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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

मल्टीप्लेक्स चक्रीय फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/66136
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4,5, *1
1Department of Pathology, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 2Department of Gastroenterology, Wu Han NO.1 Hospital, 3Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital, 4Departments of Biomedical Research Center, The Affiliated Calmette Hospital of Kunming Medical University & The First Hospital of Kunming, 5School of Medical, Yunnan University
* These authors contributed equally

Summary

मल्टीप्लेक्स चक्रीय इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री बार-बार एंटीजन-एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, इमेज स्कैनिंग और इमेज अलाइनमेंट और एकीकरण का उपयोग करके एक साथ कई मार्करों का पता लगाने की अनुमति देता है। यहां, हम फेफड़ों के कैंसर और युग्मित मस्तिष्क मेटास्टेसिस नमूनों में इस तकनीक के साथ प्रतिरक्षा कोशिका सब्सट्रेट की पहचान करने के लिए ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मेजबान कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, स्ट्रोमल कोशिकाओं और वाहिका के बीच बातचीत शामिल है। प्रतिरक्षा सेल सबसेट और लक्ष्य प्रोटीन की विशेषता और स्थानिक रूप से आयोजन रोगनिरोधी और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं। इससे मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला तरीकों का विकास हुआ है। मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री कई मार्करों का एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे सेल फ़ंक्शन और इंटरसेलुलर इंटरैक्शन की व्यापक समझ की सुविधा मिलती है। इस पत्र में, हम मल्टीप्लेक्स चक्रीय फ्लोरोसेंट immunohistochemistry परख और लिम्फोसाइट subsets की मात्रा का ठहराव विश्लेषण में अपने आवेदन के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन. मल्टीप्लेक्स चक्रीय फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के समान चरणों और अभिकर्मकों का पालन करता है, जिसमें एंटीजन पुनर्प्राप्ति, चक्रीय एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक स्लाइड पर धुंधला हो जाना शामिल है। एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के दौरान, विभिन्न प्रजातियों से एंटीबॉडी का मिश्रण तैयार किया जाता है। एंटीजन पुनर्प्राप्ति समय और एंटीबॉडी एकाग्रता जैसी स्थितियां सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए अनुकूलित और मान्य हैं। यह तकनीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इम्यूनोथेरेपी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य करती है।

Introduction

मस्तिष्क मेटास्टेस (बीएम) सबसे आम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के मामलों (एनएससीएलसी) के लगभग आधे हिस्से में होता है, जिसमें खराब रोग का निदानहोता है। प्रारंभिक निदान के समय अनुमानित 10% -20% एनएससीएलसी रोगियों में पहले से ही बीएम है, और लगभग 40% एनएससीएलसीमामले उपचार के दौरान बीएम विकसित करेंगे। ट्यूमर microenvironment (TME) बारीकी से NSCLC घटना और बीएम, इस तरह के रक्त वाहिकाओं, fibroblasts, मैक्रोफेज, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), लिम्फोइड, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और सिग्नलिंग अणुओं 3,4 के रूप में विभिन्न घटकों सहित के साथ जुड़ा हुआ है. माइक्रोएन्वायरमेंटल प्रतिरक्षा कोशिकाएं कैंसर कोशिका वृद्धि और विकास को प्रभावित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। मस्तिष्क मेटास्टेस जटिल प्रतिरक्षाविज्ञानी माइक्रोएन्वायरमेंट और सिग्नलिंग प्रक्रियाओं की विशेषता वाले कई संभावित उपचार लक्ष्य प्रस्तुत करते हैं। उदाहरण के लिए, पीडी -1 अवरोधकों ने प्रतिरक्षा-चेकपॉइंट अवरोधक (आईसीआई) के रूप में फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस (एलसीबीएम) वाले रोगियों के लिए नैदानिक प्रभावकारिता दिखाई है। हालांकि, पीडी -1 थेरेपी के लिए प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति प्राथमिक एनएससीएलसी और एलसीबीएम5 के बीच भिन्न होती है, यह सुझाव देती है कि ट्यूमर प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट एक महत्वपूर्ण आईसीआई नियामक के रूप में कार्य करता है।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) जीव विज्ञान, नींव चिकित्सा और विकृति विज्ञान के क्षेत्र में एक अमूल्य उपकरणहै 6. यह पता लगाने की विधि ऊतक स्लाइड 7 पर एंटीजन-एंटीबॉडी की बातचीत के माध्यम से एंटीजन अभिव्यक्ति की कल्पना करतीहै। आईएचसी भविष्य कहनेवाला मार्करों के निदान, रोगनिरोधी मार्करों का मूल्यांकन, लक्षित चिकित्सा मार्गदर्शन, और ट्यूमर कोशिकाओं8 के जैविक कार्यों की खोज के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, पारंपरिक आईएचसी विधि एक समय में केवल एक बायोमार्कर का पता लगा सकती है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रौद्योगिकी के नवाचार ने मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (एमएफआईएचसी) का विकास किया है, जो एक ही ऊतक स्लाइड पर कई प्रोटीन मार्करों की एक साथ पहचान के लिए अनुमति देता है, दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट क्षेत्र9 में। यह प्रगति TME के भीतर स्ट्रोमल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं के बीच सेल संरचना और आणविक बातचीत का सटीक विश्लेषण प्रदान करती है।

इस अध्ययन में, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए मल्टीप्लेक्स चक्रीय इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। खरगोश और चूहे जैसे विभिन्न प्रजातियों के दो प्राथमिक एंटीबॉडी को एक साथ इनक्यूबेशन के लिए चुना जाता है, इसके बाद प्रतिदीप्ति-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी होते हैं। एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के प्रत्येक दौर के बाद एंटीजन पुनर्प्राप्ति की जाती है। ऑटोफ्लोरेसेंस अवरुद्ध है, और 4 ', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) का उपयोग नाभिक को धुंधला करने के लिए किया जाता है। पैनल में सीडी 3, सीडी 8, सीडी 20 और सीके का अनुक्रमिक पता लगाना शामिल है, कोशिकाओं को मार्करों के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है: ट्यूमर कोशिकाएं (सीके +), परिपक्व टी कोशिकाएं (सीडी 3 +), साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाएं (सीडी 3 + सीडी 8 +), बी कोशिकाएं (सीडी 20 +) 10,11।

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Protocol

शोध को युन्नान कैंसर अस्पताल की चिकित्सा आचार समिति / कुनमिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी के तीसरे संबद्ध अस्पताल द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी विषयों/कानूनी अभिभावकों ने सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए।

1. स्लाइड की तैयारी

  1. एक माइक्रोटोम का उपयोग करके 4 माइक्रोन की मोटाई पर प्राथमिक फेफड़े के ट्यूमर या फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेस कोशिकाओं वाले युग्मित पैराफिन ब्लॉक के वर्गों को काटें। पानी के लिए वर्गों निकालें और चिमटी के साथ अलग, सबसे अच्छा एक का चयन करें और polylysine लेपित स्लाइड पर इसका पालन करें.
  2. ऊतक आसंजन को बढ़ाने के लिए 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में ऊतकों की स्लाइड रखें।
  3. तीन परिवर्तनों के माध्यम से xylene में स्लाइड विसर्जित करें, प्रत्येक 10 मिनट के लिए स्थायी है।
  4. धीरे-धीरे शराब एकाग्रता को कम करें और 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड सेते हैं, 5 मिनट के लिए 90% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल, और 3 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में।

2. हीट-प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति (HIER)

  1. विआयनीकृत पानी में 100x सोडियम साइट्रेट बफर समाधान (पीएच 6.0) से 1x (10 मिमी) पतला, स्लाइड को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त बफर समाधान तैयार करना।
  2. एक प्रेशर कुकर में स्लाइड्स रखें, उन्हें उच्च गर्मी (100 डिग्री सेल्सियस) और दबाव (~ 30 साई) के अधीन 2 मिनट के लिए. गर्म करने के बाद, स्लाइड 3 मिनट के लिए आसुत जल में कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. पीबीएस बफर समाधान (पीएच 7.0) तैयार करने के लिए विआयनीकृत पानी के 5 एल में फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस; पाउडर) के 52 ग्राम का एक पैकेट भंग करें। 3 परिवर्तन के साथ, 5 मिनट के लिए पीबीएस बफर समाधान में स्लाइड रखें.

3. पेरोक्सीडेज अवरुद्ध

  1. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ वर्गों को कवर करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस में स्लाइड्स कुल्ला, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x.
  2. ऊतक की परिधि से दूर अतिरिक्त पानी को अवशोषित करने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें। इस बीच, सुनिश्चित करें कि ऊतक नम है।

4. पहले दौर के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. सीडी 8 (खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, क्लोन एसपी 16) और सीडी 20 (माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, क्लोन एल 26) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी का एक काम मिश्रण तैयार करें, बॉन्ड प्राथमिक एंटीबॉडी मंदक में 1:50 पतला।
  2. वर्गों पर एंटीबॉडी परिसर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. 0.1% ट्वीन/फॉस्फेट-बफर खारा का घोल तैयार करें: पीबीएस बफर समाधान के 1 एल में ट्वीन का 1 एमएल।
  4. 0.1% ट्वीन/फॉस्फेट-बफर खारा, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3x के साथ वर्गों को धो लें। ऊतक की परिधि से अतिरिक्त पानी खींचने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें, इस बीच, सुनिश्चित करें कि ऊतक नम है।

5. पहले दौर के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. प्रतिदीप्ति लेबल बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी (उत्तेजना (पूर्व): 495 एनएम) और बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (पूर्व: 578 एनएम), फॉस्फेट बफर खारा में 1:50 पतला का मिश्रण तैयार करें। बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी सीडी 8 के प्राथमिक एंटीबॉडी से जुड़ता है, और बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी सीडी 20 के प्राथमिक एंटीबॉडी से जुड़ता है।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण ड्रॉपवाइज जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।

6. गर्मी से प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति और पेरोक्सीडेज अवरुद्ध

  1. विआयनीकृत पानी में 100x सोडियम साइट्रेट (पीएच 6.0) से 1x (10 मिमी) पतला, स्लाइड को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त बफर समाधान तैयार करना।
  2. स्लाइड्स को प्रेशर कुकर में रखें और उन्हें 1 मिनट के लिए उच्च गर्मी (100 डिग्री सेल्सियस) और दबाव (~ 30 साई) के अधीन करें। गर्म करने के बाद, 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए आसुत जल में स्लाइड रखें.
  3. चरण 3 में वर्णित के रूप में पेरोक्सीडेज अवरुद्ध करें।

7. दूसरे दौर के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. सीडी 3 (खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, क्लोन एसपी 7) और सीके (माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एमएक्स 005) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी का एक कामकाजी मिश्रण तैयार करें, प्राथमिक एंटीबॉडी मंदक में 1:50 पतला।
  2. वर्गों पर एंटीबॉडी परिसर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. 0.1% ट्वीन/फॉस्फेट-बफर खारा के साथ धोएं, प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x। ऊतक की परिधि से अतिरिक्त पानी खींचने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें, इस बीच, सुनिश्चित करें कि ऊतक नम है।

8. दूसरे दौर के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. बकरी विरोधी खरगोश (पूर्व: 652 एनएम) और बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (पूर्व: 590 एनएम) मिश्रण तैयार करें, फॉस्फेट बफर खारा में कमजोर पड़ने 1:50। बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी सीडी 3 के प्राथमिक एंटीबॉडी से जुड़ता है, और बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी सीके के प्राथमिक एंटीबॉडी से जुड़ता है।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण ड्रॉपवाइज जोड़ें, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 0.1% ट्वीन/फॉस्फेट-बफर खारा के साथ धोएं, प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x।

9. ऑटोफ्लोरेसेंस शमन और DAPI धुंधला हो जाना

  1. 1 मिनट के लिए ऊतक अनुभाग में अभिकर्मक (0.15 एम/एल केएमएनो4) जोड़ें। 5 मिनट के लिए बहते पानी से कुल्ला।
    सावधानी: केएमएन4 विषाक्त है और त्वचा को नुकसान पहुंचाता है। स्लाइड्स को संभालते समय दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें। यदि तरल त्वचा पर टपकता है, तो इसे साफ नैपकिन से जल्दी से पोंछ लें और बहते पानी से धो लें।
  2. प्रत्येक एकाग्रता में 3 मिनट के लिए शराब (70%, 90%, 100%) की बढ़ती सांद्रता के साथ स्लाइड सूखी.
  3. मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग के लिए DAPI और coverslip जोड़ें। DAPI की मात्रा ऊतक के आकार पर निर्भर करती है। सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से कवरस्लिप जोड़ा जाता है के बाद DAPI द्वारा कवर किया गया है.

10. स्लाइड स्कैनिंग

  1. स्लाइड्स को एक ट्रे पर रखें और तब तक पुश करें जब तक कि इसे आगे न धकेला न जा सके।
  2. प्रोग्राम शुरू करने के लिए, डेस्कटॉप पर प्रोग्राम आइकन पर डबल-क्लिक करें। स्टार्ट-अप के दौरान, मोड चयन विंडो प्रदर्शित होती है। चयन विंडो दो ब्राइटफ़ील्ड और फ्लोरोसेंट मोड प्रदर्शित करती है: स्वचालित मोड और मैनुअल मोड। फ्लोरोसेंट स्कैन मोड में, स्वचालित मोड क्लिक करें.
  3. माउस कर्सर को ऊपर ले जाएँ? सेटिंग्स के बारे में जानकारी प्रदर्शित करने के लिए बटन। चैनल नंबर > छद्म रंग चुनने के लिए फ़िल्टर सेटिंग > चैनल पर क्लिक करें। रंग को परिभाषित करें और सहेजें।
  4. पूर्ण स्वचालित > स्कैनिंग मोड > रूटीन कार्य पर क्लिक करें. आउटपुट के लिए स्लाइड नाम निर्धारित करने के लिए स्लाइड नाम > रूटीन कार्य क्लिक करें. फ़िल्टर चुनने के लिए रूटीन कार्य > चैनल सेटिंग्स पर क्लिक करें.
  5. क्लिक करें,नियमित कार्य > स्कैन विकल्प वर्चुअल स्लाइड के परिणामी गुणवत्ता और संग्रह स्थान निर्धारित करने के लिए।
  6. थ्रेशोल्ड सेटिंग और स्कैन की जाने वाली श्रेणी के चयन के लिए पूर्वावलोकन पर क्लिक करें.
  7. क्लिक करें हार्डवेयर > फ़िल्टर > लाइव > ऑटो फोकस > ऑटो एक्सपोजर > डिजिटल लाभ > टिक मैन्युअल एक्सपोज़र समय का उपयोग करें > सीमा को सीमित करते हुए टिक करें > वर्तमान सेट करें।
  8. स्कैन प्रारंभ करने > रूटीन कार्य क्लिक करें. आवर्धन स्तर को 20x या 40x के रूप में चुनें। उपयुक्त फ़ाइल आकारों के लिए 20x चुनें। MRXS एक्सटेंशन को 3D Pannoramic MIDI स्कैनर द्वारा परिभाषित किया गया है। इमेज एक्सटेंशन को TIFF इमेज में भी बदला जा सकता है।
  9. कॉन्फोकल के लिए छवि चुनने के लिए स्लाइड व्यूअर > मल्टीव्यू टूलबॉक्स पर क्लिक करें, फिर छवि को संरेखित और एकीकृत करें।

11. सेल घनत्व का मात्रात्मक मूल्यांकन

  1. हेलो 10 स्कैनर सॉफ्टवेयर के साथ ट्यूमर और स्ट्रोमा क्षेत्रों में सकारात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं (सीडी 3 +, सीडी 3 + सीडी 8 +, सीडी 20 +) के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करें। ट्यूमर ऊतक को परिभाषित करने के लिए सीके धुंधला मान्य करें।

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Representative Results

हम एक स्लाइड पर 5 रंग मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति का उपयोग कर चक्रीय प्रतिजन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. परख के हमारे अनुकूलन के माध्यम से, हम विभिन्न प्रजातियों (चित्रा 1) से दो एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन को सक्षम करते हैं। प्रयोग प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरणों में एक प्रेशर कुकर और इम्यूनोस्टेनिंग बॉक्स(चित्रा 2ए)शामिल हैं।

परख को पूरा करने के बाद, हम स्लाइड्स को स्कैन करने से पहले चार मार्करों के छद्म रंग को परिभाषित करते हैं। CD3, CD8, CD20 और CK के छद्म रंग क्रमशः पीले, लाल, हरे और सियान हैं। नाभिक को DAPI के साथ लेबल किया जाता है। ट्यूमर और स्ट्रोमा के प्रतिनिधि क्षेत्रों को विश्लेषण के लिए चुना जाता है। 495 एनएम, 578 एनएम, 652 एनएम और 590 एनएम पर फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम 3 डी स्वचालित डिजिटल स्लाइड स्कैनर का उपयोग करके कब्जा कर लिया जाता है। एक प्रतिनिधि स्टैक छवि और फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेस ऊतक में एकल लेबल छवियों चित्रा 2 बी में दिखाया गया है. एकल मार्कर प्रतिदीप्ति संकेत युक्त छवियों के आधार पर, स्कैनर सॉफ्टवेयर छद्म रंग के आधार पर सेल फेनोटाइप विशेषताओं निकाले. सकारात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं और कुल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की इसी संख्या को भी गिना गया था। प्रत्येक दाग प्रोटीन का स्तर एच स्कोर12 की गणना के द्वारा पता चला ऊतकों में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. इन प्रक्रियाओं के बाद, प्रत्येक ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइटों प्रकार की संख्या और लक्ष्य कोशिकाओं की कुल संख्या में प्रत्येक सेल प्रकार के अनुपात की गणना और विश्लेषण किया जाता है। प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का अनुपात ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइटों का प्रभावी प्रतिशत प्रस्तुत करता है। प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर वर्गों की तुलना में फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेस में सीडी 3 +, सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं और सीडी 20 + बी कोशिकाओं का प्रतिशत विश्लेषण किया गया था। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में दिखाए जाते हैं. प्रतिरक्षा कोशिकाओं का घनत्व (सीडी 3 + टी कोशिकाएं, सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाएं) प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर की तुलना में फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेस में कम है। सीडी 20+ बी कोशिकाएं प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर समूह की तुलना में मस्तिष्क मेटास्टेसिस समूह में अधिक होती हैं। हालांकि, परिणाम सीमित नमूनों के लिए इन दो समूहों के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं हैं।

Figure 1
चित्रा 1: मल्टीप्लेक्स चक्रीय प्रतिदीप्ति immunohistochemistry धुंधला का कार्यप्रवाह। 4 माइक्रोन वर्गों में कटौती और चिपकने वाला स्लाइड पर पालन कर रहे हैं. निम्नलिखित ऑपरेटिंग चरण किए जाते हैं: deparaffinization और पुनर्जलीकरण, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति, प्रतिजन अवरुद्ध, प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण इनक्यूबेशन, माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, फिर एंटीजन पुनर्प्राप्ति, एंटीजन अवरुद्ध, प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण इनक्यूबेशन और माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के चरणों को दोहराते हुए, ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करके, स्लाइड स्कैनिंग के लिए उपयुक्त फ़िल्टर का चयन करना और परिणामों का विश्लेषण करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति immunohistochemistry धुंधला के संचालन के तरीके। एंटीजन उपचार प्रेशर कुकर में वर्गों को गर्म करके किया जाता है। (ए) प्रेशर कुकर का उपयोग गर्मी प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति के लिए किया जाता है। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन की प्रक्रिया में, स्लाइड को इम्यूनोस्टेनिंग बॉक्स में रखा जाता है। (बी) फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेस ऊतक में इस्तेमाल पैनल के लिए प्रतिनिधि समग्र और एकल दाग छवियों. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर और फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेस के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात। सीडी 3 +, सीडी 3 + सीडी 8 +, सीडी 20 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अनुपात चार फेफड़ों के कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेस ऊतकों में युग्मित प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों (त्रुटि सलाखों: मानक विचलन) से कम है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने मल्टीप्लेक्स चक्रीय प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होने की प्रक्रिया का वर्णन किया है। प्राथमिक एंटीबॉडी चयन प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परख का एक महत्वपूर्ण पहलू है, और बेहतर विशिष्टता और दोहराव के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की सिफारिश की जाती है। प्राथमिक एंटीबॉडी के काम एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए, dilutions की एक श्रृंखला immunohistochemistry प्रयोगों के माध्यम से परीक्षण किया गया है. दोनों सकारात्मक नियंत्रण (लक्ष्य प्रतिजन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए) और नकारात्मक नियंत्रण (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन) आवश्यक हैं और स्थापित किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में, प्राथमिक एंटीबॉडी पतला और विभिन्न प्रजातियों से एक मिश्रण के लिए तैयार कर रहे हैं. प्रतिदीप्ति-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी भी उसी तरह से जमा और ऊष्मायन किए जाते हैं, जो विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त होते हैं। इसलिए, महत्वपूर्ण कदम एंटीजन के आधार पर विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए प्रजातियों का चयन कर रहा है, और पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को प्राथमिकता दी जाती है। ये सुनिश्चित कर सकते हैं कि प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी के बीच संयोजन विशिष्ट है। मिश्रित तरल को प्राथमिक एंटीबॉडी दोनों के लिए काम करने की एकाग्रता प्राप्त करनी चाहिए और क्रॉस-रिएक्टिविटी एक साथ दो एंटीबॉडी के बीच मौजूद नहीं होनी चाहिए। यदि प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही प्रजाति के हैं, तो एक माध्यमिक एंटीबॉडी को पहले ऊष्मायन किया जाता है, फिर दूसरा। एक पैनल में प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के अनुक्रम का निर्धारण करते समय, एंटीबॉडी को प्राथमिकता दी जानी चाहिए जो एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के प्रति संवेदनशील हैं, कम अभिव्यक्ति एंटीजन के लिए, तीव्रता दूसरे एपिटोप पुनर्प्राप्ति के दौरान मजबूत होगी। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के दूसरे दौर से पहले, दोहराए जाने वाले एंटीजन पुनर्प्राप्ति में पहले ऑपरेशन (2 मिनट) की तुलना में कम समय (1 मिनट) लगता है। पिछले चक्रीय धुंधला से प्रतिदीप्ति तीव्रता कम नहीं होगा, भले ही वर्गों गर्मी प्रेरित पुनर्प्राप्ति दो बार गुजरना होगा. गैर-विशिष्ट इम्यूनोएक्टिविटी से बचने के लिए, इनक्यूबेशन स्थितियों को एंटीबॉडी वर्किंग एकाग्रता, इनक्यूबेशन समय और पर्यावरणीय तापमान सहित अनुकूलित करने की आवश्यकता है।

हाल के दशकों में एपिटोप पुनर्प्राप्ति के विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है, मुख्य रूप से गर्मी-प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति (एचआईआर) और प्रोटीज़-प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति (पीआईआर) में विभाजित किया गया है। हीटिंग एक कुशल एंटीजन पुनर्प्राप्ति विधि है जो एंटीजन एपिटोप्स को उजागर करती है, जिससे उन्हें एंटीबॉडी13 द्वारा अधिक प्रभावी ढंग से पता लगाया जाता है। एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए दो मुख्य विकल्प साइट्रेट बफर और उच्च पीएच ईडीटीए बफर14 पर आधारित हैं। अनुकूलित पुनर्प्राप्ति स्थिति लक्ष्य प्रतिजन के अनुसार पहचानी जाती है।

ऑटोफ्लोरेसेंस अंतर्जात फ्लोरोफोर्स और ऊतक प्रसंस्करण15 में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों के कारण वर्गों पर फ्लोरोसेंट इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है। क्षालन के लिए एक संबद्ध अभिकर्मक का उपयोग आवश्यक है। फ्लोरोफोर्स को ऑटोफ्लोरेसेंस चोटियों (लगभग 490 एनएम)16,17से बचने के उत्सर्जन चोटियों के साथ चुना जाता है। सूडान ब्लैक बी और NaBH4 ऊतक autofluorescence18,19 शमन के लिए सूचित किया गया है. सूडान ब्लैक बी और NaBH4 के संयोजन ने लक्षित वृक्क फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक20 में प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि को कम कर दिया। इस प्रोटोकॉल में, 0.15 M/L की एकाग्रता में KMnO4 का ऊतक उपचार 1 मिनट के लिए समय की बचत है। KMnO4 सहज प्रतिदीप्ति को परिरक्षण के लिए ऊतक पर एक परत को कवर करता है और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करता है, पता चला प्रोटीन का विशिष्ट धुंधला अधिक कल्पना की जाती है।

पूरी स्लाइड चार अलग-अलग फिल्टर चैनलों में स्कैन की जाती हैं, छवि संरेखण विश्लेषण आवश्यक है, एकल-सेल और उपकोशिकीय संरचनाओं के स्थानीयकरण को संरेखित करना एक बड़ी चुनौती है। इस तकनीक से मल्टीस्पेक्ट्रल छवियों के लिए, वर्णक्रमीय क्रॉसस्टॉक से बचने के लिए पेशेवर प्रकाश इमेजिंग उपकरण और मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है। उपकरण की महंगी लागत इसके आवेदन को सीमित करती है। दो एंटीबॉडी के सह-इनक्यूबेशन से समय की बचत होती है, खासकर जब 6-मार्कर पैनल से निपटते हैं, जिसके लिए इनक्यूबेशन के 3 चक्रों की आवश्यकता होती है। इस तकनीक का उपयोग ट्यूमर प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन की कल्पना करने के लिए किया जाता है। भविष्य में, विधि ट्यूमर से जुड़े तृतीयक लिम्फोइड संरचनाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए लागू किया जाएगा।

सारांश में, मल्टीप्लेक्स चक्रीय प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक ही स्लाइड पर व्यक्तिगत रूप से लेबल किए गए फ्लोरोफोर्स द्वारा कई लक्ष्यों को दागने में सक्षम बनाता है। यह परख ट्यूमर प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट में कोशिकाओं के स्थानिक वितरण की बेहतर समझ प्रदान करता है, और ट्यूमर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं की स्थानिक निकटता उन रोगियों की जांच में योगदान करती है जो इम्यूनोथेरेपी से लाभान्वित होंगे।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पत्र में रिपोर्ट किए गए कार्यों को प्रभावित करने के लिए प्रकट हो सकते थे।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (NO.81860413, 81960455), युन्नान साइंस एंड टेक्नोलॉजी डिपार्टमेंट फंड (202001AY070001-080), साइंटिफिक रिसर्च फाउंडेशन ऑफ एजुकेशन डिपार्टमेंट ऑफ युन्नान प्रोविंस (2019J1274) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15 mol/L KmnO4 Maixin Biotechnology Co. Ltd. MST-8005
100x sodium citrate  Maixin Biotechnology Co., Ltd MVS-0100
3% hydrogen peroxide Maixin Biotechnology Co., Ltd SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI 3D histech Ltd Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488 Abcam ab150113
Alexa Fluor 568  Abcam ab175701
Alexa Fluor 594 Abcam ab150116
Alexa Fluor 647 Abcam ab150079
Bond primary antibody diluent Lecia AR9352
CD20 Maixin Biotechnology Co., Ltd kit-0001
CD3 Maixin Biotechnology Co., Ltd.  kit-0003
CD8  Maixin Biotechnology Co., Ltd RMA-0514
CK Maixin Biotechnology Co. Ltd. MAB-0671,
DAPI sig-ma D8417
ethanol Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD 10009218
Histocore Multicut lecia 2245
PBS(powder) Maixin Biotechnology Co., Ltd PBS-0061
slide viwer  3D histech Ltd
xylene Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD 10023418

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 203 मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री फेफड़ों का कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस प्रतिरक्षा कोशिकाएं
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Chen, Y., Zhang, H., Fan, Y., Yang, L., Dong, Y. Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (203), e66136, doi:10.3791/66136 (2024).

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