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Biology

फोटोबायोमॉड्यूलेशन वृद्धि के साथ एक हाइड्रोजेल में वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की तीन आयामी सेल संस्कृति

Published: April 5, 2024 doi: 10.3791/66616
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laser Research Centre, Faculty of Health Science, University of Johannesburg

Summary

यहां, हम वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एडीएससी) संस्कृति के लिए त्रि-आयामी (3 डी) सेल कल्चर फ्रेमवर्क के रूप में हाइड्रोजेल के उपयोग का प्रदर्शन करने वाला एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और 3 डी संस्कृति सेटिंग के भीतर एडीएससी के प्रसार को बढ़ाने के लिए फोटोबायोमॉड्यूलेशन (पीबीएम) शुरू करते हैं।

Abstract

वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एडीएससी), स्टेम कोशिकाओं के समान मल्टीपोटेंट मेसेनकाइमल विशेषताओं को रखने वाले, अक्सर सेल भेदभाव की एक विविध श्रेणी के लिए उनकी क्षमता और प्रवास, प्रसार को बढ़ाने और सूजन को कम करने की उनकी क्षमता के कारण पुनर्योजी चिकित्सा में नियोजित होते हैं। हालांकि, ADSC को अक्सर घावों के भीतर जीवित रहने और उभार में चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, मुख्य रूप से प्रतिकूल भड़काऊ स्थितियों के कारण। इस मुद्दे को हल करने के लिए, घावों में एडीएससी व्यवहार्यता को बनाए रखने और घाव भरने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए हाइड्रोजेल विकसित किए गए हैं। यहां, हमने 3 डी सेल संस्कृति ढांचे के भीतर एडीएससी प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी पर फोटोबायोमॉड्यूलेशन (पीबीएम) के सहक्रियात्मक प्रभाव का आकलन करने का लक्ष्य रखा है। अमर ADSC को 2.5 x 103 कोशिकाओं के घनत्व पर 10 μL हाइड्रोगेल में वरीयता दी गई थी और 5 J/cm2 और 10 J/cm2 के प्रवाह पर 525 nm और 825 nm डायोड का उपयोग करके विकिरण के अधीन किया गया था। रूपात्मक परिवर्तन, साइटोटॉक्सिसिटी और प्रसार का मूल्यांकन 24 घंटे और 10 दिनों के बाद पीबीएम एक्सपोजर में किया गया था। ADSC ने एक गोल आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया और व्यक्तिगत कोशिकाओं या गोलाकार समुच्चय के रूप में पूरे जेल में बिखरे हुए थे। महत्वपूर्ण रूप से, पीबीएम और 3 डी संस्कृति ढांचे दोनों ने कोशिकाओं पर कोई साइटोटोक्सिक प्रभाव प्रदर्शित नहीं किया, जबकि पीबीएम ने एडीएससी की प्रसार दर में काफी वृद्धि की। अंत में, यह अध्ययन एडीएससी संस्कृति के लिए उपयुक्त 3 डी वातावरण के रूप में हाइड्रोजेल के उपयोग को प्रदर्शित करता है और पीबीएम को एक महत्वपूर्ण वृद्धि रणनीति के रूप में पेश करता है, विशेष रूप से 3 डी सेल संस्कृति से जुड़ी धीमी प्रसार दर को संबोधित करता है।

Introduction

ADSC मेसेनकाइमल मल्टीपोटेंट पूर्वज कोशिकाएं हैं जिनमें आत्म-नवीनीकरण और कई सेल वंशों में अंतर करने की क्षमता होती है। इन कोशिकाओं को एक लिपोएस्पिरेशन प्रक्रिया 1 के दौरान वसा ऊतक के स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) से काटा जा सकताहै। ADSC पुनर्योजी चिकित्सा में उपयोग करने के लिए एक आदर्श स्टेम सेल प्रकार के रूप में उभरा है क्योंकि ये कोशिकाएं प्रचुर मात्रा में हैं, फसल के लिए न्यूनतम इनवेसिव, आसानी से सुलभ, और अच्छी तरह से विशेषता2. स्टेम सेल थेरेपी सेल प्रवास उत्तेजक द्वारा घाव भरने के लिए एक संभावित एवेन्यू प्रदान करता है, प्रसार, नवसंवहनीकरण, और घावों 3,4 के भीतर सूजन को कम करने. ADSC की पुनर्योजी क्षमता का लगभग 80% उनके सेक्रेटोम5 के माध्यम से पैराक्राइन सिग्नलिंग के कारण होता है। पहले, यह क्षतिग्रस्त ऊतक में स्टेम कोशिकाओं या विकास कारकों के एक प्रत्यक्ष स्थानीय इंजेक्शन का सुझाव दिया गया था विवो मरम्मत तंत्र 6,7,8में पर्याप्त अवैध हो सकता है. हालांकि, इस दृष्टिकोण को कई चुनौतियों का सामना करना पड़ा, जैसे कि खराब अस्तित्व और भड़काऊ वातावरण 9 के परिणामस्वरूप क्षतिग्रस्त ऊतकों के भीतर स्टेम सेल एनग्राफ्टमेंट कम हो गया। इसके अलावा, उद्धृत कारणों में से एक प्रत्यारोपित कोशिकाओं10 के अस्तित्व और कार्यक्षमता का समर्थन करने के लिए एक बाह्य मैट्रिक्स की कमी थी. इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, स्टेम सेल व्यवहार्यता और कार्य का समर्थन करने के लिए अब बायोमटेरियल वाहक के विकास पर जोर दिया जा रहा है।

त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति इन विट्रो में सेल-टू-सेल और सेल-टू-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को बढ़ाती है ताकि एक ऐसा वातावरण प्रदान किया जा सके जो विवो पर्यावरण 11 में बेहतर जैसा दिखता है। हाइड्रोगेल का बड़े पैमाने पर बायोमटेरियल वाहक के एक वर्ग के रूप में अध्ययन किया गया है जो स्टेम सेल संस्कृति के लिए 3 डी वातावरण प्रदान करते हैं। ये संरचनाएं पानी और क्रॉसलिंक्ड पॉलिमर12 से बनी होती हैं। हाइड्रोजेल में एडीएससी के एनकैप्सुलेशन में कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए संस्कृति के दौरान कोशिकाओं पर लगभग कोई साइटोटोक्सिक प्रभाव नहींपड़ता है। 3 डी में सुसंस्कृत स्टेम कोशिकाओं उनके स्टेमनेस की बढ़ी हुई प्रतिधारण और बेहतर भेदभाव क्षमता13 प्रदर्शित करते हैं. इसी तरह, हाइड्रोजेल वरीयता प्राप्त ADSCs वृद्धि हुई व्यवहार्यता और पशु मॉडल14 में त्वरित घाव बंद करने का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, हाइड्रोजेल एनकैप्सुलेशन काफी घावों15,16 में ADSC के engraftment और प्रतिधारण बढ़ जाती है. TrueGel3D एक बहुलक से बना है, या तो पॉलीविनाइल अल्कोहल या डेक्सट्रान, एक क्रॉसलिंकर द्वारा ठोस, या तो साइक्लोडेक्सट्रिन या पॉलीथीन ग्लाइकॉल17। जेल एक सिंथेटिक हाइड्रोजेल है जिसमें कोई भी पशु उत्पाद नहीं होता है जो प्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकता है या एक रोगी में जेल के प्रत्यारोपण के दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर कर सकता है, जबकि प्रभावी रूप से एक बाह्य मैट्रिक्स18 की नकल करता है। जेल संरचना और व्यक्तिगत घटकों को बदलकर पूरी तरह से अनुकूलन योग्य है। यह विभिन्न स्टेम कोशिकाओं घर और जेल19 की कठोरता को समायोजित करके कई सेल प्रकार के भेदभाव का समर्थन कर सकते हैं. अनुलग्नक साइटों पेप्टाइड्स20 के अतिरिक्त के माध्यम से बनाया जा सकता है. जेल metalloproteases के स्राव से सड़ने योग्य है, सेल प्रवास21 के लिए अनुमति देता है. अंत में, यह स्पष्ट है और इमेजिंग तकनीकों के लिए अनुमति देता है।

पीबीएम इंट्रासेल्युलर क्रोमोफोर्स को उत्तेजित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले निम्न-स्तरीय लेजर थेरेपी का एक न्यूनतम इनवेसिव और आसानी से प्रदर्शन किया जाने वाला रूप है। विभिन्न तरंग दैर्ध्य कोशिकाओं22 पर विभिन्न प्रभाव प्राप्त करते हैं। लाल से निकट-अवरक्त सीमा में प्रकाश इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला23 के माध्यम से प्रवाह को बढ़ाकर एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन में वृद्धि को उत्तेजित करता है। नीले और हरे रंग की श्रेणियों में प्रकाश प्रकाश gated आयन चैनलों को उत्तेजित करता है, इस तरह के कैल्शियम और मैग्नीशियम के रूप में पिंजरों के गैर विशिष्ट प्रवाह के लिए अनुमति देता है, कोशिकाओं में, जो भेदभाव24 को बढ़ाने के लिए जाना जाता है. शुद्ध प्रभाव माध्यमिक दूतों की पीढ़ी है जो प्रवासन, प्रसार और भेदभाव25 जैसे डाउनस्ट्रीम सेलुलर प्रक्रियाओं को ट्रिगर करने वाले कारकों के प्रतिलेखन को उत्तेजित करता है। पीबीएम का उपयोग कोशिकाओं को प्रतिकूल वातावरण में प्रत्यारोपित करने से पहले प्रसार या अंतर करने के लिए कोशिकाओं को पूर्व-स्थिति के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, क्षतिग्रस्त ऊतक26। पूर्व और बाद प्रत्यारोपण पीबीएम (630 एनएम और 810 एनएम) ADSC के जोखिम काफी एक मधुमेह चूहा मॉडल27 में विवो में इन कोशिकाओं की व्यवहार्यता और समारोह में वृद्धि हुई. पुनर्योजी चिकित्सा ऊतकों की प्रभावी मरम्मत के लिए कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या की आवश्यकताहोती है 28. 3 डी सेल संस्कृति में, एडीएससी दो आयामी सेल संस्कृति6 की तुलना में धीमी प्रसार दर के साथ जुड़े हुए हैं। हालांकि, पीबीएम का उपयोग व्यवहार्यता, प्रसार, प्रवास और भेदभाव 29,30को बढ़ाकर एडीएससी की 3 डी सेल संस्कृति प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। प्रोटोकॉल रेखांकन चित्रा 1 में संक्षेप में किया गया है.

1. द्वि-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति

नोट: अमर ADSC (1 x106 कोशिकाओं) सेल ठंड मीडिया के 1 एमएल युक्त क्रायोप्रिजर्वेशन शीशी में तरल नाइट्रोजन में -195.8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं.

  1. 2 डी सेल वसूली माध्यम और 2 डी संस्कृति फ्लास्क की तैयारी
    1. बेसल माध्यम के 39 एमएल को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें
    2. 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस; 10 एमएल) और एंटीबायोटिक दवाओं (1 एमएल) (0.5 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.5 एमएल एम्फोटेरिसिन बी) के साथ बेसल माध्यम को समृद्ध करें।
    3. सेल रिकवरी माध्यम के 6 एमएल को फ्लास्क में स्थानांतरित करके एक टी 75 फ्लास्क को पूर्व-शर्त दें और इसे 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 85% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें (यह सेल रिकवरी चरणों को करते समय किया जा सकता है)।
      नोट: उपयोग करने से पहले पूर्ण माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और इसे 1 सप्ताह की अधिकतम अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 2 डी सेल वसूली
    1. तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से एक क्रायोवियल निकालें और तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में शीशी को डीफ्रॉस्ट करें, जब तक कि यह पूरी तरह से डीफ़्रॉस्ट न हो जाए।
    2. 5 मिनट (20 डिग्री सेल्सियस) के लिए 1006 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र का उपयोग करके क्रायोवियल को स्पिन करें और उसके बाद सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    3. पूर्व गर्म सेल वसूली माध्यम के 1 एमएल का उपयोग कर गोली कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें.
    4. समान रूप से पूर्व वातानुकूलित फ्लास्क (7 एमएल की अंतिम मात्रा) में निलंबित कोशिकाओं को वितरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 85% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
    5. 24 घंटे के बाद सेल रिकवरी माध्यम को त्यागें और बदलें।
    6. संस्कृति माध्यम को हर 2-3 दिनों में बदलें जब तक कि फ्लास्क कोशिकाओं के साथ संगम न हो जाए।
  3. एकल सेल निलंबन और सेल गिनती में 2 डी संस्कृति फ्लास्क की फसल
    1. इनक्यूबेटर से 2 डी संस्कृति फ्लास्क निकालें और एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में संस्कृति मीडिया त्यागें।
    2. कोशिकाओं को कुल्ला और अपशिष्ट और प्रोटीन बिल्ड-अप को हटाने के लिए फ्लास्क में कुल्ला समाधान के 10 एमएल स्थानांतरण। उसके बाद, कुल्ला समाधान त्यागें।
    3. कोशिकाओं को अलग करने के लिए संस्कृति फ्लास्क के लिए टुकड़ी समाधान के 6 एमएल जोड़ें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 2 मिनट के लिए 85% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह पुष्टि करने के लिए कि सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया गया है, एक माइक्रोस्कोप के नीचे फ्लास्क का निरीक्षण करें। यदि नहीं, तो धीरे से फ्लास्क पर टैप करें और एक और मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. एक बार सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया गया है, सेल निलंबन को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब में सेल रिकवरी मीडिया (20% एफबीएस युक्त) के 1 एमएल जोड़ें। यह टुकड़ी समाधान के प्रभाव को बेअसर कर देगा।
    5. 1711 x ग्राम (20 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिन के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और पूर्ण मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    7. सेल निलंबन के 10 माइक्रोन निकालें, इसे 500 माइक्रोन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें और इसे 1: 1 अनुपात में ट्रिपैन ब्लू के 10 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
    8. ट्राइपैन ब्लू सेल समाधान मिश्रण के 10 माइक्रोन को डुप्लिकेट में सेल गिनती कक्ष में रखें।
    9. सेल गिनती कक्ष को स्वचालित सेल काउंटर में रखें। सेल काउंटर प्रति एमएल कोशिकाओं की कुल संख्या के साथ-साथ व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं की संख्या का संकेत देगा। औसत व्यवहार्य सेल गिनती और व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या 3 डी हाइड्रोजेल (चरण 2.2.6) में एम्बेडेड होने की आवश्यकता की गणना करें।

2. 3D सेल कल्चर

  1. 3 डी पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करना
    1. बेसल माध्यम के 44 एमएल को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 10% एफबीएस (5 एमएल) और एंटीबायोटिक्स (1 एमएल) (0.5 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.5 एमएल एम्फोटेरिसिन बी) के साथ मीडिया को समृद्ध करें।
      नोट: उपयोग करने से पहले पूरा मीडिया 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और इसे अधिकतम एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. हाइड्रोजेल तैयार करना
    1. सामग्री को केंद्रित करने के लिए फास्ट-डेक्सट्रान शीशी (20 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 1000 x ग्राम ) अपकेंद्रित्र द्वारा तेजी से डेक्सट्रान तैयार करें। 30 मिमीलो / एल प्रतिक्रियाशील समूहों की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए फास्ट-डेक्सट्रान शीशी में 175 माइक्रोन पानी जोड़ें।
    2. भंवर ट्यूब (30 एस के लिए मध्यम गति) जिसमें फास्ट-डेक्सट्रान समाधान होता है जब तक कि सामग्री पूरी तरह से भंग नहीं हो जाती। 5 मिनट के लिए बर्फ पर भंग सामग्री सेते हैं. ट्यूब अपकेंद्रित्र, संक्षेप में यह भंवर, और आगे उपयोग के दौरान बर्फ पर यह रखने.
    3. सामग्री को केंद्रित करने के लिए क्रॉसलिंकर (20 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 1000 x ग्राम ) अपकेंद्रित्र। थियोल समूहों के 20 मिमीलो / एल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए क्रॉसलिंकर शीशी में 188 माइक्रोन पानी जोड़ें।
    4. भंवर ट्यूब (30 एस के लिए मध्यम गति) जिसमें क्रॉसलिंकर समाधान होता है जब तक कि सभी सामग्री भंग नहीं हो जाती। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर भंग क्रॉसलिंकर को इनक्यूबेट करें। ट्यूब अपकेंद्रित्र, संक्षेप भंवर, और आगे उपयोग के दौरान आरटी पर यह रखना.
    5. लागत में कमी के लिए हाइड्रोजेल प्रोटोकॉल को 30 माइक्रोन से 10 माइक्रोन तक अनुकूलित करें (विशिष्ट विवरण के लिए तालिका 1 देखें)।
    6. 10 माइक्रोन हाइड्रोजेल प्रति 2.5 x 103 कोशिकाओं के बीजारोपण घनत्व को प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन तैयार करें।
    7. एक मास्टर मिश्रण बनाने के लिए तालिका 1 के अनुसार घटकों को मिलाएं। मास्टर मिश्रण के 9 माइक्रोन को 96-अच्छी पट्टी प्लेट में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
    8. मास्टर मिश्रण स्थानांतरित होने के बाद 3 मिनट में डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर के 1 माइक्रोन जोड़कर जेल को ठोस बनाएं।
    9. हाइड्रोगेल को 170 माइक्रोन पूर्व-गर्म पूर्ण संस्कृति मीडिया के साथ कवर करें। 1 घंटे के लिए सेते हैं. 1 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम की जगह.
      नोट: हाइड्रोजेल-एम्बेडेड कोशिकाएं 3 डी संस्कृति प्रणाली के भीतर आगे प्रयोग या विश्लेषण के लिए तैयार हैं। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आवश्यकतानुसार अतिरिक्त प्रोटोकॉल का पालन करें।

3. फोटोबायोमॉड्यूलेशन एक्सपोजर

  1. लेजर की स्थापना
    1. हरे (525 एनएम) या निकट-अवरक्त (825 एनएम) तरंग दैर्ध्य के लिए डायोड लेजर सिस्टम सेट करें। लेज़रों पर स्विच करें और उन्हें अनुशंसित अवधि के लिए गर्म करने की अनुमति दें।
    2. उन्हें एक स्थिर स्थिति तक पहुँचने की अनुमति देकर लेज़रों के बिजली उत्पादन को स्थिर करें। यह लगातार और सटीक विकिरण सुनिश्चित करता है।
    3. लेजर पावर मीटर का उपयोग करके लेजर के बिजली उत्पादन को मापें। प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए शक्ति मूल्यों को रिकॉर्ड करें।
    4. लेजर विकिरण समय की गणना करने के लिए समीकरण 1 (लेजर विकिरण समय) का उपयोग करें। प्रत्येक प्रवाह के लिए उपयुक्त विकिरण समय निर्धारित करने के लिए तालिका 2 से समीकरण 1 में मूल्यों को प्रतिस्थापित करें। समीकरण 1 में, "आर" लेजर के विकिरण क्षेत्र की त्रिज्या का प्रतिनिधित्व करता है।
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      समीकरण 1
    5. गणना के लिए आवश्यक विशिष्ट मापदंडों के लिए तालिका 2 देखें, जिसमें प्रवाह (5 J/cm² या 10 J/cm²) और लेजर पावर आउटपुट शामिल हैं।
  2. 3 डी सेल संस्कृतियों को विकिरणित करना
    1. पूरा मीडिया (चरण 2.2.9) को बदलने के बाद, डायोड लेजर सिस्टम के तहत हाइड्रोजेल-एम्बेडेड कोशिकाओं युक्त 96-अच्छी प्लेट रखें। चुने हुए तरंग दैर्ध्य (हरे या निकट-अवरक्त) पर चयनित प्रवाह (5 J/cm² या 10 J/cm²) के लिए गणना किए गए लेजर विकिरण समय के साथ हाइड्रोजेल को विकिरणित करें। इसलिए, संस्कृतियों को केवल एक खुराक मिलेगी।
    2. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह एक नियंत्रण (एन = 4) के साथ है, जिसमें पीबीएम एक्सपोजर के बिना हाइड्रोजेल में एम्बेडेड एडीएससी शामिल हैं।
      नोट: आप जिस प्रकाश के साथ काम कर रहे हैं, उसके तरंग दैर्ध्य के लिए हमेशा उपयुक्त सुरक्षा चश्मा पहनें। लेज़रों का उपयोग सुरक्षा कैबिनेट के बाहर किया जाता है; इस प्रकार, उपयोग करने से पहले क्षेत्र कीटाणुरहित करना महत्वपूर्ण है।
    3. प्रयोगों की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 85% आर्द्रता पर संस्कृति प्लेटों को इनक्यूबेट करें। पहले विश्लेषण के लिए 24 घंटे के लिए प्लेटें या दूसरे विश्लेषण अवधि के लिए 10 दिन, विकिरण के बाद सेते हैं।

4. आकृति विज्ञान

  1. उलटा प्रकाश माइक्रोस्कोपी
    1. उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप पर मुड़ें और यह कुछ मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप ठीक से गठबंधन और अंशांकित है।
    2. प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड या एक विशेष सेल संस्कृति डिश पर अवलोकन के लिए नमूना तैयार करें। इष्टतम इमेजिंग स्थितियों के लिए माइक्रोस्कोप को कैलिब्रेट करें।
    3. आवश्यकतानुसार फ़ोकस, चमक और कंट्रास्ट सेटिंग्स समायोजित करें। सेल आकृति विज्ञान को देखने और रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप पर 20x उद्देश्य लेंस का चयन करें।
    4. माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना रखें और ऐपिस का उपयोग करके ब्याज की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें। ऐपिस या कैमरा दृश्य का उपयोग करके, सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें। सेल आकार, आकार और किसी भी विशिष्ट विशेषताओं पर ध्यान दें।
    5. कैमरा मॉड्यूल को माइक्रोस्कोप से संलग्न करें। डिजिटल इमेजिंग के लिए कैमरा सेट करें। कैमरे और माइक्रोस्कोप के बीच उचित कनेक्शन और संचार सुनिश्चित करें।
    6. 20x ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके, देखी गई कोशिकाओं की डिजिटल तस्वीरें कैप्चर करें। एक्सपोज़र, फ़ोकस और अन्य प्रासंगिक सेटिंग्स समायोजित करने के लिए कैमरा नियंत्रणों का उपयोग करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कैप्चर की गई छवियां उच्च गुणवत्ता की हैं और सेल आकृति विज्ञान का एक प्रतिनिधि दृश्य प्रदान करती हैं।
    7. कंप्यूटर पर इमेजिंग सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें। छवि पर कब्जा है और सेल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर के भीतर विश्लेषण उपकरण का उपयोग करें.
    8. सेल आयामों को मापें, कोशिकाओं की गिनती, या प्रयोगात्मक उद्देश्यों के आधार पर कोई प्रासंगिक विश्लेषण करें।
    9. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों के लिए एक उपयुक्त पैमाने पट्टी जोड़ें. छवियों के पैमाने का सही प्रतिनिधित्व करने के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य के ज्ञात आवर्धन का उपयोग करें।

5. जैव रासायनिक परख

  1. सेल वसूली
    नोट: कोशिकाओं को आगे डाउनस्ट्रीम जैव रासायनिक परख के लिए एकल-सेल निलंबन में हाइड्रोजेल से पुनर्प्राप्त करने की आवश्यकता है।
    1. एंजाइमी सेल रिकवरी समाधान तैयार करें। एक बाँझ वातावरण में, 1:20 (समाधान: पीबीएस) के अनुपात में फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ एंजाइमेटिक सेल रिकवरी समाधान को पतला करके एक कार्यशील समाधान तैयार करें। यदि जैल या कुओं की एक विशिष्ट संख्या से कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने की आवश्यकता होती है, तो प्रति जेल वसूली समाधान के 30 माइक्रोन के आधार पर आवश्यक कुल मात्रा की गणना करें।
    2. प्रत्येक जेल या अच्छी तरह से वसूली की जरूरत कोशिकाओं युक्त करने के लिए काम कर समाधान के 30 माइक्रोन जोड़ें. धीरे कमाल या थाली घूमता द्वारा वसूली समाधान की पूरी तरह से और भी वितरण सुनिश्चित करें. सिफारिश की इनक्यूबेशन समय के अनुसार वसूली समाधान के साथ थाली सेते हैं. यह जानकारी आमतौर पर आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान किए गए उत्पाद डेटाशीट या प्रोटोकॉल में पाई जा सकती है।
    3. इनक्यूबेशन अवधि के बाद, ध्यान से इनक्यूबेटर से थाली को हटा दें. कोशिकाओं को गोली देने के लिए 5 मिन (20 डिग्री सेल्सियस) के लिए 1409 x ग्राम पर प्लेटों को अपकेंद्रित्र करें। अनुशंसित सेंट्रीफ्यूजेशन स्थितियों के लिए उत्पाद डेटाशीट या प्रोटोकॉल देखें। एक बार centrifugation पूरा हो गया है, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्याग, सेल गोली परेशान नहीं करने के लिए सतर्क किया जा रहा है.
    4. बाँझ पीबीएस के 220 माइक्रोन में गोली कोशिकाओं को धीरे से निलंबित करें। एक सजातीय एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करें। कोशिकाएं अब बहाव जैव रासायनिक परख के लिए तैयार हैं। इच्छित परख के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल का पालन करें, बरामद कोशिकाओं की प्रकृति और प्रयोगात्मक सेटअप की आवश्यकताओं पर विचार करें।
  2. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) साइटोटॉक्सिसिटी परख
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए, ध्यान से पूरा संस्कृति मीडिया के 50 माइक्रोन हटा दें, सेल परत के लिए कम से कम गड़बड़ी सुनिश्चित करने.
    2. संस्कृति मीडिया के शेष 50 माइक्रोन युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से साइटोटॉक्सिसिटी अभिकर्मक के 50 माइक्रोन जोड़ें। अभिकर्मक के साथ नमूना के पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
    3. एक सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें। किट में शामिल सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं के 50 माइक्रोन प्रति 10x lysis समाधान के 5 माइक्रोन के साथ तीन प्रतियों की स्थापना करें।
    4. अनुशंसित तापमान और अवधि पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। यह कदम साइटोटॉक्सिसिटी अभिकर्मक को कोशिकाओं को लाइज़ करने और संस्कृति मीडिया में एलडीएच जारी करने की अनुमति देता है।
    5. इनक्यूबेशन अवधि के बाद, साइटोटॉक्सिसिटी अभिकर्मक और सेल लाइसेट युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से सीधे स्टॉप समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें। प्रतिक्रिया के उचित रोक सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
      नोट: स्टॉप सॉल्यूशन आगे एलडीएच रिलीज को रोकता है और रंग विकास की स्थिरता सुनिश्चित करता है।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक प्लेट रीडर सेट करें। 490 एनएम पर प्रत्येक अच्छी तरह से अवशोषण रिकॉर्ड. यह तरंग दैर्ध्य एलडीएच प्रतिक्रिया द्वारा उत्पन्न फॉर्मेज़ान उत्पाद के वर्णमिति का पता लगाने के लिए विशिष्ट है।
    7. दोनों उपचार समूहों और नियंत्रण कुओं से पृष्ठभूमि अवशोषण रीडिंग घटाना. कोशिकाओं के बिना मीडिया और साइटोटॉक्सिसिटी अभिकर्मकों वाले कुओं से पृष्ठभूमि रीडिंग प्राप्त करें।
    8. साइटोटॉक्सिसिटी स्तर निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सही अवशोषण मूल्यों का विश्लेषण करें। उच्च अवशोषण मान एलडीएच रिलीज में वृद्धि का संकेत देते हैं और, परिणामस्वरूप, उच्च साइटोटॉक्सिसिटी।
    9. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह और नियंत्रण सांख्यिकीय सटीकता के लिए चार दोहराता (3.2.2 कदम) के शामिल हैं. प्रत्येक समूह के औसत अवशोषण की गणना और आयात करें और एक उपयुक्त सांख्यिकीय कार्यक्रम में नियंत्रण करें।
    10. साइटोटोक्सिक प्रभावों का सही आकलन करने और भविष्य के संदर्भ के लिए सभी अवशोषण रीडिंग, गणना और प्रयोगात्मक स्थितियों को रिकॉर्ड करने के लिए उपचार समूहों और उचित नियंत्रणों के बीच परिणामों की तुलना करें।
  3. एटीपी प्रसार परख
    1. एक बाँझ वातावरण में, प्रत्येक अच्छी तरह से एटीपी अभिकर्मक के 50 माइक्रोन के साथ बरामद कोशिकाओं के 50 माइक्रोन मिलाएं।
      नोट: कुओं और प्रयोगात्मक डिजाइन की संख्या के आधार पर कोशिकाओं और अभिकर्मकों की मात्रा को समायोजित करें। सटीक परिणामों के लिए लगातार अनुपात बनाए रखें।
    2. एक प्रकार के बरतन पर थाली प्लेस और 5 मिनट के लिए अंधेरे में जोर से हिला. यह कदम अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं के पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करता है। मिलाते हुए के बाद, आरटी पर एक अतिरिक्त 25 मिनट के लिए थाली सेते हैं. यह इनक्यूबेशन अवधि अभिकर्मक को कोशिकाओं को लाइज़ करने और एटीपी की मात्रा के अनुपात में एक ल्यूमिनसेंट सिग्नल उत्पन्न करने की अनुमति देती है।
    3. ल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लेट रीडर सेट करें। सेल लाइसेट और एटीपी अभिकर्मक युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से ल्यूमिनेसेंस को मापें। सुनिश्चित करें कि प्लेट रीडर उचित सेटिंग्स के साथ ल्यूमिनेसेंस को मापने के लिए सेट है।
    4. दोनों उपचार समूहों और नियंत्रण कुओं से पृष्ठभूमि luminescence रीडिंग घटाना. कोशिकाओं के बिना केवल एटीपी अभिकर्मक और पीबीएस युक्त कुओं से पृष्ठभूमि रीडिंग प्राप्त करें।
    5. एटीपी स्तर निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सही ल्यूमिनेसेंस मूल्यों का विश्लेषण करें, सेल प्रसार या व्यवहार्यता को दर्शाता है।
    6. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह और नियंत्रण सांख्यिकीय सटीकता के लिए चार दोहराता (3.2.2 कदम) के शामिल हैं. गणना और प्रत्येक समूह के औसत luminescence आयात और एक उपयुक्त सांख्यिकीय कार्यक्रम में नियंत्रण.
    7. एटीपी प्रसार का सही आकलन करने के लिए उपचार समूहों और प्रासंगिक नियंत्रणों के बीच परिणामों की तुलना करें। भविष्य के संदर्भ के लिए सभी ल्यूमिनेसेंस रीडिंग, गणना और प्रयोगात्मक स्थितियों को रिकॉर्ड करें।
      नोट: किट के रूप में सभी जैव रासायनिक विश्लेषणों के लिए, विशिष्ट विवरणों के लिए निर्माता द्वारा प्रदान किए गए किट के मैनुअल या प्रोटोकॉल का पालन करें, जैसे कि अनुशंसित इनक्यूबेशन समय, सांद्रता, और कोई अतिरिक्त कदम या विचार। रसायनों और जैविक सामग्रियों को संभालते समय हमेशा प्रयोगशाला सुरक्षा दिशानिर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

आकृति विज्ञान का आकलन करने और हाइड्रोगेल के सेल घनत्व का नेत्रहीन निरीक्षण करने के लिए, उलटा माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2)का उपयोग किया गया था। ADSC ने सीडिंग और PBM एक्सपोजर के बाद 24 घंटे में एक गोल आकृति विज्ञान को बनाए रखा। कोशिकाएं पूरे जेल में एकल कोशिकाओं के रूप में या अंगूर जैसे समूहों में बिखरी हुई थीं। 3 डी संस्कृति में 10 दिनों के बाद आकृति विज्ञान अपरिवर्तित था। प्रयोगात्मक समूहों और नियंत्रणों के बीच या विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच आकृति विज्ञान में कोई निश्चित अंतर नहीं देखा गया था।

हाइड्रोजेल का उपयोग करके पीबीएम एक्सपोजर और 3 डी संस्कृति के साइटोटोक्सिक प्रभावों का आकलन करने के लिए, एलडीएच रिसाव को मापा गया था(चित्रा 3)। 24 घंटे या 10 दिनों में प्रयोगात्मक समूहों और नियंत्रणों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, यह दर्शाता है कि पीबीएम एक्सपोजर और हाइड्रोजेल संस्कृति का कोशिकाओं पर कोई हानिकारक प्रभाव नहीं था।

सेलुलर प्रसार दर एडीएससी (चित्रा 4) की एटीपी सामग्री को मापने के द्वारा मापा गया। पीबीएम एक्सपोजर के परिणामस्वरूप नियंत्रणों की तुलना में सभी प्रयोगात्मक समूहों में प्रसार दर में वृद्धि हुई। पीबीएम एक्सपोजर के बाद 24 घंटे में, 525 एनएम तरंग दैर्ध्य ने उच्चतम प्रसार दर को प्रेरित किया। हालांकि, 10 दिन के निशान पर, 825 एनएम तरंग दैर्ध्य ने 525 एनएम तरंग दैर्ध्य की तुलना में बेहतर प्रसार दर का प्रदर्शन किया। 10-दिवसीय संस्कृति अवधि के अंत में, 825 एनएम, 10 जे/सेमी2 समूह ने उच्चतम प्रसार दर दिखाई।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का अवलोकन। संक्षेप प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह से प्लेटों, पीबीएम जोखिम, और 24 घंटे और 10 दिनों के बाद पीबीएम जोखिम में आकृति विज्ञान और जैव रासायनिक assays की माप में हाइड्रोजेल की तैयारी पर प्रकाश डाला. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सीडिंग के बाद ADSC स्व-एकत्रित। कोशिकाओं ने एक गोल-से-अंडाकार आकृति विज्ञान को बनाए रखा और हाइड्रोजेल में या तो एकल कोशिकाओं या समुच्चय के रूप में वितरित किया गया, जिसमें (ए) 24 घंटे और (बी) बीजारोपण और पीबीएम एक्सपोजर के 10 दिन बाद अंगूर जैसी क्लस्टर उपस्थिति थी। इनक्यूबेशन के 10 दिनों के बाद कोई निश्चित परिवर्तन नहीं देखा गया। नियंत्रण (1 और 4) का उपयोग करना, 5 जे/सेमी2 (2) और 10 जे/सेमी2 (5) या 825 एनएम पर 5 एनएम क्रमशः 5 जे/सेमी2 (3) और 10 जे/सेमी2 (6) पर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: हाइड्रोजेल में 525 एनएम और 825 एनएम डायोड (5 जे / सेमी2 और 10 जे / सेमी2) का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी 24 घंटे और 10 दिनों के बाद पीबीएम एक्सपोजर के माप के रूप में सेलुलर एलडीएच रिसाव। प्रयोगात्मक नियंत्रण की तुलना में साइटोटॉक्सिसिटी में कोई उल्लेखनीय वृद्धि नहीं देखी गई। सकारात्मक नियंत्रण पूर्ण कोशिका मृत्यु का प्रतिनिधि था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हाइड्रोजेल में 525 एनएम और 825 एनएम डायोड (5 जे / सेमी2 और 10 जे / सेमी2) का उपयोग करके प्रसार 24 घंटे और 10 दिनों के बाद पीबीएम एक्सपोजर के माप के रूप में सेलुलर एटीपी। पीबीएम एक्सपोजर ने सभी प्रयोगात्मक समूहों में दोनों समय बिंदुओं और दोनों प्रवाह पर प्रसार दर में वृद्धि को प्रेरित किया। महत्वपूर्ण अंतर (पी < 0.001) *** द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक मात्रा (μL) प्रति अच्छी तरह से
एसएलओ-डेक्सट्रान बहुलक (30 मिमीलो / 0.7
सेल निलंबन 2
बफ़र 0.8
पानी 5.5
क्रॉसलिंकर 1
कुल मात्रा 10

तालिका 1: हाइड्रोजेल (10 माइक्रोन) अभिकर्मक मात्रा।

लेजर पैरामीटर्स हरा (जी) इन्फ्रा-रेड के पास (NIR)
प्रकाश स्रोत डायोड लेजर डायोड लेजर
तरंग दैर्ध्य (एनएम) 525 825
पावर आउटपुट (मेगावाट) 553 515
पावर घनत्व (mW/cm2) 57.48 53.53

तालिका 2: लेजर पैरामीटर।

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Discussion

ADSC पुनर्योजी चिकित्सा के लिए उपयोग करने के लिए एक आदर्श सेल प्रकार के रूप में वे घाव भरने 3,4 में सहायता करने के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं को उत्तेजित कर रहे हैं. हालांकि, वहाँ कई चुनौतियों है कि दरकिनार किया जा करने की जरूरत है, जैसे, गरीब जीवित रहने की दर और एक चोट साइट9 में कोशिकाओं के अप्रभावी engraftment कर रहे हैं. अमर कोशिकाओं एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइन के रूप में इस्तेमाल किया गया, के रूप में वे प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में अधिक पीढ़ियों के लिए पारित किया जा सकता है, वे काटा जा करने की जरूरत नहीं है, अच्छी तरह से विशेषता है, और लगातार परिणाम31 सुनिश्चित करने समरूप आबादी कर रहे हैं. इस अध्ययन का उद्देश्य 3 डी सेल संस्कृति का उपयोग करके एडीएससी के प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी पर पीबीएम की संवर्धित क्षमता का निर्धारण करना था। 30 माइक्रोन हाइड्रोजेल के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल कोलागत 32 बचाने के लिए 10 माइक्रोन के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, इस कम मात्रा ने जेल की तैयारी और हैंडलिंग को और अधिक कठिन बना दिया।

ADSC को 3D वातावरण33 के भीतर स्व-योग करने के लिए दिखाया गया है। इसी तरह इस अध्ययन में, कोशिकाओं ने अंगूर जैसी उपस्थिति के साथ सेल समुच्चय का गठन किया। हालांकि, एकल-बिछाने वाली कोशिकाओं की भी पहचान की गई थी। सेल शेडिंग स्फेरॉइड की एक ज्ञात संपत्ति है जिसमें कोशिकाएं मुख्य गोलाकार या कुल शरीर से अलग हो जाती हैं और संस्कृति वातावरण में जारी की जाती हैं। सेल शेडिंग सेलुलर प्रसार से परिणाम हो सकता है, जिसमें व्यवहार्य कोशिकाओं माइटोसिस के दौरान बहाया जाता है और34प्रवास के लिए अनुमति देते हैं. वैकल्पिक रूप से, बहा कोशिका मृत्यु और अंडाकार आकृति या कुल आकार35 के नुकसान के कारण परिणाम कर सकते हैं, विशेष रूप से एक बढ़ती परिगलित कोर के कारण बहुत बड़े spheroids में. कोशिकाओं ने 2 डी संस्कृतियों में एक धुरी आकार की तुलना में 3 डी संस्कृति में एक गोल आकृति विज्ञान को अपनाया। इसी तरह के अध्ययनों के निष्कर्षों को ध्यान में रखते हुए, ये परिणाम कोशिकाओं के लिए 6,9 का पालन करने के लिए लगाव साइटों या बाह्य मैट्रिक्स की कमी के कारण हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं जेल में कोई महत्वपूर्ण प्रवास दिखाया, आगे लगाव साइटों36 के लिए की जरूरत का निहित. लगाव, आसंजन और प्रवास की सुविधा के लिए एक आसंजन पेप्टाइड या एक अन्य बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन जोड़ने की सिफारिश की जाती है। अध्ययन की एक सीमा जेड-स्टैकिंग के बजाय एडीएससी के 3 डी आकारिकी का निरीक्षण करने के लिए व्युत्क्रम प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग था। पीबीएम एक्सपोजर और 3 डी कल्चर का 24 घंटे और 10 दिनों के बाद एक्सपोजर दोनों में एडीएससी की साइटोटॉक्सिसिटी पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा, यह दर्शाता है कि हाइड्रोजेल संस्कृति और पीबीएम सुरक्षित हैं और कोशिकाओं 6,26पर कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं पड़ता है। 3 डी सेल संस्कृति में, एडीएससी 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में धीमी प्रसार दर से जुड़े हुए हैं। यह वर्तमान अध्ययन6 में सामान्य नियंत्रणों की कम प्रसार दर द्वारा समर्थित है। पीबीएम (525 एनएम और 825 एनएम) ने 3 डी संस्कृति में एडीएससी की प्रसार दर में काफी वृद्धि की। प्रारंभ में, 5 J/cm2 और 10 J/cm 2 प्रवाह दोनों पर हरी बत्ती (525 nm) ने निकट-अवरक्त प्रकाश (825 nm) की तुलना में उच्चतम प्रसार दर प्राप्त की। हालांकि, 10-दिन के निशान पर, निकट-अवरक्त प्रकाश (825 एनएम) में 5 J/cm2 और 10 J/cm 2 प्रवाह दोनों पर उच्चतम प्रसार दर है। इसी तरह, पीबीएम (525 एनएम और 825 एनएम) 2 डी संस्कृतियों37 में प्रसार दर बढ़ाने के लिए प्रदर्शन किया गया है। एक तरंग दैर्ध्य संयोजन समूह को भी शामिल करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि अन्य अध्ययनों ने हरे और निकट-अवरक्त प्रकाश के सहक्रियात्मक प्रभाव की सूचना दी है।

अंत में, उपयोग किया जाने वाला हाइड्रोजेल एक सिंथेटिक हाइड्रोजेल है जिसमें विभिन्न अनुप्रयोगों की आवश्यकताओं के अनुरूप जबरदस्त अनुकूलन क्षमता है। वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि जेल का 10 दिनों की अवधि में संस्कृति में कोशिकाओं पर कोई साइटोटोक्सिक प्रभाव नहीं है। इसके अलावा, पीबीएम ने 3 डी संस्कृति वातावरण में होने के बावजूद, एडीएससी की प्रसार दरों को काफी बढ़ा कर एक सकारात्मक संवर्धित क्षमता का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, यह हाइड्रोजेल घावों में प्रत्यारोपण के लिए एक संभावित बायोमटेरियल वाहक के रूप में काम कर सकता है। भविष्य की जांच का उद्देश्य जानवरों के अध्ययन का उपयोग करके घाव भरने में सहायता के लिए जेल की संभावित क्षमता का परीक्षण करना होना चाहिए। यदि पशु परीक्षण के परिणाम अनुकूल हैं, तो यह कल्पना की जाती है कि रोगी-व्युत्पन्न एडीएससी को नैदानिक अनुप्रयोगों में घाव भरने में सहायता के लिए घावों में प्रत्यारोपण से पहले पीबीएम के साथ काटा, समझाया और संवर्धित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस शोध दक्षिण अफ्रीका थुथुका इंस्ट्रूमेंट के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, अनुदान संख्या TTK2205035996; विज्ञान और नवाचार विभाग (डीएसआई) ने अफ्रीकी लेजर सेंटर (एएलसी), कार्य ALC-R007 HLHA23X अनुदान संख्या; विश्वविद्यालय अनुसंधान परिषद, अनुदान संख्या 2022URC00513; विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग के दक्षिण अफ्रीकी अनुसंधान अध्यक्षों की पहल (DST-NRF/SARChI), अनुदान संख्या 98337। फंडिंग निकायों ने अध्ययन, संग्रह, विश्लेषण, डेटा की व्याख्या या पांडुलिपि लिखने के डिजाइन में कोई भूमिका नहीं निभाई। लेखक सुविधाओं और संसाधनों के उपयोग के लिए जोहान्सबर्ग विश्वविद्यालय (यूजे) और लेजर रिसर्च सेंटर (एलआरसी) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
525 nm diode laser National Laser Centre of South Africa EN 60825-1:2007
825 nm diode laser National Laser Centre of South Africa SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates Sigma-Aldrich BR782301
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2942 Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430659 cryovial
CryoSOfree Sigma-Aldrich C9249 Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780 Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media Sigma-Aldrich D5796 Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter Coherent 1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate Sigma-Aldrich CLS3370
Foetal bovine serum Biochrom S0615 Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394 Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator Thermo Scientific 51026280
Heraeus Labofuge 400 Thermo Scientific 75008371 Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge ThermoFisher 75004270
Immortalized ADSCs ATCC ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 Passage 37
Invitrogen Countess 3 Invitrogen AMQAX2000 Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath Sigma-Aldrich Z615501 Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry Olympus Version 3.2 (23706)  Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41 Olympus SN9B02019 Inverted light microscope
Olympus SC30 camera Olympus SN57000530 Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates Sigma-Aldrich CLS3912 Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0 Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3 Sigma-Aldrich TRUE3-1KT 10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution Sigma-Aldrich TRUEENZ 01:20
Trypan Blue Stain Thermo Fisher - Invitrogen T10282 0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x) Gibco 12563029 Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader Perkin Elmer HH3522019094 Spectrophotometric plate reader

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References

  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  2. Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
  3. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
  4. Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
  5. Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
  6. Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
  7. Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
  8. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  9. Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
  10. Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
  11. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  12. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
  13. Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
  14. Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
  15. Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
  16. Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
  17. Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
  18. Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
  19. Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
  20. Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
  21. Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
  22. Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
  23. Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
  24. Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
  25. Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
  26. Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
  27. Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
  28. Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
  29. De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
  30. Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
  31. Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
  32. Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
  33. Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
  34. Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
  35. Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
  36. Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
  37. Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).

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जीवविज्ञान अंक 206
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Roets, B., Abrahamse, H., Crous, A. Three-Dimensional Cell Culture of Adipose-Derived Stem Cells in a Hydrogel with Photobiomodulation Augmentation. J. Vis. Exp. (206), e66616, doi:10.3791/66616 (2024).

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