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Chemistry

Determinação de 45 pesticidas em variedades de abacate pelo método QuEChERS e cromatografia gasosa - espectrometria de massas em tandem

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/66082
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2,3
1Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ingeniería, Universidad EAN, 2Departamento de Química, Unidad Departamental de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de La Laguna (ULL), 3Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Universidad de La Laguna (ULL)

Summary

O presente protocolo descreve a análise de resíduos de pesticidas multiclasse em variedades de abacate usando o método Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) com formiato de amônio, seguido de cromatografia gasosa-espectrometria de massa em tandem.

Abstract

A espectrometria de massa em tandem de cromatografia gasosa (GC) (MS/MS) é um instrumento analítico proeminente amplamente empregado para a vigilância de resíduos de pesticidas em alimentos. No entanto, esses métodos são vulneráveis a efeitos de matriz (MEs), que podem afetar a quantificação precisa, dependendo da combinação específica de analito e matriz. Entre as várias estratégias para mitigar MEs, a calibração combinada com matriz representa a abordagem predominante em aplicações de resíduos de pesticidas devido à sua relação custo-benefício e implementação direta. Neste estudo, um total de 45 pesticidas representativos foram analisados em três variedades diferentes de abacate (ou seja, Criollo, Hass e Lorena) usando o método Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) com formiato de amônio e GC-MS/MS.

Para isso, 5 g da amostra de abacate foram extraídos com 10 mL de acetonitrila e, em seguida, 2,5 g de formiato de amônio foram adicionados para induzir a separação de fases. Posteriormente, o sobrenadante foi submetido a um processo de limpeza por meio de extração dispersiva em fase sólida empregando 150 mg de MgSO4 anidro, 50 mg de amina primária-secundária, 50 mg de octadecilsilano, 10 mg de negro de fumo grafitizado e 60 mg de um adsorvente à base de óxido de zircônio (Z-Sep+). A análise de GC-MS/MS foi realizada com sucesso em menos de 25 min. Experimentos rigorosos de validação foram realizados para avaliar o desempenho do método. O exame de uma curva de calibração combinada com a matriz para cada variedade de abacate revelou que a EM permaneceu relativamente consistente e inferior a 20% (considerada como uma EM suave) para a maioria das combinações de pesticidas / variedades. Além disso, os limites de quantificação do método foram inferiores a 5 μg/kg para as três variedades. Finalmente, os valores de recuperação para a maioria dos pesticidas caíram dentro da faixa aceitável de 70-120%, com valores de desvio padrão relativo abaixo de 20%.

Introduction

Na análise química, o efeito de matriz (ME) pode ser definido de várias maneiras, mas uma definição geral amplamente aceita é a seguinte: refere-se à mudança no sinal, particularmente uma mudança na inclinação da curva de calibração quando a matriz da amostra ou parte dela está presente durante a análise de um analito específico. Como aspecto crítico, o EM requer uma investigação completa durante o processo de validação de qualquer método analítico, pois afeta diretamente a precisão da medição quantitativa dos analitos alvo1. Idealmente, um procedimento de pré-tratamento de amostra deve ser seletivo o suficiente para evitar a extração de quaisquer componentes da matriz da amostra. No entanto, apesar dos esforços significativos, muitos desses componentes da matriz ainda acabam nos sistemas de determinação final na maioria dos casos. Consequentemente, esses componentes da matriz geralmente comprometem os valores de recuperação e precisão, introduzem ruído adicional e aumentam o custo geral e a mão de obra envolvida no método.

Na cromatografia gasosa (GC), a EM surge devido à presença de sítios ativos dentro do sistema GC, que interagem com os analitos alvo por meio de vários mecanismos. Por um lado, os constituintes da matriz bloqueiam ou mascaram esses locais ativos que, de outra forma, interagiriam com os analitos alvo, resultando em aumento frequente do sinal2. Por outro lado, sítios ativos que permanecem desobstruídos podem causar pico de rejeito ou decomposição do analito devido a fortes interações, levando a um EM negativo. No entanto, isso pode oferecer benefícios potenciais em certos casos2. É crucial enfatizar que alcançar a inércia completa em um sistema de GC é extremamente desafiador, apesar do uso de componentes altamente inertes e manutenção adequada. Com o uso contínuo, o acúmulo de componentes da matriz no sistema GC torna-se mais pronunciado, causando um aumento da EM. Hoje em dia, é amplamente reconhecido que analitos contendo oxigênio, nitrogênio, fósforo, enxofre e elementos semelhantes exibem um EM maior, pois interagem prontamente com esses sítios ativos. Por outro lado, compostos altamente estáveis, como hidrocarbonetos ou haloalcanos, não sofrem tais interações e não apresentam EM observável durante a análise 2,3.

No geral, a EM não pode ser totalmente eliminada, levando ao desenvolvimento de várias estratégias de compensação ou correção quando a remoção completa dos componentes da matriz não é viável. Dentre essas estratégias, a utilização de padrões internos deuterados (ISs), protetores de analitos, calibração compatível com matriz, método de adição de padrão ou modificação de técnicas de injeção foram documentadas na literatura científica 1,2,4,5. As diretrizes SANTE/11312/2021 também recomendaram essas estratégias6.

Em relação à aplicação da calibração pareada por matriz para compensar MEs, as sequências de amostras em situações práticas abrangem diversos tipos de alimentos ou várias amostras da mesma mercadoria. Nesse caso, supõe-se que o emprego de qualquer amostra da mesma mercadoria compensará efetivamente a EM em todas as amostras. No entanto, há uma carência de estudos suficientes na literatura existente que investiguem especificamente essa questão7.

A determinação multirresíduo de agrotóxicos em matrizes contendo uma porcentagem apreciável de gordura e pigmentos constitui uma tarefa desafiadora. A quantidade considerável de material coextraído pode afetar significativamente a eficiência da extração e interferir na determinação cromatográfica subsequente, potencialmente danificando a coluna, a fonte e o detector, resultando em MEs significativos 8,9,10. Consequentemente, a análise de pesticidas em níveis de traços em tais matrizes requer uma redução significativa dos componentes da matriz antes da análise, garantindo altos valores de recuperação7. A obtenção de altos valores de recuperação é crucial para garantir que as análises de pesticidas permaneçam confiáveis, precisas e em conformidade com os padrões regulatórios. Isso é vital para garantir a segurança alimentar, a proteção ambiental e a tomada de decisões informadas na agricultura e áreas afins.

O abacate é uma fruta de alto valor comercial cultivada em climas tropicais e mediterrâneos em todo o mundo e amplamente consumida tanto em suas regiões de origem quanto nos inúmeros mercados de exportação. Do ponto de vista analítico, o abacate é uma matriz complexa contendo um número significativo de ácidos graxos (ou seja, oleico, palmítico e linoleico), semelhante às nozes, um teor significativo de pigmentos, como nas folhas verdes, além de açúcares e ácidos orgânicos, semelhantes aos encontrados em outras frutas11. Devido à sua natureza gordurosa, atenção especial deve ser dada ao empregar qualquer método analítico para análise. Embora a análise de resíduos de pesticidas tenha sido realizada em abacates usando GC-MS em alguns casos 8,12,13,14,15,16,17,18,19,20, ela tem sido relativamente menos frequente em comparação com outras matrizes. Na maioria dos casos, uma versão do método Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) foi aplicada 8,12,13,14,15,16,17,18. Nenhum desses estudos investigou a consistência dos MEs entre diferentes variedades de abacate.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a consistência de MEs e valores de recuperação para 45 pesticidas representativos em diferentes variedades de abacate (ou seja, Criollo, Hass e Lorena) usando o método QuEChERS com formiato de amônio e GC-MS/MS. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que esse tipo de estudo é realizado em amostras de matriz gordurosa.

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Protocol

1. Preparação do estoque e soluções de trabalho

NOTA: Por razões de segurança, é aconselhável usar luvas de nitrilo, jaleco de laboratório e óculos de segurança durante todo o protocolo.

  1. Preparar soluções-mãe individuais de cada um dos 45 padrões de pesticidas comerciais (ver Tabela de Materiais) a aproximadamente 1.000 mg/L em acetonitrila em balões volumétricos de 10 mL.
  2. Combinar as soluções-mãe individuais acima referidas para preparar uma solução-mãe de 400 mg/l em acetonitrilo num balão volumétrico de 25 ml.
    NOTA: Esta solução mista será utilizada para preparar as soluções de trabalho para experimentos de recuperação e calibração.
  3. Preparar soluções-mãe de atrazina-d5 e fosfato de trifenilo (TPP) nas concentrações de 750 mg/L e 1.050 mg/L, respectivamente, em acetonitrilo em balões volumétricos de 10 ml. Utilize atrazina-d5 como padrão interno de procedimento (P-IS) e TPP como padrão interno de injeção (I-IS).
    NOTA: O cenário ideal envolveria a utilização de um padrão interno marcado isotopicamente para cada analito alvo específico.
  4. Preparar soluções de recuperação de unidades populacionais em acetonitrilo contendo 0,05% (v/v) de ácido fórmico (para evitar a degradação) em frascos volumétricos de 10 ml para obter 10, 100 e 400 μg/kg de equivalentes de amostra para os pesticidas e 200 μg/kg para o P-IS separadamente. Armazene essas soluções em frascos de vidro âmbar no escuro a -20 ° C.
  5. Prepare as soluções de calibração dos pesticidas e P-IS juntos em acetonitrila com 0,05% (v / v) de ácido fórmico em frascos volumétricos de 10 mL para produzir 5, 10, 25, 75, 200, 400 e 600 μg / kg e 200 ng / ng, respectivamente, e armazene-os em frascos de vidro âmbar no escuro a -20 ° C.
    NOTA: As mesmas soluções podem ser utilizadas durante todo o trabalho experimental, mas é essencial armazená-las nas condições especificadas imediatamente após cada uso.
  6. Prepare uma mistura de protetores de analito contendo 100 g / L de 3-etoxi-1,2-propanodiol, 10 g / L de ácido L-gulônico γ-lactona, 10 g / L de D-sorbitol e 5 g / L de ácido chiquímico em uma proporção de 4/1 (v / v) de acetonitrila para água com 0,5% (v / v) de ácido fórmico.
    NOTA: Esta mistura de protetores de analitos deve ser adicionada imediatamente antes da injeção para mitigar a EM.

2. Coleta de amostras

  1. Colete amostras de três espécies de abacate (por exemplo, Criollo, Hass e Lorena) disponíveis em supermercados. Assegurar que cada amostra pesa cerca de 1 kg, o que é suficiente para a realização de todos os estudos subsequentes e está em conformidade com a Diretiva 2002/63/CE21.
    NOTA: As amostras orgânicas foram selecionadas preferencialmente para minimizar a probabilidade da presença de resíduos de pesticidas.
  2. Transporte as amostras de abacate coletadas para o laboratório e homogeneize-as individualmente sem o tubo usando um picador (consulte a Tabela de Materiais). Armazenar as amostras homogeneizadas em recipientes de vidro âmbar a 4 °C até à análise.
    NOTA: As mesmas amostras de abacate serão usadas durante todo o estudo. Portanto, é crucial armazená-los nas condições especificadas imediatamente após cada uso.

3. Preparação de amostras utilizando o método QuEChERS com formiato de amônio

NOTA: A Figura 1 ilustra uma representação esquemática do método QuEChERS com formato de amónio.

  1. Pese 5 g de cada amostra de abacate em um tubo de centrífuga de 50 mL (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Adicionar 50 μL da solução P-IS para obter uma concentração de 200 μg/kg. Para avaliação da recuperação, adicione também as soluções de pesticidas preparadas na etapa 1.4 para produzir concentrações de 10, 100 e 400 μg/kg (n = 5 cada).
  3. Vortex o tubo por 30 s para garantir a integração completa do pico na amostra.
  4. Adicione 10 mL de acetonitrila ao tubo da centrífuga. Agite o tubo a 70 rpm por 5 min.
  5. Adicione 2,5 g de formiato de amônio, agite o tubo novamente a 70 rpm por 5 min e, em seguida, centrifugue-o a 1.800 × g por 5 min.
  6. Em um tubo de centrífuga de 2 mL contendo 150 mg de MgSO4 anidro, 50 mg de amina primária-secundária (PSA), 50 mg de octadecilsilano (C18), 10 mg de negro de fumo grafitizado (GCB) e 60 mg de um sorvente à base de óxido de zircônio Z-Sep +, adicione 1 mL do extrato para purificação utilizando extração em fase sólida dispersiva (d-SPE). Vortex o tubo por 30 s e centrifugue-o a 1.800 × g por 5 min.
  7. Transferir 200 μl do extracto para um frasco para injectáveis com amostrador automático, adicionar 20 μl da solução protectora da substância a analisar preparada no passo 1.6 e incluir 50 μl da solução TPP.
  8. Realize a análise instrumental usando um sistema GC-MS/MS (consulte a seção 4).
  9. Efectuar a calibração pareada com a matriz seguindo o mesmo procedimento acima descrito, utilizando extractos em branco, excepto, durante a etapa d-SPE (passo 3.6), limpar 5 ml do sobrenadante em tubos de 15 ml. Adicione as soluções spike e P-IS na etapa 3.7. Adicione as soluções padrão de calibração aos frascos do amostrador automático para produzir 5, 10, 25, 50, 100, 200, 400 e 600 μg/kg, juntamente com o TPP, resultando em um volume final de 270 μL.
    NOTA: No geral, certifique-se de construir curvas de calibração combinadas com a matriz para cada variedade de abacate mais as calibrações somente de acetonitrila.

4. Análise instrumental usando GC-MS/MS

  1. Conduza as análises empregando um sistema GC-MS / MS com um triplo quadrupolo (TQ) equipado com uma interface de ionização de elétrons (−70 eV) e um amostrador automático (ver Tabela de Materiais).
  2. Empregue uma coluna MS GC (ligação de sílica de 30 m de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm, espessura de filme de 0,25 μm) junto com hélio de pureza ultra-alta como gás de arraste a uma taxa de fluxo constante de 1,2 mL / min.
  3. Verifique os seguintes parâmetros antes de prosseguir com a operação do equipamento:
    1. Certifique-se de que as pressões do gás estejam corretas: Hélio a 140 psi e Argônio a 65 psi.
    2. Verifique a condição do óleo da bomba rotativa para garantir que esteja claro e no nível apropriado.
    3. Certifique-se de que a seringa para injeção não apresenta obstruções causadas por injeções anteriores.
    4. Confirme se os frascos para injetáveis de lavagem contêm um volume suficiente de cada solvente.
    5. Verifique se o contador de consumíveis (septo, revestimento) não atingiu seu limite.
  4. Ligue o interruptor GC principal localizado no painel frontal e ligue o interruptor MS localizado na parte traseira.
  5. Abra o software GCMS Real Time Analysis que controla todos os parâmetros do sistema GC-MS/MS.
    NOTA: O sistema do instrumento inclui o software GCMS Real Time Analysis por padrão.
  6. Clique em Controle de Vácuo | Avançado | Bomba rotativa 1 para iniciar o sistema de vácuo.
    NOTA: Nesta janela, monitore a pressão para determinar os valores ideais de vácuo, que devem ser inferiores a 9.0 Pa. Levará aproximadamente 12 h.
  7. Clique em Iniciar para ligar a bomba turbo molecular 1 e a bomba turbo molecular 2.
  8. Clique em Iniciar para a opção Aquecedor de fonte de íons .
    NOTA: Após um tempo recomendado de 1 h, verifique o vácuo do sistema para confirmar se o valor recomendado é inferior a 1.6e-3 Pa.
  9. Defina a temperatura da interface MS para 250 °C e a temperatura da fonte de íons para 300 °C.
  10. Mantenha o forno GC a uma temperatura inicial de 50 °C por 1 min e, em seguida, aumente para 180 °C a uma taxa de 25 °C/min. Em seguida, aumentar a temperatura para 230 °C a 5 °C/min e depois para 290 °C a 25 °C/min. Por fim, mantenha a temperatura constante a 290 °C por 6 min. O tempo total de análise é de 24,6 min.
  11. Clique em Fechar quando todos esses sistemas estiverem ligados.
  12. Clique na opção Tuning do software de análise e clique em Peak Monitor View para realizar uma verificação inicial das condições do espectrômetro de massa.
    NOTA: Se necessário, execute o ajuste automático.
  13. Clique em Aquisição e, na janela exibida, clique em Baixar parâmetros iniciais. Verifique se o equipamento está pronto GC e pronto MS.

5. Aquisição de dados

  1. Clique em Novo arquivo de lote do software e crie uma sequência contendo informações como nome da amostra, ID da amostra, arquivo de método, arquivo de dados, volume de injeção e arquivo de ajuste. Adicione linhas conforme necessário e clique em Salvar.
  2. Clique em Batch Start e deixe o processo de injeção começar.
  3. Efectuar a injecção a 250 °C no modo splitless, mantendo um volume de injecção de 1 μL. Após 1 minuto após a injeção, abra a divisão.
    NOTA: Entre as injeções, certifique-se de limpar a seringa de 10 μL com metanol, acetato de etila e acetonitrila, usando um único enxágue com cada solvente. Todas as injeções são realizadas em triplicata.
  4. Analise os analitos usando o modo de monitoramento de reação múltipla (MRM), que é o modo padrão empregado em sistemas MS/MS com um TQ.
    NOTA: A Tabela 1 fornece os tempos de retenção (em min) e as transições do quantificador e do qualificador para os pesticidas multiclasse, P-IS e I-IS. A análise quantitativa baseia-se na razão entre a área de pico do íon de quantificação e o íon P-IS. O I-IS é empregado para controle de qualidade durante a injeção. O Arquivo Suplementar 1 contém cromatogramas para todos os 45 pesticidas analisados.
  5. Abra o software de análise de pós-execução para análise de dados.
    NOTA: O sistema de instrumentos inclui o software GCMS Postrun Analysis por padrão.
  6. Clique na injeção a ser analisada, navegue pela tabela que contém os analitos e selecione o pico de interesse.
  7. Clique no pico ou na região de interesse para visualizar o cromatograma. Revise as integrações de pico e, se necessário, execute a integração manual. Verificar as áreas de todas as substâncias a analisar para efectuar os cálculos necessários e a avaliação do método.

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Representative Results

A validação abrangente do método analítico foi conduzida de acordo com as diretrizes SANTE/11312/20216, abrangendo avaliações de linearidade, ME, recuperação e repetibilidade.

Para a avaliação da linearidade, curvas de calibração pareadas com matrizes foram construídas usando amostras em branco enriquecidas em vários níveis de concentração (variando de 5 a 600 μg/kg). Os coeficientes de determinação (R2) para a maioria dos agrotóxicos selecionados foram maiores ou iguais a 0,99, indicando uma relação altamente linear entre concentração e resposta. Optou-se pelo menor nível de calibração (LCL) de 5 μg/kg, respeitando o limite máximo de resíduos (LMR) estabelecido de 10 μg/kg para fins de monitoramento de alimentos22.

Para avaliar a EM, as inclinações das curvas de calibração dos pesticidas multiclasse foram comparadas entre as condições de calibração de solvente puro e matricial. Como exemplo ilustrativo, a Figura 2 mostra a comparação das curvas no solvente e em cada uma das três matrizes para o carbofurano A EM foi calculada usando a equação (1)7, produzindo porcentagens que significam aumento de sinal (porcentagens positivas) ou supressão de sinal (porcentagens negativas).

Efeito matriz (%) = Equation 1 (1)

O sistema de classificação EM apresentado, baseado em faixas percentuais, fornece informações sobre o impacto da matriz nos sinais de pesticidas, auxiliando na interpretação dos achados analíticos. Em todos os casos para carbofurano, obteve-se EM positiva superior a 20%. No entanto, os resultados da geração de curvas de calibração pareadas com a matriz revelaram uma EM relativamente consistente de menos de 20% (classificada como ME suave) para a maioria das combinações de pesticidas/variedades (ver Tabela 2 e Figura 3).

Para avaliar a precisão e repetibilidade da análise, amostras em branco foram enriquecidas com pesticidas em três níveis de concentração diferentes (10, 100 e 400 μg/kg; n = 5 para cada concentração). Os resultados da Figura 4 demonstram a contagem de pesticidas cujas porcentagens médias de recuperação estavam dentro da faixa aceitável de 70-120% para cada tipo de abacate. Além disso, a Tabela 3 apresenta dados detalhados para todos os valores específicos obtidos. Uma proporção significativa dos pesticidas testados apresentou percentuais de recuperação dentro da faixa específica, com valores de desvio padrão relativo (RSD) abaixo de 20%.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do método QuEChERS com formiato de amônio empregado para a extração de resíduos de pesticidas de amostras de abacate. Abreviaturas: QuEChERS = Quick-E asy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe; IS = padrão interno; PSA = amina primária-secundária; GCB = negro de fumo grafitado; CQ = controle de qualidade; GC-MS/MS = cromatografia gasosa-espectrometria de massa em tandem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparação das curvas de calibração no solvente e nas matrizes para o carbofurano. Solvente: y = 0,0028x - 0,0054 e R2 = 0,9974; Crioulo: y = 0,0050x + 0,0050, R2 = 0,9994 e ME = 80%; Hass: y = 0,0037x - 0,0109, R2 = 0,9977 e ME = 30%; Lorena: y = 0,0041x + 0,0053, R2 = 0,9998 e ME = 42%. Abreviaturas: ME = efeito matricial; P-IS = padrão interno de procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Número de pesticidas selecionados categorizados por suas respectivas faixas de EM para variedades de abacate. A classificação da EM é baseada em três categorias: suave (valores entre −20% e 20%), médio (valores variando entre −20% e −50% ou entre 20% e 50%) e forte (valores superiores a 50% ou abaixo de −50%). Abreviatura: ME = efeito de matriz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O número de pesticidas que estão fora e dentro da faixa de recuperação aceitável aumentou em 10, 100 e 400 μg / kg (n = 15) nas três variedades de abacate. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Tempos de retenção, quantificadores e transições de qualificadores utilizados nas análises de GC-MS/MS dos pesticidas selecionados, juntamente com o P-IS e o I-IS. Abreviaturas: P-IS = padrão interno de procedimento; I-IS = padrão interno de injecção; GC-MS/MS = cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas em tandem; HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = fosfato de trifenilo; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Valores de efeito matricial (%) para os pesticidas selecionados em diferentes variedades de abacate durante a validação do método analítico final. Abreviaturas: HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = fosfato de trifenilo; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Valores de recuperação e seus correspondentes RSDs entre parênteses (n = 5 em cada nível de pico), ambos em %, para os pesticidas selecionados em diferentes variedades de abacate durante a validação do método analítico final. Abreviaturas: RSDs = desvios padrão relativos; HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; TPP = fosfato de trifenilo; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Espectros espectrométricos de massa de todos os pesticidas. Abreviaturas: HCB = hexaclorobenzeno; α-HCH = alfa-hexaclorociclohexano; β-HCH = beta-hexaclorociclohexano; 4,4'-DDD = 4,4'-diclorodifenildicloroetano; 4,4'-DDE = 4,4'-diclorodifenildicloroetileno; 4,4'-DDT = 4,4'-diclorodifeniltricloroetano; EPN = fenilfosfonotioato de etilonitrofenilo. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A principal limitação associada à calibração combinada com a matriz surge do uso de amostras em branco como padrões de calibração. Isso leva a um número aumentado de amostras a serem processadas para análise e a um aumento da injeção de componentes da matriz em cada sequência analítica, potencialmente levando a maiores demandas de manutenção do instrumento. No entanto, essa estratégia é mais adequada do que a adição padrão, o que geraria um número muito maior de amostras a serem injetadas devido à necessidade de realizar uma curva de calibração para cada amostra. Consequentemente, em ambos os casos, é necessário o uso de técnicas de preparação de amostras que minimizem essa co-extração, mantendo-se econômicas, rápidas e confiáveis. Nesse contexto, o método QuEChERS demonstrou sua utilidade na análise de resíduos de agrotóxicos em amostras de abacate 8,12,13,14,15,16,17,18. No entanto, nenhuma dessas abordagens explorou a aplicação do método QuEChERS empregando formato de amônio. Essa escolha visa mitigar as desvantagens do uso de sais de magnésio e sódio na análise de SM 23,24,25,26,27. Os sais de magnésio e sódio têm baixas pressões de vapor que têm a propensão de formar depósitos sólidos nas superfícies dentro da fonte de MS, o que pode afetar o desempenho do instrumento. Embora esse fenômeno ocorra em sistemas de cromatografia líquida (LC), ele também apresenta desafios no contexto do GC, onde eles podem se acumular no revestimento de entrada, necessitando de substituições mais frequentes do revestimento27. Para superar essas limitações e aumentar a compatibilidade com a detecção de EM, a substituição desses sais por alternativas altamente voláteis foi implementada. Os sais de amônio são preferidos, pois podem ser facilmente evaporados e/ou decompostos, superando assim as desvantagens. A presente investigação representa a primeira instância de utilização do método QuEChERS empregando formiato de amônio para a análise de resíduos de pesticidas em abacates. Em particular, o processo de extração consistiu em submeter a amostra de abacate a uma etapa de extração usando acetonitrila, com a adição de 0,5 g de formiato de amônio por grama de amostra para facilitar a salga (Figura 1).

Como a segunda etapa do método QuEChERS, a etapa dSPE é crucial porque serve para remover componentes indesejados da matriz que podem levar a interferências analíticas26. No entanto, alcançar uma etapa d-SPE eficaz geralmente requer uma combinação de vários adsorventes para abordar os diversos co-extrativos originados da matriz da amostra. Ao lidar com abacates, esta etapa pode incluir MgSO4 anidro para remover o excesso de água e melhorar a partição de pesticidas, PSA para eliminar ácidos graxos, ácidos orgânicos e açúcares, C18 para melhorar a remoção de componentes apolares, GCB para remoção de clorofila e materiais de zircônia como Z-Sep + para eliminar grandes quantidades de gordura 15,26,28. Consequentemente, os extratos de abacate foram transferidos para tubos centrífugos contendo quantidades específicas de cada sorvente: 150 mg de MgSO4 anidro, 50 mg de PSA, 50 mg de C18, 10 mg de GCB e 60 mg de Z-Sep+ (Figura 1).

Para iniciar o processo de validação envolvendo as etapas de extração e limpeza, as curvas de calibração foram rigorosamente examinadas. Isso envolveu a avaliação de curvas de calibração pareadas com matriz para cada combinação de analito / variedade de abacate, além de calibrações somente de acetonitrila (Figura 2). Em ambos os cenários, foi empregada uma mistura de protetores de analitos29 previamente proposta, consistindo de 3-etoxi-1,2-propanodiol, ácido L-gulônico γ-lactona, D-sorbitol e ácido chiquímico. A avaliação abrangeu a linearidade em uma faixa de concentração de 5 a 600 μg/kg. O LCL de 5 μg/kg é inferior ao rigoroso LMR de 10 μg/kg, conforme estabelecido pela regulamentação internacional que rege a análise de resíduos de pesticidas em produtos alimentares22. Além disso, o LCL de 5 μg/kg produziu uma relação sinal-ruído superior a 10 para todos os pesticidas multiclasse selecionados. A inspeção visual dos gráficos de calibração também foi realizada para verificar a precisão dos valores de inclinação empregados para o cálculo da EM. Os resultados indicaram que a maioria dos agrotóxicos selecionados apresentou valores de R2 maiores ou iguais a 0,99 em todas as quatro curvas de calibração para cada um deles. A avaliação geral dos resultados da calibração demonstrou a precisão e adequação dessas equações para cálculos precisos de EM em cada variedade de abacate.

A EM foi determinada como macia (EM ≤ 20%) para a maioria dos pesticidas em cada uma das três variedades de abacate sob investigação (Tabela 2 e Figura 3). Neste contexto, três pontos fundamentais merecem destaque. Em primeiro lugar, os extratos finais da amostra estavam relativamente limpos devido à eficácia do protocolo de preparação de amostras implementado, resultando em interferências mínimas. Em segundo lugar, nos sistemas GC, os MEs estão sujeitos às influências decorrentes das interações que ocorrem dentro da matriz e das interações que ocorrem em locais ativos dentro do sistema29. A mistura de protetores de analitos usada cobriu de forma abrangente quase todo o espectro de pesticidas. No entanto, os pesticidas que eluem precocemente (propoxur, diclorvos, carbofurano e difenilamina), bem como aqueles que eluem mais tarde (piriproxifeno, fenvalerato, esfenvalerato e deltametrina), exibiram os valores de EM mais altos e menos consistentes. Em terceiro lugar, considerando essas diferenças, decidiu-se utilizar a calibração pareada por matriz de cada variedade separadamente para conduzir o estudo de recuperação. É importante notar que uma variedade pode representar razoavelmente as outras variedades para os pesticidas restantes.

A recuperação e a avaliação da reprodutibilidade foram realizadas em três diferentes níveis de concentração (10, 100 e 400 μg/kg) em quintuplicata (n = 15). Para conseguir isso, amostras de abacate foram enriquecidas no início da aplicação do método QuEChERS. As recuperações foram calculadas comparando as razões entre a área de pico do pesticida e o pico do P-IS (atrazina-d5) obtido a partir da calibração pareada com matriz. Cada repetição foi injetada em triplicata dentro da mesma sequência para garantir a consistência. O uso de um SI marcado isotopicamente permite a compensação de possíveis perdas de pesticidas durante o protocolo, além de levar em conta erros metodológicos e variabilidade instrumental. Os resultados mostraram que a maioria dos pesticidas atendeu aos critérios aceitáveis, com recuperações variando de 70 a 120% e RSD abaixo de 20% em cada nível de pico6 (Figura 4), indicando a eficácia e repetibilidade do método. No entanto, alguns pesticidas apresentaram recuperações além dessa faixa aceitável (Tabela 3). Este é o caso do hexaclorobenzeno (HCB), mostrando recuperações na faixa de 28-55% para todos os níveis de concentração e matrizes. Isso pode ser atribuído à estrutura molecular planar do HCB, que leva a uma forte afinidade com o GCB, causando sua retenção e reduzindo a eficiência de extração30. Apesar das recuperações mais baixas para HCB e alguns outros casos, o método ainda demonstrou uma recuperação consistente e confiável para esses pesticidas, com valores de RSD permanecendo abaixo do limite recomendado.

Em conclusão, a análise de resíduos de pesticidas em amostras de alimentos encontra EM, o que pode afetar a precisão do GC-MS/MS. A calibração combinada com matriz prova ser uma estratégia direta e eficaz para mitigar esses efeitos, mesmo em matrizes como abacates, que são ricas em ácidos graxos e outros materiais coextrativos, como pigmentos. Através da aplicação do método QuEChERS que emprega formato de amônio junto com calibração combinada com matriz e protetores de analitos, é alcançada uma quantificação altamente precisa. Consequentemente, essa abordagem garante uma análise confiável e aplicável de resíduos de pesticidas em amostras de abacate, tornando-a adequada para aplicações regulatórias.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer à Universidade EAN e à Universidade de La Laguna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Ethoxy-1,2-propanediol Sigma Aldrich 260428-1G
Acetonitrile Merk 1006652500
Ammonium formate Sigma Aldrich 156264-1KG
AOAC 20i/s autosampler Shimadzu 221-723115-58
Automatic shaker MX-T6-PRO SCILOGEX 8.23222E+11
Balance OHAUS PA224
Centrifuge tubes, 15 mL Nest 601002
Centrifuge tubes, 2 mL Eppendorf 4610-1815
Centrifuge tubes, 50 mL Nest 602002
Centrifuge Z206A MERMLE 6019500118
Choper 2L Oster 2114111
Column SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm Shimadzu 221-75954-30 MS GC column 
Dispensette 5-50 mL BRAND 4600361
DSC-18 Sigma Aldrich 52600-U
D-Sorbitol Sigma Aldrich 240850-5G
Ethyl acetate Merk 1313181212
GCMS-TQ8040  Shimadzu 211552
Graphitized carbon black Sigma Aldrich 57210-U
Injection syringe Shimadzu LC2213461800
L-Gulonic acid γ-lactone Sigma Aldrich 310301-5G
Linner splitless Shimadzu 221-4887-02
Magnesium sulfate anhydrus Sigma Aldrich M7506-2KG
Methanol Panreac 131091.12.12
Milli-Q ultrapure (type 1) water Millipore F4H4783518
Pipette tips 10 - 100 µL Biologix 200010
Pipette tips 100 - 1000 µL Brand 541287
Pipette tips 20 - 200 µL Brand 732028
Pipettes Pasteur NORMAX 5426023
Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL BRAND 704774
Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL BRAND 704780
Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL SCILOGEX 7.12111E+11
Primary-secondary amine Sigma Aldrich 52738-U
Shikimic acid Sigma Aldrich S5375-1G
Syringe Filter PTFE/L 25 mm, 0.45 µm NORMAX FE2545I
Triphenyl phosphate (QC) Sigma Aldrich 241288-50G
Vials with fused-in insert Sigma Aldrich 29398-U
Z-SEP+ Sigma Aldrich 55299-U zirconium oxide-based sorbent
Pesticides CAS registry number
4,4´-DDD Sigma Aldrich 35486-250MG 72-54-8
4,4´-DDE Sigma Aldrich 35487-100MG 72-55-9
4,4´-DDT Sigma Aldrich 31041-100MG 50-29-3
Alachlor Sigma Aldrich 45316-250MG 15972-60-8
Aldrin Sigma Aldrich 36666-25MG 309-00-2
Atrazine Sigma Aldrich 45330-250MG-R 1912-24-9
Atrazine-d5 (IS) Sigma Aldrich 34053-10MG-R 163165-75-1
Buprofezin Sigma Aldrich 37886-100MG 69327-76-0
Carbofuran Sigma Aldrich 32056-250-MG 1563-66-2
Chlorpropham Sigma Aldrich 45393-250MG 101-21-3
Chlorpyrifos Sigma Aldrich 45395-100MG 2921-88-2
Chlorpyrifos-methyl Sigma Aldrich 45396-250MG 5598-13-0
Deltamethrin Sigma Aldrich 45423-250MG 52918-63-5
Dichloran Sigma Aldrich 45435-250MG 99-30-9
Dichlorvos Sigma Aldrich 45441-250MG 62-73-7
Dieldrin Sigma Aldrich 33491-100MG-R 60-57-1
Diphenylamine Sigma Aldrich 45456-250MG 122-39--4
Endosulfan A Sigma Aldrich 32015-250MG 115-29-7
Endrin Sigma Aldrich 32014-250MG 72-20-8
EPN Sigma Aldrich 36503-100MG 2104-64-5
Esfenvalerate Sigma Aldrich 46277-100MG 66230-04-4
Ethion Sigma Aldrich 45477-250MG 563-12-2
Fenamiphos Sigma Aldrich 45483-250MG 22224-92-6
Fenitrothion Sigma Aldrich 45487-250MG 122-14-5
Fenthion Sigma Aldrich 36552-250MG 55-38-9
Fenvalerate Sigma Aldrich 45495-250MG 51630-58-1
HCB Sigma Aldrich 45522-250MG 118-74-1
Iprodione Sigma Aldrich 36132-100MG 36734-19-7
Lindane Sigma Aldrich 45548-250MG 58-89-9
Malathion Sigma Aldrich 36143-100MG 121-75-5
Metalaxyl Sigma Aldrich 32012-100MG 57837-19-1
Methidathion Sigma Aldrich 36158-100MG 950-37-8
Myclobutanil Sigma Aldrich 34360-100MG 88671-89-0
Oxyfluorfen Sigma Aldrich 35031-100MG 42874-03-3
Parathion-methyl Sigma Aldrich 36187-100MG 298-00-0
Penconazol Sigma Aldrich 36189-100MG 66246-88-6
Pirimiphos-methyl Sigma Aldrich 32058-250MG 29232-93-7
Propiconazole Sigma Aldrich 45642-250MG 60207-90-1
Propoxur Sigma Aldrich 45644-250MG 114-26-1
Propyzamide Sigma Aldrich 45645-250MG 23850-58-5
Pyriproxifen Sigma Aldrich 34174-100MG 95737-68-1
Tolclofos-methyl Sigma Aldrich 31209-250MG 5701804-9
Triadimefon Sigma Aldrich 45693-250MG 43121-43-3
Triflumizole Sigma Aldrich 32611-100MG 68694-11-1
α-HCH Sigma Aldrich 33377-50MG 319-86-8
β-HCH Sigma Aldrich 33376-100MG 319-85-7

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Palavras-chave: QuEChERS Cromatografia Gasosa-Espectrometria de Massas em Tandem (GC-MS/MS) Resíduos de Pesticidas Abacate Efeitos de Matriz Validação de Métodos
Determinação de 45 pesticidas em variedades de abacate pelo método QuEChERS e cromatografia gasosa - espectrometria de massas em tandem
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