons appliqué une endonucléase d’ADN guidée par l’ARN catalytiquement inactive S. pyogenes Cas9 (H10A ; C80S ; Réf. C574S ; H840A)40 en complexe avec l’ARNsg et l’ADN cible sur des grilles recouvertes de graphène, a collecté un ensemble de données cryoEM à partir de ces grilles et a effectué une analyse de particules uniques7. Les grilles recouvertes de graphène contenaient systématiquement ~300 particules par micrographie à un grossissement de 0,654 Å/pix à l’aide d’un microscope de 300 keV équipé d’un détecteur d’électrons directs K3 (Figure 4A-E). Une session de collecte de données de 8 h avec une inclinaison de la platine de +18° a permis d’obtenir 2 963 films et 324 439 particules dans une pile finale. À l’aide de ces particules, nous avons généré une reconstruction 3D qui, après affinement, a donné une carte de densité avec une résolution estimée à 2,7 Å et un échantillonnage angulaire adéquat pour éviter les artefacts anisotropes (Figure 5). Un modèle atomique (PDB 6o0z)41 a été ancré dans cette carte et affiné à l’aide d’ISOLDE42. Les résidus R63-L82 de ce modèle atomique ajusté sont affichés avec la carte de densité cryoEM affinée, mettant en évidence la densité de la chaîne latérale résolue (Figure 5B). En comparant le même échantillon et la même concentration (250 ng/μL) appliqués à des grilles identiques dépourvues de graphène, aucune particule n’a été observée (Figure 4F,G). Cette observation met en évidence l’efficacité du support graphène pour permettre la visualisation de particules provenant d’échantillons à faible concentration.

Figure 1
Figure 1 : Équipement requis. Équipements et outils de laboratoire nécessaires à la fabrication de grilles en graphène selon le protocole détaillé dans cet article. Les articles et leur quantité sont affichés et étiquetés en conséquence. Les réactifs requis qui ne sont pas indiqués comprennent : le graphène CVD, le méthacrylate de méthyle EL-6 (MMA), le persulfate d’ammonium (APS), l’acétone, l’isopropanol, l’éthanol, l’eau de qualité moléculaire. Les instruments requis qui ne sont pas illustrés comprennent : l’enrobeur par essorage, le déchargeur incandescent, la plaque chauffante, le dessiccateur sous vide et le thermomètre. Tous les éléments requis sont détaillés dans le tableau des matériaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma du processus de fabrication de la grille de graphène. Le graphène est recouvert d’une fine couche de méthacrylate de méthyle EL-6 (MMA) à l’aide d’un enrobeur par centrifugation (étape 2). Le graphène du côté opposé de la feuille de cuivre est éliminé par gravure au plasma (étape 3). Le persulfate d’ammonium (APS) est ensuite utilisé pour graver le cuivre (étapes 4 et 5). Le film MMA-graphène est placé sur la surface de la grille (étape 6-7). Enfin, le MMA est dissous lors d’une série de lavages avec des solvants organiques (étapes 8-9). Les étapes indiquées au-dessus des flèches correspondent aux étapes numérotées décrites dans la section protocoles. Cette méthode a été adaptée de Han et al.30. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation de l’hydrophilie de la surface du réseau en fonction de la durée du traitement UV/ozone et du temps écoulé après le traitement. (A) Angles de contact mesurés en fonction de la durée du traitement. La diminution des angles de contact est compatible avec une augmentation de l’hydrophilie (grille non traitée : 78° ; 20 min : 37°). Angles de contact mesurés à l’aide d’ImageJ43. (B) Angles de contact mesurés en fonction du temps, après traitement (0 min : 45° ; 60 min : 74°). La grille mesurée dans le temps post-traitement a été traitée aux UV/ozone pendant 12 min, comme indiqué par un astérisque. Chaque mesure de post-traitement a été effectuée sur la même grille, l’échantillon étant retiré par mèche entre les mesures. On s’attend à ce que les angles de contact spécifiques mesurés varient en fonction des conditions environnementales du laboratoire, et nous recommandons aux utilisateurs d’effectuer des expériences similaires dans leurs laboratoires pour identifier les conditions appropriées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images représentatives de grilles de contrôle recouvertes de graphène et de grilles de contrôle non revêtues. (A-C) Images représentatives de l’atlas, de la grille carrée et des trous en aluminium de grilles de carbone trouées recouvertes de graphène prises sur un microscope de 300 keV équipé d’un détecteur d’électrons directs K3. (D) Micrographie cryoEM de S. pyogenes dCas9 en complexe avec l’ARNsg et l’ADN cible (complexe à une concentration de 250 ng/μL) sur une grille de carbone trouée recouverte de graphène. (E) Image de diffraction à partir d’une grille imagée dans des panneaux (A-D). La flèche orange indique une position correspondant à une fréquence spatiale de 2,13 Å. Un échantillon identique à celui du panneau (D) a été appliqué à (F) un traitement UV/ozone et (G) à des grilles de carbone trouées déchargées de lueur sans graphène. Les micrographies cryoEM affichées sont représentatives de chaque grille et ne montrent aucune particule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Reconstruction cryoEM d’un complexe Cas9 à partir de grilles recouvertes de graphène. (A) Carte de densité CryoEM à partir de la reconstruction 3D du dCas9 de S. pyogenes en complexe avec l’ARNsg et l’ADN cible. (B) Les résidus R63-L82 d’un modèle ajusté sont représentés dans la densité cryoEM semi-transparente, avec un sous-ensemble de chaînes latérales visibles étiquetées. (C) Courbes de corrélation de coquille de Fourier (FSC) des cartes non masquées, lâches et étroitement masquées. (D) Histogramme et tracé directionnel FSC basé sur la méthode 3DFSC23. Pour plus d’informations, reportez-vous à la figure supplémentaire 2 et à l’étape 13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Support d’imagerie à angle de contact. (A) Un support de caméra imprimé en 3D et un support d’imagerie de table pour fixer la caméra dans une position qui aligne la caméra dans le plan avec la lamelle. (B) La grille est placée sur la lamelle au-dessus d’un morceau carré de film de paraffine de 1 cm x 1 cm. La monture d’imagerie représentée a été imprimée en 3D à l’aide des fichiers .stl fournis (Fichier de codage supplémentaire 1 et Fichier de codage supplémentaire 2) et peut être facilement modifiée pour s’adapter à la plupart des appareils. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Flux de travail de traitement d’image. Workflow de traitement pour le complexe dCas9. Les noms des tâches, les détails de la tâche et les paramètres autres que ceux par défaut (en italique) sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1 : Des fichiers CAO stéréolithographiques au format STL sont fournis pour faciliter l’impression 3D du pied de caméra (camera_stand_v1.stl). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 2 : Des fichiers CAO stéréolithographiques au format STL sont fournis pour faciliter l’impression 3D de la monture d’imagerie de table (slide_mount_v1.stl) et Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La préparation d’échantillons cryoEM implique une multitude de défis techniques, la plupart des flux de travail exigeant des chercheurs qu’ils manipulent manuellement des grilles fragiles avec un soin extrême pour éviter de les endommager. De plus, l’aptitude d’un échantillon à la vitrification est imprévisible ; Les particules interagissent souvent avec l’interface air-eau ou avec la feuille de support solide qui recouvre les grilles, ce qui peut conduire les particules à adopter des orientations préférées ou à ne pas pénétrer dans les trous d’imagerie, à moins que des concentrations de protéines très élevées ne soient appliquées24. La superposition de grilles cryoEM trouées avec une monocouche continue de graphène s’est avérée extrêmement prometteuse pour améliorer la distribution des particules sur les micrographies, augmenter le nombre de particules à de faibles concentrations et réduire les orientations préférées induites par les interactions à l’interface air-eau30.

L’une des limites des protocoles de revêtement de graphène existants pour les grilles cryoEM est les nombreuses manipulations manuelles requises pour le processus de revêtement, qui peuvent compromettre la qualité et augmenter la variabilité d’une grille à l’autre. Dans ce travail, nous décrivons de légères modifications d’un protocole existant pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène30.

Les étapes critiques de ce protocole comprennent le revêtement du graphène CVD avec du MMA, la dissolution du substrat de graphène cuivre CVD dans l’APS et l’application de graphène aux grilles cryoEM. Nous avons modifié le protocole d’origine pour minimiser les manipulations manuelles des grilles revêtues en échangeant les solvants dans la même boîte de Pétri, au lieu de manipuler et de transférer individuellement les grilles dans un nouveau récipient de solvant pour chaque étape de lavage, dans le but d’augmenter le rendement des grilles intactes, de haute qualité et revêtues de graphène. Bien que nous nous soyons efforcés de réduire au minimum les manipulations de grilles recouvertes de graphène, nous reconnaissons que l’application manuelle de carrés de graphène individuels sur les grilles cryoEM est intrinsèquement difficile et qu’une certaine variabilité d’une grille à l’autre est attendue.

Les grilles recouvertes de graphène nécessitent généralement un traitement UV/ozone pour rendre la surface hydrophile pour l’application de l’échantillon. La durée du traitement UV/ozone et le temps écoulé après le traitement et avant la plongée peuvent avoir un impact sur l’hydrophilie du réseau et, en fin de compte, sur la qualité de l’échantillon. En plus du protocole de fabrication de la grille, nous décrivons une technique d’évaluation de l’hydrophilie de la grille suite à un traitement UV/ozone. Dans le procédé, l’angle de contact de surface d’un échantillon appliqué est utilisé comme indicateur du caractère hydrophile de la grille revêtue20,44. Des conceptions sont fournies pour imprimer en 3D à peu de frais un support d’imagerie de grille personnalisé qui utilise un simple appareil photo de téléphone portable pour estimer l’angle de contact de la surface.

Enfin, nous décrivons les résultats obtenus en utilisant ce protocole pour déterminer la structure cryoEM de 2,7 Å de l’endonucléase d’ADN guidée par l’ARN catalytiquement inactive, S. pyogenes Cas9 en complexe avec l’ARNsg et l’ADNcible 40. En l’absence de graphène, aucune particule n’a été observée dans les trous de feuille aux concentrations complexes utilisées (250 ng/μL). En revanche, les grilles recouvertes de graphène transportent des particules à haute densité, ce qui permet une reconstruction 3D facile d’une carte haute résolution à partir de 2 961 micrographies. Prises ensemble, ces données mettent en évidence l’intérêt d’appliquer des monocouches de graphène aux grilles cryoEM pour l’analyse de particules uniques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Acknowledgments

Des échantillons ont été préparés et imagés à l’installation CryoEM du MIT.nano sur des microscopes acquis grâce à la Fondation Arnold et Mabel Beckman. Des appareils d’imagerie d’angle de contact ont été imprimés au MIT Metropolis Maker Space. Nous remercions les laboratoires de Nieng Yan et Yimo Han, ainsi que le personnel de MIT.nano pour leur soutien tout au long de l’adoption de cette méthode. Nous remercions tout particulièrement les Drs Guanhui Gao et Sarah Sterling pour leurs discussions et leurs commentaires perspicaces. Ce travail a été soutenu par les subventions R01-GM144542, 5T32-GM007287 des NIH et les subventions NSF-CAREER 2046778. La recherche dans le laboratoire de Davis est soutenue par la Fondation Alfred P. Sloan, le Fonds James H. Ferry, la J-Clinic du MIT et la famille Whitehead.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216

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Biochimie Numéro 201
Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution
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Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).

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