Summary
Le présent protocole décrit l’analyse des résidus de pesticides multiclasses dans les variétés d’avocats à l’aide de la méthode Qu ick-E asy-Cheap-E ffective-R ugged-S afe (QuEChERS) avec formiate d’ammonium, suivie d’une chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem.
Abstract
La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) par chromatographie en phase gazeuse (GC) est un instrument d’analyse prééminent largement utilisé pour la surveillance des résidus de pesticides dans les aliments. Néanmoins, ces méthodes sont vulnérables aux effets de matrice (EM), qui peuvent potentiellement affecter la quantification précise en fonction de la combinaison spécifique de l’analyte et de la matrice. Parmi les diverses stratégies visant à atténuer les EM, l’étalonnage matriciel représente l’approche dominante dans les applications de résidus de pesticides en raison de sa rentabilité et de sa simplicité de mise en œuvre. Dans cette étude, un total de 45 pesticides représentatifs ont été analysés dans trois variétés différentes d’avocats (c.-à-d. Criollo, Hass et Lorena) à l’aide de la méthode Qu ick-Easy-Ch eap-E fective-R ugged-S afe (QuEChERS) avec du formiate d’ammonium et GC-MS/MS.
À cette fin, 5 g de l’échantillon d’avocat ont été extraits avec 10 mL d’acétonitrile, puis 2,5 g de formiate d’ammonium ont été ajoutés pour induire la séparation de phase. Par la suite, le surnageant a subi un processus de nettoyage par extraction en phase solide dispersive utilisant 150 mg de MgSO4 anhydre, 50 mg d’amine primaire-secondaire, 50 mg d’octadécylsilane, 10 mg de noir de carbone graphitisé et 60 mg d’un sorbant à base d’oxyde de zirconium (Z-Sep+). L’analyse GC-MS/MS a été réalisée avec succès en moins de 25 min. Des expériences de validation rigoureuses ont été menées pour évaluer les performances de la méthode. L’examen d’une courbe d’étalonnage matricielle appariée pour chaque variété d’avocat a révélé que l’EM est demeuré relativement constant et inférieur à 20 % (considéré comme un EM mou) pour la plupart des combinaisons pesticide/variété. De plus, les limites de quantification de la méthode étaient inférieures à 5 μg/kg pour les trois variétés. Enfin, les valeurs de récupération de la plupart des pesticides se situaient dans la fourchette acceptable de 70 à 120 %, avec des valeurs d’écart-type relatif inférieures à 20 %.
Introduction
En analyse chimique, l’effet de matrice (EM) peut être défini de différentes manières, mais une définition générale largement acceptée est la suivante : il s’agit de la modification du signal, en particulier une modification de la pente de la courbe d’étalonnage lorsque la matrice de l’échantillon ou une partie de celle-ci est présente lors de l’analyse d’un analyte spécifique. En tant qu’aspect critique, l’EM nécessite une investigation approfondie lors du processus de validation de toute méthode analytique, car elle affecte directement la précision des mesures quantitatives pour les analytes cibles1. Idéalement, une procédure de prétraitement d’échantillon devrait être suffisamment sélective pour éviter d’extraire des composants de la matrice de l’échantillon. Cependant, malgré des efforts considérables, bon nombre de ces éléments de la matrice se retrouvent encore dans les systèmes de détermination finale dans la plupart des cas. Par conséquent, ces composants matriciels compromettent souvent les valeurs de récupération et de précision, introduisent du bruit supplémentaire et augmentent le coût global et la main-d’œuvre impliqués dans la méthode.
Dans la chromatographie en phase gazeuse (GC), l’EM apparaît en raison de la présence de sites actifs dans le système GC, qui interagissent avec les analytes cibles par divers mécanismes. D’une part, les constituants de la matrice bloquent ou masquent ces sites actifs qui interagiraient autrement avec les analytes cibles, ce qui entraîne une amélioration fréquente du signal2. D’autre part, les sites actifs qui restent dégagés peuvent provoquer un pic de résidus ou une décomposition de l’analyte en raison de fortes interactions, conduisant à une EM négative. Cependant, cela peut offrir des avantages potentiels dans certains cas2. Il est crucial de souligner qu’il est extrêmement difficile d’obtenir une inertie totale dans un système GC, malgré l’utilisation de composants très inertes et un entretien approprié. Avec une utilisation continue, l’accumulation de composants matriciels dans le système GC devient plus prononcée, provoquant une augmentation de l’EM. De nos jours, il est largement reconnu que les analytes contenant de l’oxygène, de l’azote, du phosphore, du soufre et des éléments similaires présentent une plus grande EM car ils interagissent facilement avec ces sites actifs. À l’inverse, les composés très stables tels que les hydrocarbures ou les organohalogènes ne subissent pas de telles interactions et ne montrent pas d’EM observable lors de l’analyse 2,3.
Dans l’ensemble, l’EM ne peut pas être complètement éliminée, ce qui a conduit à l’élaboration de plusieurs stratégies de compensation ou de correction lorsque l’élimination complète des composants de la matrice n’est pas réalisable. Parmi ces stratégies, l’utilisation d’étalons internes (IS) deutérés, de protecteurs d’analytes, d’étalonnage apparié à la matrice, de la méthode d’addition d’étalons ou de la modification des techniques d’injection ont été documentées dans la littérature scientifique 1,2,4,5. Les lignes directrices SANTE/11312/2021 ont également recommandé ces stratégies6.
En ce qui concerne l’application de l’étalonnage matriciel pour compenser les EM, les séquences d’échantillons dans des situations pratiques englobent divers types d’aliments ou divers échantillons d’un même produit. Dans ce cas, on suppose que l’utilisation d’un échantillon provenant du même produit compensera efficacement l’EM dans tous les échantillons. Cependant, il n’y a pas suffisamment d’études dans la littérature existante pour examiner spécifiquement cette question7.
Le dosage de plusieurs résidus de pesticides dans des matrices contenant un pourcentage appréciable de matières grasses et de pigments constitue une tâche difficile. La quantité considérable de matériau coextrait peut affecter de manière significative l’efficacité de l’extraction et interférer avec la détermination chromatographique ultérieure, endommageant potentiellement la colonne, la source et le détecteur, et entraînant des EM significatifs 8,9,10. Par conséquent, l’analyse des pesticides à l’état de traces dans de telles matrices nécessite une réduction significative des composants de la matrice avant l’analyse tout en assurant des valeurs de récupération élevées7. L’obtention de valeurs de récupération élevées est cruciale pour garantir que les analyses de pesticides restent fiables, précises et conformes aux normes réglementaires. C’est essentiel pour garantir la sécurité alimentaire, la protection de l’environnement et la prise de décisions éclairées dans l’agriculture et les domaines connexes.
L’avocat est un fruit de haute valeur commerciale, cultivé dans les climats tropicaux et méditerranéens du monde entier et largement consommé tant dans ses régions d’origine que sur les nombreux marchés d’exportation. Du point de vue analytique, l’avocat est une matrice complexe contenant un nombre important d’acides gras (oléique, palmitique et linoléique), semblable aux noix, une teneur importante en pigments, comme dans les feuilles vertes, ainsi que des sucres et des acides organiques, similaires à ceux que l’on trouve dans d’autres fruits11. En raison de sa nature grasse, une attention particulière doit être accordée lors de l’utilisation de toute méthode d’analyse pour l’analyse. Bien que l’analyse des résidus de pesticides ait été effectuée sur des avocats à l’aide de la GC-MS dans certains cas 8,12,13,14,15,16,17,18,19,20, elle a été relativement moins fréquente que celle d’autres matrices. Dans la plupart des cas, une version de la méthode Qu ick-Easy-Ch eap-E fective-R ugged-S afe (QuEChERS) a été appliquée 8,12,13,14,15,16,17,18. Aucune de ces études n’a examiné la consistance des EM entre différentes variétés d’avocats.
Par conséquent, l’objectif de ce travail était d’étudier la cohérence des EM et des valeurs de récupération pour 45 pesticides représentatifs dans différentes variétés d’avocats (c’est-à-dire Criollo, Hass et Lorena) en utilisant la méthode QuEChERS avec du formiate d’ammonium et GC-MS/MS. À notre connaissance, c’est la première fois que ce type d’étude est mené sur de tels échantillons de matrice graisseuse.
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Protocol
1. Préparation du stock et solutions de travail
REMARQUE : Pour des raisons de sécurité, il est conseillé de porter des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité tout au long du protocole.
- Préparer des solutions mères individuelles de chacun des 45 étalons de pesticides commerciaux (voir le tableau des matières) à environ 1 000 mg/L dans de l’acétonitrile dans des fioles jaugées de 10 mL.
- Combiner les solutions mères individuelles ci-dessus pour préparer une solution mère à 400 mg/L dans de l’acétonitrile dans une fiole jaugée de 25 mL.
REMARQUE : Cette solution mixte sera utilisée pour préparer les solutions de travail pour les expériences de récupération et d’étalonnage. - Préparer des solutions mères d’atrazine-d5 et de phosphate de triphényle (TPP) à des concentrations de 750 mg/L et de 1 050 mg/L, respectivement, dans de l’acétonitrile dans des fioles jaugées de 10 mL. Utiliser l’atrazine-d5 comme étalon interne procédural (P-IS) et le TPP comme étalon interne d’injection (I-IS).
REMARQUE : Le scénario idéal impliquerait l’utilisation d’un étalon interne marqué isotopiquement pour chaque analyte cible spécifique. - Préparer des solutions mères de récupération dans de l’acétonitrile contenant 0,05 % (v/v) d’acide formique (pour éviter la dégradation) dans des fioles jaugées de 10 mL afin d’obtenir séparément 10, 100 et 400 μg/kg d’équivalents d’échantillon pour les pesticides et 200 μg/kg pour le P-IS. Conservez ces solutions dans des flacons en verre ambré à l’obscurité à −20 °C.
- Préparer des solutions d’étalonnage des pesticides et du P-IS ensemble dans de l’acétonitrile avec 0,05 % (v/v) d’acide formique dans des fioles jaugées de 10 mL pour produire 5, 10, 25, 75, 200, 400 et 600 μg/kg et 200 ng/ng, respectivement, et les stocker dans des flacons en verre ambré dans l’obscurité à −20 °C.
REMARQUE : Les mêmes solutions peuvent être utilisées tout au long du travail expérimental, mais il est essentiel de les stocker dans les conditions spécifiées immédiatement après chaque utilisation. - Préparez un mélange d’agents protecteurs d’analytes contenant 100 g/L de 3-éthoxy-1,2-propanediol, 10 g/L d’acide L-gulonique γ-lactone, 10 g/L de D-sorbitol et 5 g/L d’acide shikimique dans un rapport de 4/1 (v/v) d’acétonitrile à l’eau avec 0,5 % (v/v) d’acide formique.
REMARQUE : Ce mélange de protecteurs d’analytes doit être ajouté juste avant l’injection pour atténuer l’EM.
2. Prélèvement d’échantillons
- Prélevez des échantillons de trois espèces d’avocats (par exemple, Criollo, Hass et Lorena) disponibles dans les supermarchés. Veiller à ce que chaque échantillon pèse environ 1 kg, ce qui est suffisant pour mener à bien toutes les études ultérieures et est conforme à la directive 2002/63/CE21.
REMARQUE : Les échantillons organiques ont été choisis de préférence afin de réduire au minimum la probabilité de présence de résidus de pesticides. - Transporter les échantillons d’avocats collectés au laboratoire, et les homogénéiser individuellement sans le tuyau à l’aide d’un hachoir (voir tableau des matériaux). Conserver les échantillons homogénéisés dans des récipients en verre ambré à 4 °C jusqu’à l’analyse.
REMARQUE : Les mêmes échantillons d’avocats seront utilisés tout au long de l’étude. Par conséquent, il est crucial de les stocker dans les conditions spécifiées immédiatement après chaque utilisation.
3. Préparation d’échantillons à l’aide de la méthode QuEChERS avec du formiate d’ammonium
REMARQUE : La figure 1 illustre une représentation schématique de la méthode QuEChERS avec du formiate d’ammonium.
- Peser 5 g de chaque échantillon d’avocat dans un tube à centrifuger de 50 ml (voir le tableau des matières).
- Ajouter 50 μL de la solution P-IS pour obtenir une concentration de 200 μg/kg. Pour l’évaluation du rétablissement, ajouter également les solutions de pesticides préparées à l’étape 1.4 pour obtenir des concentrations de 10, 100 et 400 μg/kg (n = 5 chacune).
- Agitez le tube pendant 30 s pour assurer une intégration complète de la pointe dans l’échantillon.
- Ajouter 10 ml d’acétonitrile dans le tube à centrifuger. Agitez le tube à 70 tr/min pendant 5 min.
- Ajoutez 2,5 g de formiate d’ammonium, agitez à nouveau le tube à 70 tr/min pendant 5 min, puis centrifugez-le à 1 800 × g pendant 5 min.
- À un tube à centrifuger de 2 mL contenant 150 mg de MgSO4 anhydre, 50 mg d’amine primaire-secondaire (PSA), 50 mg d’octadécylsilane (C18), 10 mg de noir de carbone graphitisé (GCB) et 60 mg d’un sorbant à base d’oxyde de zirconium Z-Sep+, ajoutez 1 mL de l’extrait pour la purification par extraction en phase solide dispersive (d-SPE). Agitez le tube pendant 30 s et centrifugez-le à 1 800 × g pendant 5 min.
- Transvaser 200 μL de l’extrait dans un flacon d’échantillonneur automatique, ajouter 20 μL de la solution de protection de l’analyte préparée à l’étape 1.6 et inclure 50 μL de la solution de TPP.
- Effectuer une analyse instrumentale à l’aide d’un système GC-MS/MS (voir section 4).
- Effectuer l’étalonnage matriciel en suivant la même procédure que celle décrite ci-dessus, en utilisant des extraits à blanc, sauf que, pendant l’étape d-SPE (étape 3.6), nettoyer 5 mL du surnageant dans des tubes de 15 mL. Ajoutez les solutions de pointe et P-IS à l’étape 3.7. Ajoutez les solutions étalons d’étalonnage aux flacons de l’échantillonneur automatique pour obtenir des doses de 5, 10, 25, 50, 100, 200, 400 et 600 μg/kg, ainsi que le TPP, ce qui donne un volume final de 270 μL.
REMARQUE : Dans l’ensemble, assurez-vous de construire des courbes d’étalonnage adaptées à la matrice pour chaque variété d’avocat, ainsi que des étalonnages à l’acétonitrile uniquement.
4. Analyse instrumentale à l’aide de la GC-MS/MS
- Effectuer les analyses à l’aide d’un système GC-MS/MS doté d’un quadripôle triple (TQ) équipé d’une interface d’ionisation d’électrons (−70 eV) et d’un échantillonneur automatique (voir le Tableau des matériaux).
- Utiliser une colonne MS GC (liaison de silice de 30 m de longueur, 0,25 mm de diamètre intérieur, 0,25 μm d’épaisseur de film) avec de l’hélium de très haute pureté comme gaz porteur à un débit constant de 1,2 mL/min.
- Vérifiez les paramètres suivants avant de procéder au fonctionnement de l’équipement :
- Assurez-vous que les pressions de gaz sont correctes : hélium à 140 psi et argon à 65 psi.
- Vérifiez l’état de l’huile de la pompe rotative pour vous assurer qu’elle est claire et au niveau approprié.
- Assurez-vous que la seringue d’injection ne présente aucune obstruction due aux injections précédentes.
- Confirmez que les flacons de lavage contiennent un volume suffisant de chaque solvant.
- Vérifiez que le compteur de consommables (septum, doublure) n’a pas atteint sa limite.
- Allumez le commutateur GC principal situé sur le panneau avant et allumez le commutateur MS situé à l’arrière.
- Ouvrez le logiciel d’analyse en temps réel du SMGC qui contrôle tous les paramètres du système GC-MS/MS.
REMARQUE : Le système d’instruments comprend par défaut le logiciel d’analyse en temps réel du SMGC. - Cliquez sur Contrôle du vide | Avancé | Pompe rotative 1 pour initier le système de vide.
REMARQUE : Dans cette fenêtre, surveillez la pression pour déterminer les valeurs de vide optimales, qui doivent être inférieures à 9.0 Pa. Cela prendra environ 12 h. - Cliquez sur Démarrer pour activer la pompe turbomoléculaire 1 et la pompe turbomoléculaire 2.
- Cliquez sur Démarrer pour l’option Réchauffeur de source d’ions .
REMARQUE : Après un temps recommandé de 1 h, vérifiez le vide du système pour confirmer que la valeur recommandée est inférieure à 1,6e-3 Pa. - Réglez la température de l’interface MS sur 250 °C et la température de la source d’ions sur 300 °C.
- Maintenez le four GC à une température initiale de 50 °C pendant 1 min, puis augmentez-le jusqu’à 180 °C à une vitesse de 25 °C/min. Ensuite, augmentez la température à 230 °C à 5 °C/min, puis à 290 °C à 25 °C/min. Enfin, maintenez la température constante à 290 °C pendant 6 min. Le temps total d’analyse est de 24,6 min.
- Cliquez sur Fermer une fois que tous ces systèmes sont allumés.
- Cliquez sur l’option Tuning du logiciel d’analyse et cliquez sur Peak Monitor View pour effectuer une première vérification des conditions du spectromètre de masse.
REMARQUE : Si nécessaire, effectuez un réglage automatique. - Cliquez sur Acquisition, puis dans la fenêtre qui s’affiche, cliquez sur Télécharger les paramètres initiaux. Vérifiez que l’équipement est prêt GC et MS.
5. Acquisition de données
- Cliquez sur Nouveau fichier de lot dans le logiciel et créez une séquence contenant des informations telles que le nom de l’échantillon, l’ID de l’échantillon, le fichier de méthode, le fichier de données, le volume d’injection et le fichier de réglage. Ajoutez des lignes si nécessaire et cliquez sur Enregistrer.
- Cliquez sur Démarrage par lots et laissez le processus d’injection commencer.
- Effectuez l’injection à 250 °C en mode splitless, en maintenant un volume d’injection de 1 μL. Après 1 minute après l’injection, ouvrez la fente.
REMARQUE : Entre les injections, assurez-vous de nettoyer la seringue de 10 μL avec du méthanol, de l’acétate d’éthyle et de l’acétonitrile, en utilisant un seul rinçage avec chaque solvant. Toutes les injections sont réalisées en trois exemplaires. - Analysez les analytes à l’aide du mode de surveillance des réactions multiples (MRM), qui est le mode standard utilisé dans les systèmes MS/MS avec un TQ.
REMARQUE : Le tableau 1 présente les temps de rétention (en min) et les transitions entre le quantificateur et le qualificatif pour les pesticides multiclasses, P-IS et I-IS. L’analyse quantitative repose sur le rapport entre l’aire du pic de l’ion de quantification et l’ion P-IS. L’I-IS est utilisé pour le contrôle de la qualité pendant l’injection. Le fichier supplémentaire 1 contient des chromatogrammes pour l’ensemble des 45 pesticides analysés. - Ouvrez le logiciel Postrun Analysis pour l’analyse des données.
REMARQUE : Le système d’instruments comprend par défaut le logiciel d’analyse post-exécution GCMS. - Cliquez sur l’injection à analyser, naviguez dans le tableau contenant les analytes et sélectionnez le pic qui vous intéresse.
- Cliquez sur le pic ou la région d’intérêt pour visualiser le chromatogramme. Examinez les intégrations de pointe et, si nécessaire, effectuez une intégration manuelle. Vérifiez les zones de tous les analytes pour effectuer les calculs nécessaires et l’évaluation de la méthode.
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Representative Results
Une validation complète de la méthode analytique a été effectuée conformément aux lignes directrices6 de SANTE/11312/2021, englobant les évaluations de la linéarité, de l’EM, de la récupération et de la répétabilité.
Pour l’évaluation de la linéarité, des courbes d’étalonnage appariées à la matrice ont été construites à l’aide d’échantillons à blanc enrichis à plusieurs niveaux de concentration (allant de 5 à 600 μg/kg). Les coefficients de détermination (R2) de la plupart des pesticides sélectionnés se sont révélés supérieurs ou égaux à 0,99, ce qui indique une relation très linéaire entre la concentration et la réponse. Le niveau d’étalonnage le plus bas (LCL) de 5 μg/kg a été choisi, conformément à la limite maximale de résidus (LMR) établie de 10 μg/kg à des fins de surveillance des aliments22.
Pour évaluer l’EM, les pentes des courbes d’étalonnage des pesticides multiclasses ont été comparées entre des conditions d’étalonnage de solvant pur et de matrice appariée. À titre d’exemple, la figure 2 montre la comparaison des courbes du solvant et de chacune des trois matrices pour le carbofuran. L’EM a été calculée à l’aide de l’équation (1)7, ce qui a donné des pourcentages qui signifient une augmentation du signal (pourcentages positifs) ou une suppression du signal (pourcentages négatifs).
Effet de matrice (%) = 
(1)
Le système de classification ME présenté, basé sur des plages de pourcentages, donne un aperçu de l’impact de la matrice sur les signaux du pesticide, ce qui facilite l’interprétation des résultats analytiques. Dans tous les cas pour le carbofuran, une EM positive supérieure à 20 % a été obtenue. Cependant, les résultats de la génération de courbes d’étalonnage appariées à la matrice ont révélé une EM relativement constante de moins de 20 % (classée comme EM molle) pour la plupart des combinaisons pesticide/variété (voir le tableau 2 et la figure 3).
Afin d’évaluer l’exactitude et la répétabilité de l’analyse, des échantillons blancs ont été enrichis de pesticides à trois niveaux de concentration différents (10, 100 et 400 μg/kg ; n = 5 pour chaque concentration). Les résultats de la figure 4 montrent le nombre de pesticides dont le pourcentage de récupération moyen se situait dans la fourchette acceptable de 70 à 120 % pour chaque type d’avocat. De plus, le tableau 3 présente des données détaillées pour toutes les valeurs spécifiques obtenues. Une proportion importante des pesticides testés présentait des pourcentages de récupération se situant dans la plage spécifique, avec des valeurs d’écart-type relatif (RSD) inférieures à 20 %.
Figure 1 : Représentation schématique de la méthode QuEChERS avec du formiate d’ammonium utilisé pour l’extraction des résidus de pesticides à partir d’échantillons d’avocats. Abréviations : QuEChERS = Qu ick-Easy-Ch eap-E ffective-R ugged-S afe ; IS = norme interne ; PSA = amine primaire-secondaire ; GCB = noir de carbone graphitisé ; QC = contrôle de la qualité ; GC-MS/MS = chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse en tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison des courbes d’étalonnage du solvant et des matrices pour le carbofuran. Solvant : y = 0,0028x - 0,0054 et R2 = 0,9974 ; Criollo : y = 0,0050x + 0,0050, R2 = 0,9994 et EM = 80 % ; Hass : y = 0,0037x - 0,0109, R2 = 0,9977 et ME = 30 % ; Lorena : y = 0,0041x + 0,0053, R2 = 0,9998 et EM = 42 %. Abréviations : ME = effet matriciel ; P-IS = norme interne procédurale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Nombre de pesticides sélectionnés classés par leurs gammes respectives d’EM pour les variétés d’avocats. La classification de l’EM est basée sur trois catégories : douce (valeurs comprises entre −20 % et 20 %), moyenne (valeurs comprises entre −20 % et −50 % ou entre 20 % et 50 %) et forte (valeurs supérieures à 50 % ou inférieures à −50 %). Abréviation : ME = effet de matrice. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Le nombre de pesticides qui se situent à l’extérieur et à l’intérieur de la plage de récupération acceptable a atteint des sommets de 10, 100 et 400 μg/kg (n = 15) dans les trois variétés d’avocats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Temps de rétention, quantificateurs et transitions de qualificateurs utilisés dans les analyses GC-MS/MS des pesticides sélectionnés, ainsi que dans les P-IS et I-IS. Abréviations : P-IS = norme interne procédurale ; I-IS = étalon interne d’injection ; GC-MS/MS = chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse en tandem ; HCB = hexachlorobenzène ; α-HCH = alpha-hexachlorocyclohexane ; β-HCH = bêta-hexachlorocyclohexane ; 4,4'-DDD = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthane ; 4,4'-DDE = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthylène ; 4,4'-DDT = 4,4'-dichlorodiphényltrichloroéthane ; TPP = phosphate de triphényle ; EPN = éthylnitrophénylphénylphénylphosphonothioate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Valeurs de l’effet matriciel (%) pour les pesticides sélectionnés dans différentes variétés d’avocats lors de la validation de la méthode d’analyse finale. Abréviations : HCB = hexachlorobenzène ; α-HCH = alpha-hexachlorocyclohexane ; β-HCH = bêta-hexachlorocyclohexane ; 4,4'-DDD = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthane ; 4,4'-DDE = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthylène ; 4,4'-DDT = 4,4'-dichlorodiphényltrichloroéthane ; TPP = phosphate de triphényle ; EPN = éthylnitrophénylphénylphénylphosphonothioate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Valeurs de récupération et leurs DRS correspondantes entre parenthèses (n = 5 à chaque niveau de dopage), toutes deux en %, pour les pesticides sélectionnés dans différentes variétés d’avocats lors de la validation de la méthode d’analyse finale. Abréviations : DSR = écarts-types relatifs ; HCB = hexachlorobenzène ; α-HCH = alpha-hexachlorocyclohexane ; β-HCH = bêta-hexachlorocyclohexane ; 4,4'-DDD = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthane ; 4,4'-DDE = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthylène ; 4,4'-DDT = 4,4'-dichlorodiphényltrichloroéthane ; TPP = phosphate de triphényle ; EPN = éthylnitrophénylphénylphénylphosphonothioate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Fichier supplémentaire 1 : Spectres de spectrométrie de masse de tous les pesticides. Abréviations : HCB = hexachlorobenzène ; α-HCH = alpha-hexachlorocyclohexane ; β-HCH = bêta-hexachlorocyclohexane ; 4,4'-DDD = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthane ; 4,4'-DDE = 4,4'-dichlorodiphényldichloroéthylène ; 4,4'-DDT = 4,4'-dichlorodiphényltrichloroéthane ; EPN = éthylnitrophénylphénylphénylphosphonothioate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La principale limitation associée à l’étalonnage matriciel provient de l’utilisation d’échantillons vierges comme étalons d’étalonnage. Cela conduit à une augmentation du nombre d’échantillons à traiter pour l’analyse et à une augmentation de l’injection de composants matriciels dans chaque séquence analytique, ce qui peut entraîner une augmentation des exigences de maintenance des instruments. Néanmoins, cette stratégie est plus adaptée que l’addition standard, qui générerait un nombre beaucoup plus important d’échantillons à injecter en raison de la nécessité d’effectuer une courbe d’étalonnage pour chaque échantillon. Par conséquent, dans les deux cas, l’utilisation de techniques de préparation d’échantillons qui minimisent cette co-extraction tout en restant rentables, rapides et fiables est nécessaire. Dans ce contexte, la méthode QuEChERS a démontré son utilité dans l’analyse des résidus de pesticides dans les échantillons d’avocats 8,12,13,14,15,16,17,18. Cependant, aucune de ces approches n’a exploré l’application de la méthode QuEChERS utilisant du formiate d’ammonium. Ce choix vise à atténuer les inconvénients de l’utilisation des sels de magnésium et de sodium dans l’analyse MS 23,24,25,26,27. Les sels de magnésium et de sodium ont tous deux de faibles pressions de vapeur qui ont tendance à former des dépôts solides sur les surfaces à l’intérieur de la source MS, ce qui peut potentiellement affecter les performances de l’instrument. Bien que ce phénomène se produise dans les systèmes de chromatographie liquide (LC), il pose également des défis dans le contexte de la GC, où ceux-ci peuvent s’accumuler dans la chemise d’entrée, nécessitant des remplacements plus fréquents de la chemise27. Pour surmonter ces limitations et améliorer la compatibilité avec la détection MS, la substitution de ces sels par des alternatives hautement volatiles a été mise en œuvre. Les sels d’ammonium sont préférés car ils peuvent être facilement évaporés et/ou décomposés, ce qui permet de surmonter les inconvénients. L’étude actuelle représente le premier exemple d’utilisation de la méthode QuEChERS utilisant du formiate d’ammonium pour l’analyse des résidus de pesticides dans les avocats. En particulier, le procédé d’extraction a consisté à soumettre l’échantillon d’avocat à une étape d’extraction à l’acétonitrile, avec l’ajout de 0,5 g de formiate d’ammonium par gramme d’échantillon pour faciliter le salage (figure 1).
En tant que deuxième étape de la méthode QuEChERS, l’étape dSPE est cruciale car elle sert à éliminer les composants indésirables de la matrice qui pourraient potentiellement conduire à des interférences analytiques26. Cependant, la réalisation d’une étape d-SPE efficace nécessite souvent une combinaison de divers sorbants pour traiter les diverses co-extractions provenant de la matrice de l’échantillon. Lorsqu’il s’agit d’avocats, cette étape peut inclure le MgSO4 anhydre pour éliminer l’excès d’eau et améliorer la répartition des pesticides, le PSA pour éliminer les acides gras, les acides organiques et les sucres, le C18 pour améliorer l’élimination des composants non polaires, le GCB pour l’élimination de la chlorophylle et les matériaux en zircone tels que Z-Sep+ pour éliminer de grandes quantités de matières grasses 15,26,28. Par conséquent, les extraits d’avocat ont été transférés dans des tubes à centrifuger contenant des quantités spécifiques de chaque sorbant : 150 mg de MgSO4 anhydre, 50 mg de PSA, 50 mg de C18, 10 mg de GCB et 60 mg de Z-Sep+ (Figure 1).
Pour amorcer le processus de validation des étapes d’extraction et de nettoyage, les courbes d’étalonnage ont été rigoureusement examinées. Il s’agissait d’évaluer les courbes d’étalonnage matricielles appariées pour chaque combinaison de variétés d’analyte et d’avocat, en plus des étalonnages à l’acétonitrile uniquement (figure 2). Dans les deux scénarios, un mélange d’analytes protecteurs29 proposé précédemment, composé de 3-éthoxy-1,2-propanediol, d’acide L-gulonique γ-lactone, de D-sorbitol et d’acide shikimique, a été utilisé. L’évaluation a porté sur la linéarité sur une plage de concentration de 5 à 600 μg/kg. La LCL de 5 μg/kg est inférieure à la LMR stricte de 10 μg/kg fixée par la réglementation internationale régissant l’analyse des résidus de pesticides dans les denrées alimentaires22. De plus, la LCL de 5 μg/kg a donné un rapport signal/bruit supérieur à 10 pour tous les pesticides multiclasses sélectionnés. Une inspection visuelle des parcelles d’étalonnage a également été effectuée pour vérifier la précision des valeurs de pente utilisées pour le calcul de l’EM. Les résultats ont indiqué que la plupart des pesticides sélectionnés présentaient des valeurs R2 supérieures ou égales à 0,99 sur les quatre courbes d’étalonnage de chacune d’entre elles. L’évaluation globale des résultats de l’étalonnage a démontré l’exactitude et la pertinence de ces équations pour des calculs précis de l’EM dans chaque variété d’avocat.
L’EM a été jugée molle (EM ≤ 20 %) pour la plupart des pesticides de chacune des trois variétés d’avocats étudiées (tableau 2 et figure 3). Dans ce contexte, trois points clés méritent d’être soulignés. Tout d’abord, les extraits finaux de l’échantillon étaient relativement propres en raison de l’efficacité du protocole de préparation des échantillons mis en œuvre, ce qui a permis de minimiser les interférences. Deuxièmement, dans les systèmes GC, les ME sont soumises aux influences découlant des interactions qui se produisent à l’intérieur de la matrice et des interactions qui se produisent sur les sites actifs du système29. Le mélange d’analytes protecteurs utilisé couvrait presque tout le spectre des pesticides. Cependant, les pesticides élués tôt (propoxur, dichlorvos, carbofuran et diphénylamine), ainsi que ceux élués plus tard (pyriproxyfène, fenvalérate, esfenvalérate et deltaméthrine), ont présenté les valeurs d’EM les plus élevées et les moins constantes. Troisièmement, compte tenu de ces différences, il a été décidé d’utiliser l’étalonnage matriciel de chaque variété séparément pour mener l’étude de récupération. Il est important de noter qu’une variété peut raisonnablement représenter les autres variétés pour les pesticides restants.
L’évaluation de la récupération et de la reproductibilité a été effectuée à trois niveaux de concentration différents (10, 100 et 400 μg/kg) dans le quintuple (n = 15). Pour ce faire, des échantillons d’avocats ont été dopés au début de l’application de la méthode QuEChERS. Les taux de récupération ont été calculés en comparant les rapports entre la surface du pic du pesticide et le pic du P-IS (atrazine-d5) obtenu à partir de l’étalonnage de la matrice. Chaque réplicat a été injecté en trois exemplaires dans la même séquence pour assurer la cohérence. L’utilisation d’un SI marqué isotopiquement permet de compenser les pertes potentielles de pesticides pendant le protocole, tout en tenant compte des erreurs méthodologiques et de la variabilité instrumentale. Les résultats ont montré que la plupart des pesticides répondaient aux critères acceptables, avec des taux de récupération allant de 70 à 120 % et une DSR inférieure à 20 % à chaque niveau de dopage6 (figure 4), ce qui indique l’efficacité et la répétabilité de la méthode. Cependant, certains pesticides ont montré des taux de récupération au-delà de cette plage acceptable (tableau 3). Il s’agit du cas de l’hexachlorobenzène (HCB), où les taux de récupération sont de l’ordre de 28 à 55 % pour tous les niveaux de concentration et toutes les matrices. Cela peut être attribué à la structure moléculaire plane du HCB, qui conduit à une forte affinité avec le GCB, provoquant sa rétention et réduisant l’efficacité de l’extraction30. Malgré les taux de récupération plus faibles pour le HCB et quelques autres cas, la méthode a tout de même démontré une récupération constante et fiable pour ces pesticides, les valeurs de DSR restant inférieures à la limite recommandée.
En conclusion, l’analyse des résidus de pesticides dans les échantillons d’aliments rencontre l’EM, ce qui peut avoir un impact sur la précision de la CGC-MS/MS. L’étalonnage matriciel s’avère être une stratégie simple et efficace pour atténuer ces effets, même dans les matrices telles que les avocats, qui sont riches en acides gras et autres matériaux co-extractifs tels que les pigments. Grâce à l’application de la méthode QuEChERS utilisant du formiate d’ammonium avec un étalonnage apparié à la matrice et des protecteurs d’analytes, une quantification très précise est obtenue. Par conséquent, cette approche garantit une analyse fiable et exécutoire des résidus de pesticides dans les échantillons d’avocats, ce qui la rend adaptée aux applications réglementaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier l’Université EAN et l’Université de La Laguna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Ethoxy-1,2-propanediol | Sigma Aldrich | 260428-1G | |
| Acetonitrile | Merk | 1006652500 | |
| Ammonium formate | Sigma Aldrich | 156264-1KG | |
| AOAC 20i/s autosampler | Shimadzu | 221-723115-58 | |
| Automatic shaker MX-T6-PRO | SCILOGEX | 8.23222E+11 | |
| Balance | OHAUS | PA224 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601002 | |
| Centrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 4610-1815 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602002 | |
| Centrifuge Z206A | MERMLE | 6019500118 | |
| Choper 2L | Oster | 2114111 | |
| Column SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm | Shimadzu | 221-75954-30 | MS GC column |
| Dispensette 5-50 mL | BRAND | 4600361 | |
| DSC-18 | Sigma Aldrich | 52600-U | |
| D-Sorbitol | Sigma Aldrich | 240850-5G | |
| Ethyl acetate | Merk | 1313181212 | |
| GCMS-TQ8040 | Shimadzu | 211552 | |
| Graphitized carbon black | Sigma Aldrich | 57210-U | |
| Injection syringe | Shimadzu | LC2213461800 | |
| L-Gulonic acid γ-lactone | Sigma Aldrich | 310301-5G | |
| Linner splitless | Shimadzu | 221-4887-02 | |
| Magnesium sulfate anhydrus | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Methanol | Panreac | 131091.12.12 | |
| Milli-Q ultrapure (type 1) water | Millipore | F4H4783518 | |
| Pipette tips 10 - 100 µL | Biologix | 200010 | |
| Pipette tips 100 - 1000 µL | Brand | 541287 | |
| Pipette tips 20 - 200 µL | Brand | 732028 | |
| Pipettes Pasteur | NORMAX | 5426023 | |
| Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL | BRAND | 704774 | |
| Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL | BRAND | 704780 | |
| Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL | SCILOGEX | 7.12111E+11 | |
| Primary-secondary amine | Sigma Aldrich | 52738-U | |
| Shikimic acid | Sigma Aldrich | S5375-1G | |
| Syringe Filter PTFE/L 25 mm, 0.45 µm | NORMAX | FE2545I | |
| Triphenyl phosphate (QC) | Sigma Aldrich | 241288-50G | |
| Vials with fused-in insert | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| Z-SEP+ | Sigma Aldrich | 55299-U | zirconium oxide-based sorbent |
| Pesticides | CAS registry number | ||
| 4,4´-DDD | Sigma Aldrich | 35486-250MG | 72-54-8 |
| 4,4´-DDE | Sigma Aldrich | 35487-100MG | 72-55-9 |
| 4,4´-DDT | Sigma Aldrich | 31041-100MG | 50-29-3 |
| Alachlor | Sigma Aldrich | 45316-250MG | 15972-60-8 |
| Aldrin | Sigma Aldrich | 36666-25MG | 309-00-2 |
| Atrazine | Sigma Aldrich | 45330-250MG-R | 1912-24-9 |
| Atrazine-d5 (IS) | Sigma Aldrich | 34053-10MG-R | 163165-75-1 |
| Buprofezin | Sigma Aldrich | 37886-100MG | 69327-76-0 |
| Carbofuran | Sigma Aldrich | 32056-250-MG | 1563-66-2 |
| Chlorpropham | Sigma Aldrich | 45393-250MG | 101-21-3 |
| Chlorpyrifos | Sigma Aldrich | 45395-100MG | 2921-88-2 |
| Chlorpyrifos-methyl | Sigma Aldrich | 45396-250MG | 5598-13-0 |
| Deltamethrin | Sigma Aldrich | 45423-250MG | 52918-63-5 |
| Dichloran | Sigma Aldrich | 45435-250MG | 99-30-9 |
| Dichlorvos | Sigma Aldrich | 45441-250MG | 62-73-7 |
| Dieldrin | Sigma Aldrich | 33491-100MG-R | 60-57-1 |
| Diphenylamine | Sigma Aldrich | 45456-250MG | 122-39--4 |
| Endosulfan A | Sigma Aldrich | 32015-250MG | 115-29-7 |
| Endrin | Sigma Aldrich | 32014-250MG | 72-20-8 |
| EPN | Sigma Aldrich | 36503-100MG | 2104-64-5 |
| Esfenvalerate | Sigma Aldrich | 46277-100MG | 66230-04-4 |
| Ethion | Sigma Aldrich | 45477-250MG | 563-12-2 |
| Fenamiphos | Sigma Aldrich | 45483-250MG | 22224-92-6 |
| Fenitrothion | Sigma Aldrich | 45487-250MG | 122-14-5 |
| Fenthion | Sigma Aldrich | 36552-250MG | 55-38-9 |
| Fenvalerate | Sigma Aldrich | 45495-250MG | 51630-58-1 |
| HCB | Sigma Aldrich | 45522-250MG | 118-74-1 |
| Iprodione | Sigma Aldrich | 36132-100MG | 36734-19-7 |
| Lindane | Sigma Aldrich | 45548-250MG | 58-89-9 |
| Malathion | Sigma Aldrich | 36143-100MG | 121-75-5 |
| Metalaxyl | Sigma Aldrich | 32012-100MG | 57837-19-1 |
| Methidathion | Sigma Aldrich | 36158-100MG | 950-37-8 |
| Myclobutanil | Sigma Aldrich | 34360-100MG | 88671-89-0 |
| Oxyfluorfen | Sigma Aldrich | 35031-100MG | 42874-03-3 |
| Parathion-methyl | Sigma Aldrich | 36187-100MG | 298-00-0 |
| Penconazol | Sigma Aldrich | 36189-100MG | 66246-88-6 |
| Pirimiphos-methyl | Sigma Aldrich | 32058-250MG | 29232-93-7 |
| Propiconazole | Sigma Aldrich | 45642-250MG | 60207-90-1 |
| Propoxur | Sigma Aldrich | 45644-250MG | 114-26-1 |
| Propyzamide | Sigma Aldrich | 45645-250MG | 23850-58-5 |
| Pyriproxifen | Sigma Aldrich | 34174-100MG | 95737-68-1 |
| Tolclofos-methyl | Sigma Aldrich | 31209-250MG | 5701804-9 |
| Triadimefon | Sigma Aldrich | 45693-250MG | 43121-43-3 |
| Triflumizole | Sigma Aldrich | 32611-100MG | 68694-11-1 |
| α-HCH | Sigma Aldrich | 33377-50MG | 319-86-8 |
| β-HCH | Sigma Aldrich | 33376-100MG | 319-85-7 |
References
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