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Determinazione di 45 pesticidi nelle varietà di avocado mediante il metodo QuEChERS e gascromatografia-spettrometria di massa tandem

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/66082
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2,3
1Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ingeniería, Universidad EAN, 2Departamento de Química, Unidad Departamental de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de La Laguna (ULL), 3Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Universidad de La Laguna (ULL)

Summary

Il presente protocollo descrive l'analisi di residui di pesticidi multiclasse nelle varietà di avocado utilizzando il metodo Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) con formiato di ammonio, seguito da gascromatografia-spettrometria di massa tandem.

Abstract

La gascromatografia (GC) e la spettrometria di massa tandem (MS/MS) sono uno strumento analitico preminente ampiamente impiegato per la sorveglianza dei residui di pesticidi negli alimenti. Tuttavia, questi metodi sono vulnerabili agli effetti matrice (ME), che possono potenzialmente influire su una quantificazione accurata a seconda della specifica combinazione di analita e matrice. Tra le varie strategie per mitigare le ME, la calibrazione a matrice abbinata rappresenta l'approccio prevalente nelle applicazioni di residui di pesticidi grazie alla sua efficacia in termini di costi e alla semplice implementazione. In questo studio, un totale di 45 pesticidi rappresentativi sono stati analizzati in tre diverse varietà di avocado (ad esempio, Criollo, Hass e Lorena) utilizzando il metodo Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) con formiato di ammonio e GC-MS/MS.

A tale scopo, sono stati estratti 5 g del campione di avocado con 10 ml di acetonitrile, quindi sono stati aggiunti 2,5 g di formiato di ammonio per indurre la separazione di fase. Successivamente, il surnatante è stato sottoposto a un processo di purificazione mediante estrazione dispersiva in fase solida utilizzando 150 mg di MgSO4 anidro, 50 mg di ammina primaria-secondaria, 50 mg di ottadecilsilano, 10 mg di nerofumo grafitato e 60 mg di un assorbente a base di ossido di zirconio (Z-Sep+). L'analisi GC-MS/MS è stata eseguita con successo in meno di 25 minuti. Sono stati condotti rigorosi esperimenti di convalida per valutare le prestazioni del metodo. L'esame di una curva di calibrazione a matrice per ciascuna varietà di avocado ha rivelato che l'EM è rimasto relativamente costante e inferiore al 20% (considerato come un ME morbido) per la maggior parte delle combinazioni di pesticidi/varietà. Inoltre, i limiti di quantificazione del metodo erano inferiori a 5 μg/kg per tutte e tre le varietà. Infine, i valori di recupero per la maggior parte dei pesticidi sono rientrati nell'intervallo accettabile del 70-120%, con valori di deviazione standard relativi inferiori al 20%.

Introduction

Nell'analisi chimica, l'effetto matrice (ME) può essere definito in vari modi, ma una definizione generale ampiamente accettata è la seguente: si riferisce alla variazione del segnale, in particolare a una variazione della pendenza della curva di calibrazione quando la matrice del campione o parte di essa è presente durante l'analisi di uno specifico analita. Come aspetto critico, la ME richiede un'indagine approfondita durante il processo di convalida di qualsiasi metodo analitico, in quanto influisce direttamente sull'accuratezza della misurazione quantitativa per gli analiti target1. Idealmente, una procedura di pretrattamento del campione dovrebbe essere sufficientemente selettiva da evitare l'estrazione di componenti dalla matrice del campione. Tuttavia, nonostante gli sforzi significativi, nella maggior parte dei casi molti di questi componenti della matrice finiscono ancora nei sistemi di determinazione finale. Di conseguenza, tali componenti della matrice spesso compromettono i valori di recupero e precisione, introducono ulteriore rumore e aumentano il costo complessivo e la manodopera coinvolti nel metodo.

Nella gascromatografia (GC), la ME si verifica a causa della presenza di siti attivi all'interno del sistema GC, che interagiscono con gli analiti target attraverso vari meccanismi. Da un lato, i costituenti della matrice bloccano o mascherano questi siti attivi che altrimenti interagirebbero con gli analiti target, con conseguente frequente aumento del segnale2. D'altra parte, i siti attivi che rimangono non ostruiti possono causare il picco di coda o la decomposizione dell'analita a causa di forti interazioni, portando a una ME negativa. Tuttavia, questo può offrire potenziali benefici in alcuni casi2. È fondamentale sottolineare che raggiungere la completa inerzia in un sistema GC è estremamente impegnativo, nonostante l'utilizzo di componenti altamente inerti e una corretta manutenzione. Con l'uso continuo, l'accumulo di componenti della matrice nel sistema GC diventa più pronunciato, causando un aumento della ME. Al giorno d'oggi, è ampiamente riconosciuto che gli analiti contenenti ossigeno, azoto, fosforo, zolfo ed elementi simili, mostrano una ME maggiore in quanto interagiscono facilmente con questi siti attivi. Al contrario, composti altamente stabili come gli idrocarburi o gli organoalogenati non subiscono tali interazioni e non mostrano ME osservabile durante l'analisi 2,3.

Nel complesso, la ME non può essere completamente eliminata, portando allo sviluppo di diverse strategie per la compensazione o la correzione quando la rimozione completa dei componenti della matrice non è fattibile. Tra queste strategie, l'utilizzo di standard interni deuterati (IS), protettivi dell'analita, calibrazione a matrice, il metodo di aggiunta di standard o la modifica delle tecniche di iniezione sono stati documentati nella letteratura scientifica 1,2,4,5. Anche le linee guida SANTE/11312/2021 hanno raccomandato queste strategie6.

Per quanto riguarda l'applicazione della calibrazione a matrice abbinata per compensare gli EM, le sequenze di campioni in situazioni pratiche comprendono diversi tipi di alimenti o vari campioni della stessa merce. In questo caso, si presume che l'impiego di qualsiasi campione della stessa merce compenserà efficacemente la ME in tutti i campioni. Tuttavia, nella letteratura esistente mancano studi sufficienti che indaghino specificamente questo problema7.

La determinazione multiresiduo di pesticidi in matrici contenenti una percentuale apprezzabile di grasso e pigmenti costituisce un compito impegnativo. La notevole quantità di materiale coestratto può influire in modo significativo sull'efficienza dell'estrazione e interferire con la successiva determinazione cromatografica, danneggiando potenzialmente la colonna, la sorgente e il rivelatore e determinando ME significativi 8,9,10. Di conseguenza, l'analisi dei pesticidi a livelli di tracce in tali matrici richiede una riduzione significativa dei componenti della matrice prima dell'analisi, garantendo al contempo elevati valori di recupero7. Ottenere elevati valori di recupero è fondamentale per garantire che le analisi dei pesticidi rimangano affidabili, accurate e conformi agli standard normativi. Ciò è fondamentale per garantire la sicurezza alimentare, la protezione dell'ambiente e un processo decisionale informato in agricoltura e nei settori correlati.

L'avocado è un frutto di alto valore commerciale, coltivato nei climi tropicali e mediterranei di tutto il mondo e ampiamente consumato sia nelle sue regioni di origine che nei numerosi mercati di esportazione. Dal punto di vista analitico, l'avocado è una matrice complessa contenente un numero significativo di acidi grassi (cioè oleico, palmitico e linoleico), simili alle noci, un significativo contenuto di pigmenti, come nelle foglie verdi, oltre a zuccheri e acidi organici, simili a quelli che si trovano in altri frutti11. A causa della sua natura grassa, è necessario prestare particolare attenzione quando si utilizza qualsiasi metodo analitico per l'analisi. Sebbene l'analisi dei residui di pesticidi sia stata condotta sugli avocado utilizzando GC-MS in alcuni casi 8,12,13,14,15,16,17,18,19,20, è stata relativamente meno frequente rispetto ad altre matrici. Nella maggior parte dei casi, è stata applicata una versione del metodo Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) 8,12,13,14,15,16,17,18. Nessuno di questi studi ha indagato la consistenza degli EM tra le diverse varietà di avocado.

Pertanto, lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare la consistenza dei ME e i valori di recupero per 45 pesticidi rappresentativi in diverse varietà di avocado (ad esempio, Criollo, Hass e Lorena) utilizzando il metodo QuEChERS con formiato di ammonio e GC-MS/MS. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che questo tipo di studio è stato condotto su tali campioni di matrice grassa.

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Protocol

1. Preparazione dell'impasto e soluzioni di lavoro

NOTA: Per motivi di sicurezza, si consiglia di indossare guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza per tutta la durata del protocollo.

  1. Preparare soluzioni madre individuali di ciascuno dei 45 standard commerciali di pesticidi (vedere la Tabella dei materiali) a circa 1.000 mg/L in acetonitrile in matracci tarati da 10 mL.
  2. Combinare le singole soluzioni madre di cui sopra per preparare una soluzione madre da 400 mg/L in acetonitrile in un matraccio tarato da 25 mL.
    NOTA: Questa soluzione miscelata verrà utilizzata per preparare le soluzioni di lavoro per gli esperimenti di recupero e calibrazione.
  3. Preparare soluzioni madre di atrazina-d5 e trifenil fosfato (TPP) a concentrazioni di 750 mg/L e 1.050 mg/L, rispettivamente, in acetonitrile in matracci tarati da 10 mL. Utilizzare l'atrazina-d5 come standard interno procedurale (P-IS) e il TPP come standard interno di iniezione (I-IS).
    NOTA: Lo scenario ideale prevede l'utilizzo di uno standard interno marcato isotopicamente per ogni specifico analita target.
  4. Preparare soluzioni di recupero madre in acetonitrile contenenti lo 0,05% (v/v) di acido formico (per prevenire la degradazione) in matracci tarati da 10 mL per produrre separatamente 10, 100 e 400 μg/kg equivalenti di campione per i pesticidi e 200 μg/kg per i P-IS. Conservare queste soluzioni in flaconcini di vetro ambrato al buio a -20 °C.
  5. Preparare le soluzioni di calibrazione dei pesticidi e dei P-IS insieme in acetonitrile con lo 0,05% (v/v) di acido formico in matracci tarati da 10 mL per ottenere rispettivamente 5, 10, 25, 75, 200, 400 e 600 μg/kg e 200 ng/ng e conservarle in fiale di vetro ambrato al buio a -20 °C.
    NOTA: Le stesse soluzioni possono essere utilizzate durante tutto il lavoro sperimentale, ma è essenziale conservarle nelle condizioni specificate immediatamente dopo ogni utilizzo.
  6. Preparare una miscela di protettivi dell'analita contenente 100 g/L di 3-etossi-1,2-propandiolo, 10 g/L di acido L-gulonico γ-lattone, 10 g/L di D-sorbitolo e 5 g/L di acido shikimico in un rapporto 4/1 (v/v) di acetonitrile/acqua con lo 0,5% (v/v) di acido formico.
    NOTA: Questa miscela di protettivi dell'analita deve essere aggiunta appena prima dell'iniezione per mitigare la ME.

2. Raccolta dei campioni

  1. Raccogli campioni da tre specie di avocado (ad esempio, Criollo, Hass e Lorena) disponibili nei supermercati. Assicurarsi che ogni campione pesi circa 1 kg, che è sufficiente per condurre tutti gli studi successivi e sia in linea con la Direttiva 2002/63/CE21.
    NOTA: I campioni organici sono stati selezionati in via preferenziale per ridurre al minimo la probabilità della presenza di residui di pesticidi.
  2. Trasporta i campioni di avocado raccolti in laboratorio e omogeneizzali singolarmente senza il tubo utilizzando un tritatutto (vedi Tabella dei materiali). Conservare i campioni omogeneizzati in contenitori di vetro ambrato a 4 °C fino all'analisi.
    NOTA: Gli stessi campioni di avocado verranno utilizzati durante l'intero studio. Pertanto, è fondamentale conservarli nelle condizioni specificate immediatamente dopo ogni utilizzo.

3. Preparazione del campione utilizzando il metodo QuEChERS con formiato di ammonio

NOTA: La Figura 1 illustra una rappresentazione schematica del metodo QuEChERS con formiato di ammonio.

  1. Pesare 5 g di ciascun campione di avocado in una provetta da centrifuga da 50 ml (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Aggiungere 50 μl della soluzione di P-IS per ottenere una concentrazione di 200 μg/kg. Per la valutazione del recupero, aggiungere anche le soluzioni di pesticidi preparate al punto 1.4 per ottenere concentrazioni di 10, 100 e 400 μg/kg (n = 5 ciascuna).
  3. Agitare il tubo per 30 s per garantire una completa integrazione della punta nel campione.
  4. Aggiungere 10 mL di acetonitrile alla provetta da centrifuga. Agitare il tubo a 70 giri/min per 5 minuti.
  5. Aggiungere 2,5 g di formiato di ammonio, agitare nuovamente la provetta a 70 giri/min per 5 minuti e successivamente centrifugarla a 1.800 × g per 5 minuti.
  6. A una provetta da centrifuga da 2 mL contenente 150 mg di MgSO4 anidro, 50 mg di ammina primaria-secondaria (PSA), 50 mg di ottadecilsilano (C18), 10 mg di nerofumo grafitato (GCB) e 60 mg di un sorbente Z-Sep+ a base di ossido di zirconio, aggiungere 1 mL di estratto per la purificazione mediante estrazione in fase solida dispersiva (d-SPE). Agitare la provetta per 30 s e centrifugarla a 1.800 × g per 5 min.
  7. Trasferire 200 μl di estratto in una fiala dell'autocampionatore, aggiungere 20 μl della soluzione protettiva dell'analita preparata al punto 1.6 e includere 50 μl della soluzione TPP.
  8. Eseguire l'analisi strumentale utilizzando un sistema GC-MS/MS (vedere la sezione 4).
  9. Eseguire la calibrazione con matrice corrispondente seguendo la stessa procedura descritta sopra, utilizzando estratti in bianco, ad eccezione del fatto che, durante la fase d-SPE (fase 3.6), pulire 5 mL di surnatante in provette da 15 mL. Aggiungere le soluzioni spike e P-IS al passaggio 3.7. Aggiungere le soluzioni standard di calibrazione alle fiale dell'autocampionatore per ottenere 5, 10, 25, 50, 100, 200, 400 e 600 μg/kg, insieme al TPP, ottenendo un volume finale di 270 μl.
    NOTA: Nel complesso, assicurati di costruire curve di calibrazione corrispondenti alla matrice per ciascuna varietà di avocado più le calibrazioni solo acetonitrile.

4. Analisi strumentale mediante GC-MS/MS

  1. Condurre le analisi utilizzando un sistema GC-MS/MS a triplo quadrupolo (TQ) dotato di un'interfaccia a ionizzazione elettronica (-70 eV) e di un autocampionatore (vedi Tabella dei materiali).
  2. Utilizzare una colonna MS GC (legame di silice di 30 m di lunghezza, diametro interno di 0,25 mm, spessore del film di 0,25 μm) insieme ad elio ad altissima purezza come gas di trasporto a una portata costante di 1,2 mL/min.
  3. Verificare i seguenti parametri prima di procedere con il funzionamento dell'apparecchiatura:
    1. Assicurarsi che le pressioni del gas siano corrette: elio a 140 psi e argon a 65 psi.
    2. Controllare le condizioni dell'olio della pompa rotativa per assicurarsi che sia limpido e al livello appropriato.
    3. Assicurarsi che la siringa per iniezione non presenti ostruzioni dovute a iniezioni precedenti.
    4. Verificare che le fiale di lavaggio contengano un volume sufficiente di ciascun solvente.
    5. Verificare che il contatore dei materiali di consumo (setto, rivestimento) non abbia raggiunto il limite.
  4. Accendere l'interruttore GC principale situato sul pannello frontale e accendere l'interruttore MS situato sul retro.
  5. Apri il software GCMS Real Time Analysis che controlla tutti i parametri del sistema GC-MS/MS.
    NOTA: Il sistema di strumenti include il software di analisi in tempo reale GCMS per impostazione predefinita.
  6. Fare clic su Controllo del vuoto | Avanzato | Pompa rotativa 1 per avviare il sistema del vuoto.
    NOTA: In questa finestra, monitorare la pressione per determinare i valori di vuoto ottimali, che dovrebbero essere inferiori a 9.0 Pa. Ci vorranno circa 12 ore.
  7. Fare clic su Avvia per attivare la pompa turbomolecolare 1 e la pompa turbomolecolare 2.
  8. Fare clic su Avvia per l'opzione Riscaldatore sorgente ionica .
    NOTA: Dopo un tempo consigliato di 1 ora, controllare il vuoto del sistema per confermare che il valore consigliato sia inferiore a 1.6e-3 Pa.
  9. Impostare la temperatura dell'interfaccia MS a 250 °C e la temperatura della sorgente ionica a 300 °C.
  10. Mantenere il forno GC a una temperatura iniziale di 50 °C per 1 minuto, quindi aumentare la velocità fino a 180 °C a una velocità di 25 °C/min. Successivamente, aumentare la temperatura a 230 °C a 5 °C/min e poi a 290 °C a 25 °C/min. Infine, mantenere la temperatura costante a 290 °C per 6 min. Il tempo totale di analisi è di 24,6 minuti.
  11. Fare clic su Chiudi una volta attivati tutti questi sistemi.
  12. Fare clic sull'opzione Tuning dal software di analisi e fare clic su Peak Monitor View per eseguire una verifica iniziale delle condizioni dello spettrometro di massa.
    NOTA: Se necessario, eseguire l'autotuning.
  13. Fare clic su Acquisizione e, dalla finestra visualizzata, fare clic su Scarica parametri iniziali. Verificare che l'apparecchiatura sia pronta GC e MS.

5. Acquisizione dati

  1. Fare clic su Nuovo file batch dal software e creare una sequenza contenente informazioni come il nome del campione, l'ID del campione, il file del metodo, il file di dati, il volume di iniezione e il file di ottimizzazione. Aggiungi le righe necessarie e fai clic su Salva.
  2. Fare clic su Batch Start e avviare il processo di iniezione.
  3. Eseguire l'iniezione a 250 °C in modalità splitless, mantenendo un volume di iniezione di 1 μL. Dopo 1 minuto dall'iniezione, aprire la fessura.
    NOTA: Tra un'iniezione e l'altra, assicurarsi di pulire la siringa da 10 μl con metanolo, acetato di etile e acetonitrile, utilizzando un singolo risciacquo con ciascun solvente. Tutte le iniezioni vengono eseguite in triplice copia.
  4. Analizzare gli analiti utilizzando la modalità di monitoraggio a reazione multipla (MRM), che è la modalità standard impiegata nei sistemi MS/MS con TQ.
    NOTA: La Tabella 1 fornisce i tempi di ritenzione (in min) e le transizioni di quantificatore e qualificatore per i pesticidi multiclasse, P-IS e I-IS. L'analisi quantitativa si basa sul rapporto tra l'area del picco dello ione di quantificazione e lo ione P-IS. L'I-IS viene utilizzato per il controllo di qualità durante l'iniezione. Il file supplementare 1 contiene i cromatogrammi per tutti i 45 pesticidi analizzati.
  5. Aprire il software Postrun Analysis per l'analisi dei dati.
    NOTA: Per impostazione predefinita, il sistema dello strumento include il software GCMS Postrun Analysis.
  6. Cliccare sull'iniezione da analizzare, navigare nella tabella contenente gli analiti e selezionare il picco di interesse.
  7. Fare clic sul picco o sulla regione di interesse per visualizzare il cromatogramma. Esaminare le integrazioni di picco e, se necessario, eseguire l'integrazione manuale. Verificare le aree di tutti gli analiti per eseguire i calcoli necessari e la valutazione del metodo.

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Representative Results

La convalida completa del metodo analitico è stata condotta secondo le linee guida SANTE/11312/20216, che comprendono valutazioni di linearità, ME, recupero e ripetibilità.

Per la valutazione della linearità, sono state costruite curve di calibrazione abbinate a matrice utilizzando campioni bianchi con punte a diversi livelli di concentrazione (da 5 a 600 μg/kg). I coefficienti di determinazione (R2) per la maggior parte dei pesticidi selezionati sono risultati superiori o uguali a 0,99, indicando una relazione altamente lineare tra concentrazione e risposta. È stato scelto il livello di taratura più basso (LCL) di 5 μg/kg, rispettando il limite massimo di residui (LMR) stabilito di 10 μg/kg ai fini del monitoraggio degli alimenti22.

Per valutare la ME, le pendenze delle curve di calibrazione dei pesticidi multiclasse sono state confrontate tra il solvente puro e le condizioni di calibrazione abbinate alla matrice. A titolo di esempio illustrativo, la Figura 2 mostra il confronto tra le curve nel solvente e ciascuna delle tre matrici per il carbofurano. La ME è stata calcolata utilizzando l'equazione (1)7, ottenendo percentuali che indicano l'aumento del segnale (percentuali positive) o la soppressione del segnale (percentuali negative).

Effetto matrice (%) = Equation 1 (1)

Il sistema di classificazione ME presentato, basato su intervalli percentuali, fornisce informazioni sull'impatto della matrice sui segnali dei pesticidi, aiutando nell'interpretazione dei risultati analitici. In tutti i casi per il carbofurano è stata ottenuta una ME positiva superiore al 20%. Tuttavia, i risultati della generazione di curve di calibrazione a matrice hanno rivelato una ME relativamente costante inferiore al 20% (classificata come ME morbida) per la maggior parte delle combinazioni di pesticidi/varietà (vedi Tabella 2 e Figura 3).

Per valutare l'accuratezza e la ripetibilità dell'analisi, i campioni bianchi sono stati addizionati con pesticidi a tre diversi livelli di concentrazione (10, 100 e 400 μg/kg; n = 5 per ogni concentrazione). I risultati nella Figura 4 dimostrano il conteggio dei pesticidi le cui percentuali medie di recupero erano comprese tra il 70 e il 120% per ciascun tipo di avocado. Inoltre, la Tabella 3 presenta dati dettagliati per tutti i valori specifici ottenuti. Una percentuale significativa dei pesticidi testati ha mostrato percentuali di recupero che rientrano nell'intervallo specifico, con valori di deviazione standard relativa (RSD) inferiori al 20%.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo QuEChERS con formiato di ammonio impiegato per l'estrazione di residui di pesticidi da campioni di avocado. Abbreviazioni: QuEChERS = Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe; IS = standard interno; PSA = ammina primaria-secondaria; GCB = nerofumo grafitato; QC = controllo qualità; GC-MS/MS = gascromatografia-spettrometria di massa tandem. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Confronto delle curve di calibrazione nel solvente e nelle matrici per il carbofurano. Solvente: y = 0,0028x - 0,0054 e R2 = 0,9974; Criollo: y = 0,0050x + 0,0050, R2 = 0,9994 e ME = 80%; Hass: y = 0,0037x - 0,0109, R2 = 0,9977 e ME = 30%; Lorena: y = 0,0041x + 0,0053, R2 = 0,9998 e ME = 42%. Abbreviazioni: ME = effetto matrice; P-IS = standard procedurale interno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Numero di pesticidi selezionati classificati in base ai rispettivi intervalli di ME per le varietà di avocado. La classificazione della ME si basa su tre categorie: morbida (valori compresi tra -20% e 20%), media (valori compresi tra -20% e -50% o tra 20% e 50%) e forte (valori superiori al 50% o inferiori a -50%). Abbreviazione: ME = effetto matrice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Il numero di pesticidi che rientrano nell'intervallo di recupero accettabile è stato di 10, 100 e 400 μg/kg (n = 15) nelle tre varietà di avocado. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Tabella 1: Tempi di ritenzione, transizioni di quantificatori e qualificatori utilizzati nelle analisi GC-MS/MS dei pesticidi selezionati, insieme a P-IS e I-IS. Abbreviazioni: P-IS = standard procedurale interno; I-IS = standard interno di iniezione; GC-MS/MS = gascromatografia-spettrometria di massa tandem; HCB = esaclorobenzene; α-HCH = alfa-esaclorocicloesano; β-HCH = beta-esaclorocicloesano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetilene; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = trifenil fosfato; EPN = etilnitrofenil fenilfosfonotioato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Valori dell'effetto matrice (%) per i pesticidi selezionati in diverse varietà di avocado durante la convalida del metodo analitico finale. Abbreviazioni: HCB = esaclorobenzene; α-HCH = alfa-esaclorocicloesano; β-HCH = beta-esaclorocicloesano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetilene; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = trifenil fosfato; EPN = etilnitrofenil fenilfosfonotioato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Valori di recupero e le corrispondenti RSD tra parentesi (n = 5 per ogni livello di picco), entrambi in %, per i pesticidi selezionati in diverse varietà di avocado durante la convalida del metodo analitico finale. Abbreviazioni: RSDs = deviazioni standard relative; HCB = esaclorobenzene; α-HCH = alfa-esaclorocicloesano; β-HCH = beta-esaclorocicloesano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetilene; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = trifenil fosfato; EPN = etilnitrofenil fenilfosfonotioato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Spettri di spettrometria di massa di tutti i pesticidi. Abbreviazioni: HCB = esaclorobenzene; α-HCH = alfa-esaclorocicloesano; β-HCH = beta-esaclorocicloesano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetilene; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; EPN = etilnitrofenil fenilfosfonotioato. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

La limitazione principale associata alla calibrazione con corrispondenza a matrice deriva dall'uso di campioni bianchi come standard di calibrazione. Ciò comporta un aumento del numero di campioni da elaborare per l'analisi e una maggiore iniezione di componenti della matrice in ciascuna sequenza analitica, con potenziali esigenze di manutenzione dello strumento. Tuttavia, questa strategia è più adatta dell'addizione standard, che genererebbe un numero molto maggiore di campioni da iniettare a causa della necessità di eseguire una curva di calibrazione per ogni campione. Di conseguenza, in entrambi i casi, è necessario l'uso di tecniche di preparazione del campione che riducano al minimo tale co-estrazione, pur rimanendo convenienti, veloci e affidabili. In questo contesto, il metodo QuEChERS ha dimostrato la sua utilità nell'analisi dei residui di pesticidi in campioni di avocado 8,12,13,14,15,16,17,18. Tuttavia, nessuno di questi approcci ha esplorato l'applicazione del metodo QuEChERS che impiega il formiato di ammonio. Questa scelta mira a mitigare gli svantaggi dell'utilizzo di sali di magnesio e sodio nell'analisi MS 23,24,25,26,27. Sia i sali di magnesio che quelli di sodio hanno basse pressioni di vapore che hanno la propensione a formare depositi solidi sulle superfici all'interno della sorgente MS, che possono potenzialmente influire sulle prestazioni dello strumento. Sebbene questo fenomeno si verifichi nei sistemi di cromatografia liquida (LC), pone anche sfide nel contesto della GC, dove queste possono accumularsi nel rivestimento di ingresso, richiedendo sostituzioni più frequenti del rivestimento27. Per superare queste limitazioni e migliorare la compatibilità con la rilevazione della MS, è stata implementata la sostituzione di questi sali con alternative altamente volatili. I sali di ammonio sono preferiti in quanto possono essere facilmente evaporati e/o decomposti, superando così gli svantaggi. L'attuale indagine rappresenta il primo caso di utilizzo del metodo QuEChERS che impiega formiato di ammonio per l'analisi dei residui di pesticidi negli avocado. In particolare, il processo di estrazione consisteva nel sottoporre il campione di avocado a una fase di estrazione con acetonitrile, con l'aggiunta di 0,5 g di formiato di ammonio per grammo di campione per facilitare la salatura (Figura 1).

Come seconda fase del metodo QuEChERS, la fase dSPE è fondamentale perché serve a rimuovere i componenti indesiderati della matrice che potrebbero potenzialmente portare a interferenze analitiche26. Tuttavia, il raggiungimento di un efficace passaggio d-SPE richiede spesso una combinazione di vari assorbenti per affrontare i diversi co-estrattivi originati dalla matrice del campione. Quando si tratta di avocado, questo passaggio può includere MgSO4 anidro per rimuovere l'acqua in eccesso e migliorare la ripartizione dei pesticidi, PSA per eliminare acidi grassi, acidi organici e zuccheri, C18 per migliorare la rimozione dei componenti non polari, GCB per la rimozione della clorofilla e materiali di zirconia come Z-Sep+ per eliminare elevate quantità di grasso 15,26,28. Di conseguenza, gli estratti di avocado sono stati trasferiti in provette da centrifuga contenenti quantità specifiche di ciascun assorbente: 150 mg di MgSO4 anidro, 50 mg di PSA, 50 mg di C18, 10 mg di GCB e 60 mg di Z-Sep+ (Figura 1).

Per avviare il processo di convalida che coinvolge le fasi di estrazione e pulizia, le curve di calibrazione sono state esaminate rigorosamente. Ciò ha comportato la valutazione delle curve di calibrazione abbinate alla matrice per ciascuna combinazione di varietà di analita/avocado, oltre alle calibrazioni con solo acetonitrile (Figura 2). In entrambi gli scenari, è stata impiegata una miscela di protettivi dell'analita29 precedentemente proposta, costituita da 3-etossi-1,2-propandiolo, acido L-gulonico γ-lattone, D-sorbitolo e acido shikimico. La valutazione comprendeva la linearità in un intervallo di concentrazione compreso tra 5 e 600 μg/kg. L'LCL di 5 μg/kg scende al di sotto del rigoroso LMR di 10 μg/kg, come stabilito dalle normative internazionali che disciplinano l'analisi dei residui di pesticidi nei prodotti alimentari22. Inoltre, l'LCL di 5 μg/kg ha prodotto un rapporto segnale/rumore superiore a 10 per tutti i pesticidi multiclasse selezionati. È stata inoltre eseguita l'ispezione visiva dei grafici di calibrazione per verificare la precisione dei valori di pendenza utilizzati per il calcolo della ME. I risultati hanno indicato che la maggior parte dei pesticidi selezionati mostrava valori di R2 superiori o uguali a 0,99 in tutte e quattro le curve di calibrazione per ciascuno di essi. La valutazione complessiva dei risultati della calibrazione ha dimostrato l'accuratezza e l'idoneità di queste equazioni per calcoli precisi della ME in ciascuna varietà di avocado.

L'EM è stato determinato come morbido (ME ≤ 20%) per la maggior parte dei pesticidi in ciascuna delle tre varietà di avocado in esame (Tabella 2 e Figura 3). In questo contesto, tre punti chiave meritano di essere evidenziati. In primo luogo, gli estratti del campione finale erano relativamente puliti grazie all'efficacia del protocollo di preparazione del campione implementato, con conseguenti interferenze minime. In secondo luogo, nei sistemi GC, le ME sono soggette alle influenze derivanti dalle interazioni che traspaiono all'interno della matrice e dalle interazioni che si verificano nei siti attivi all'interno del sistema29. La miscela di protettivi dell'analita utilizzata copriva in modo completo quasi l'intero spettro dei pesticidi. Tuttavia, i pesticidi eluiti precocemente (propoxur, dichlorvos, carbofuran e difenilammina), così come quelli eluiti più tardi (piriproxifene, fenvalerato, esfenvalerato e deltametrina), hanno mostrato i valori di ME più alti e meno coerenti. In terzo luogo, considerando queste differenze, si è deciso di utilizzare separatamente la calibrazione a matrice di ciascuna varietà per condurre lo studio di recupero. È importante notare che una varietà può ragionevolmente rappresentare le altre varietà per i pesticidi rimanenti.

La valutazione del recupero e della riproducibilità è stata eseguita a tre diversi livelli di concentrazione (10, 100 e 400 μg/kg) in quintupletto (n = 15). Per raggiungere questo obiettivo, i campioni di avocado sono stati addizionati all'inizio dell'applicazione del metodo QuEChERS. I recuperi sono stati calcolati confrontando i rapporti tra l'area del picco del pesticida e il picco del P-IS (atrazina-d5) ottenuti dalla calibrazione a matrice. Ogni replica è stata iniettata in triplicato all'interno della stessa sequenza per garantire la coerenza. L'uso di un IS marcato isotopicamente consente di compensare le potenziali perdite di pesticidi durante il protocollo, tenendo conto anche degli errori metodologici e della variabilità strumentale. I risultati hanno mostrato che la maggior parte dei pesticidi soddisfaceva i criteri accettabili, con recuperi compresi tra il 70 e il 120% e RSD inferiori al 20% a ciascun livellodi picco 6 (Figura 4), indicando l'efficacia e la ripetibilità del metodo. Tuttavia, alcuni pesticidi hanno mostrato recuperi superiori a questo intervallo accettabile (Tabella 3). Questo è il caso dell'esaclorobenzene (HCB), che mostra recuperi nell'intervallo del 28-55% per tutti i livelli di concentrazione e le matrici. Ciò può essere attribuito alla struttura molecolare planare dell'HCB, che porta a una forte affinità con il GCB, causandone la ritenzione e riducendo l'efficienza di estrazione30. Nonostante i recuperi inferiori per l'HCB e per alcuni altri casi, il metodo ha comunque dimostrato un recupero costante e affidabile per questi pesticidi, con valori di RSD che rimangono al di sotto del limite raccomandato.

In conclusione, l'analisi dei residui di pesticidi nei campioni alimentari incontra la ME, che può influire sull'accuratezza della GC-MS/MS. La calibrazione abbinata alla matrice si rivela una strategia semplice ed efficace per mitigare questi effetti, anche in matrici come l'avocado, che sono ricche di acidi grassi e altri materiali co-estrattivi come i pigmenti. Attraverso l'applicazione del metodo QuEChERS che impiega formiato di ammonio insieme a taratura abbinata alla matrice e protettivi dell'analita, si ottiene una quantificazione altamente accurata. Di conseguenza, questo approccio garantisce un'analisi affidabile e applicabile dei residui di pesticidi nei campioni di avocado, rendendolo adatto per le applicazioni normative.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo l'Università EAN e l'Università di La Laguna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Ethoxy-1,2-propanediol Sigma Aldrich 260428-1G
Acetonitrile Merk 1006652500
Ammonium formate Sigma Aldrich 156264-1KG
AOAC 20i/s autosampler Shimadzu 221-723115-58
Automatic shaker MX-T6-PRO SCILOGEX 8.23222E+11
Balance OHAUS PA224
Centrifuge tubes, 15 mL Nest 601002
Centrifuge tubes, 2 mL Eppendorf 4610-1815
Centrifuge tubes, 50 mL Nest 602002
Centrifuge Z206A MERMLE 6019500118
Choper 2L Oster 2114111
Column SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm Shimadzu 221-75954-30 MS GC column 
Dispensette 5-50 mL BRAND 4600361
DSC-18 Sigma Aldrich 52600-U
D-Sorbitol Sigma Aldrich 240850-5G
Ethyl acetate Merk 1313181212
GCMS-TQ8040  Shimadzu 211552
Graphitized carbon black Sigma Aldrich 57210-U
Injection syringe Shimadzu LC2213461800
L-Gulonic acid γ-lactone Sigma Aldrich 310301-5G
Linner splitless Shimadzu 221-4887-02
Magnesium sulfate anhydrus Sigma Aldrich M7506-2KG
Methanol Panreac 131091.12.12
Milli-Q ultrapure (type 1) water Millipore F4H4783518
Pipette tips 10 - 100 µL Biologix 200010
Pipette tips 100 - 1000 µL Brand 541287
Pipette tips 20 - 200 µL Brand 732028
Pipettes Pasteur NORMAX 5426023
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL BRAND 704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL BRAND 704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL SCILOGEX 7.12111E+11
Primary-secondary amine Sigma Aldrich 52738-U
Shikimic acid Sigma Aldrich S5375-1G
Syringe Filter PTFE/L 25 mm, 0.45 µm NORMAX FE2545I
Triphenyl phosphate (QC) Sigma Aldrich 241288-50G
Vials with fused-in insert Sigma Aldrich 29398-U
Z-SEP+ Sigma Aldrich 55299-U zirconium oxide-based sorbent
Pesticides CAS registry number
4,4´-DDD Sigma Aldrich 35486-250MG 72-54-8
4,4´-DDE Sigma Aldrich 35487-100MG 72-55-9
4,4´-DDT Sigma Aldrich 31041-100MG 50-29-3
Alachlor Sigma Aldrich 45316-250MG 15972-60-8
Aldrin Sigma Aldrich 36666-25MG 309-00-2
Atrazine Sigma Aldrich 45330-250MG-R 1912-24-9
Atrazine-d5 (IS) Sigma Aldrich 34053-10MG-R 163165-75-1
Buprofezin Sigma Aldrich 37886-100MG 69327-76-0
Carbofuran Sigma Aldrich 32056-250-MG 1563-66-2
Chlorpropham Sigma Aldrich 45393-250MG 101-21-3
Chlorpyrifos Sigma Aldrich 45395-100MG 2921-88-2
Chlorpyrifos-methyl Sigma Aldrich 45396-250MG 5598-13-0
Deltamethrin Sigma Aldrich 45423-250MG 52918-63-5
Dichloran Sigma Aldrich 45435-250MG 99-30-9
Dichlorvos Sigma Aldrich 45441-250MG 62-73-7
Dieldrin Sigma Aldrich 33491-100MG-R 60-57-1
Diphenylamine Sigma Aldrich 45456-250MG 122-39--4
Endosulfan A Sigma Aldrich 32015-250MG 115-29-7
Endrin Sigma Aldrich 32014-250MG 72-20-8
EPN Sigma Aldrich 36503-100MG 2104-64-5
Esfenvalerate Sigma Aldrich 46277-100MG 66230-04-4
Ethion Sigma Aldrich 45477-250MG 563-12-2
Fenamiphos Sigma Aldrich 45483-250MG 22224-92-6
Fenitrothion Sigma Aldrich 45487-250MG 122-14-5
Fenthion Sigma Aldrich 36552-250MG 55-38-9
Fenvalerate Sigma Aldrich 45495-250MG 51630-58-1
HCB Sigma Aldrich 45522-250MG 118-74-1
Iprodione Sigma Aldrich 36132-100MG 36734-19-7
Lindane Sigma Aldrich 45548-250MG 58-89-9
Malathion Sigma Aldrich 36143-100MG 121-75-5
Metalaxyl Sigma Aldrich 32012-100MG 57837-19-1
Methidathion Sigma Aldrich 36158-100MG 950-37-8
Myclobutanil Sigma Aldrich 34360-100MG 88671-89-0
Oxyfluorfen Sigma Aldrich 35031-100MG 42874-03-3
Parathion-methyl Sigma Aldrich 36187-100MG 298-00-0
Penconazol Sigma Aldrich 36189-100MG 66246-88-6
Pirimiphos-methyl Sigma Aldrich 32058-250MG 29232-93-7
Propiconazole Sigma Aldrich 45642-250MG 60207-90-1
Propoxur Sigma Aldrich 45644-250MG 114-26-1
Propyzamide Sigma Aldrich 45645-250MG 23850-58-5
Pyriproxifen Sigma Aldrich 34174-100MG 95737-68-1
Tolclofos-methyl Sigma Aldrich 31209-250MG 5701804-9
Triadimefon Sigma Aldrich 45693-250MG 43121-43-3
Triflumizole Sigma Aldrich 32611-100MG 68694-11-1
α-HCH Sigma Aldrich 33377-50MG 319-86-8
β-HCH Sigma Aldrich 33376-100MG 319-85-7

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References

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Parole chiave: QuEChERS gascromatografia-spettrometria di massa tandem (GC-MS/MS) residui di pesticidi avocado effetti matrice convalida del metodo
Determinazione di 45 pesticidi nelle varietà di avocado mediante il metodo QuEChERS e gascromatografia-spettrometria di massa tandem
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