Summary
Her presenterer vi en protokoll som demonstrerer bruken av hydrogel som et tredimensjonalt (3D) cellekulturrammeverk for adipose-avledet stamcellekultur (ADSC) og introduserer fotobiomodulering (PBM) for å forbedre spredning av ADSC innenfor 3D-kulturinnstillingen.
Abstract
Adipose-avledede stamceller (ADSC), som har multipotente mesenkymale egenskaper som ligner på stamceller, brukes ofte i regenerativ medisin på grunn av deres evne til et mangfoldig utvalg av celledifferensiering og deres evne til å forbedre migrasjon, spredning og redusere betennelse. Imidlertid står ADSC ofte overfor utfordringer i overlevelse og transplantasjon i sår, hovedsakelig på grunn av ugunstige inflammatoriske tilstander. For å løse dette problemet har hydrogeler blitt utviklet for å opprettholde ADSC-levedyktighet i sår og fremskynde sårhelingsprosessen. Her hadde vi som mål å vurdere den synergistiske effekten av fotobiomodulering (PBM) på ADSC-proliferasjon og cytotoksisitet innenfor et 3D-cellekulturrammeverk. Immortaliserte ADSCer ble sådd i 10 μL hydrogeler med en tetthet på 2,5 x 103 celler og utsatt for bestråling ved bruk av 525 nm og 825 nm dioder ved fluenser på 5 J / cm2 og 10 J / cm2. Morfologiske endringer, cytotoksisitet og proliferasjon ble evaluert 24 timer og 10 dager etter PBM-eksponering. ADSC-ene viste en avrundet morfologi og ble dispergert gjennom gelen som individuelle celler eller sfæroidaggregater. Det er viktig at både PBM og 3D-kulturrammeverket ikke viste noen cytotoksiske effekter på cellene, mens PBM signifikant forbedret proliferasjonshastighetene til ADSCs. Avslutningsvis demonstrerer denne studien bruken av hydrogel som et egnet 3D-miljø for ADSC-kultur og introduserer PBM som en betydelig forsterkningsstrategi, spesielt med tanke på de langsomme proliferasjonshastighetene forbundet med 3D-cellekultur.
Introduction
ADSC er mesenkymale multipotente stamceller med kapasitet til selvfornyelse og differensiering i flere cellelinjer. Disse cellene kan høstes fra den stromale vaskulære fraksjonen (SVF) av fettvev under en lipoaspirasjonsprosedyre1. ADSC har dukket opp som en ideell stamcelletype til bruk i regenerativ medisin fordi disse cellene er rikelig, minimalt invasive for høsting, lett tilgjengelige og godt karakteriserte2. Stamcelleterapi tilbyr en mulig vei for sårheling ved å stimulere cellemigrasjon, spredning, neovaskularisering og redusere betennelse i sår 3,4. Omtrent 80% av den regenerative kapasiteten til ADSC kan tilskrives parakrin signalering via deres sekrin5. Tidligere ble det foreslått at en direkte lokal injeksjon av stamceller eller vekstfaktorer i skadet vev kunne ulovlig tilstrekkelig in vivo reparasjonsmekanismer 6,7,8. Imidlertid møtte denne tilnærmingen flere utfordringer, for eksempel dårlig overlevelse og redusert stamcelletransplantasjon i skadet vev som følge av det inflammatoriske miljøet 9. Videre var en av grunnene som ble nevnt mangel på en ekstracellulær matrise for å støtte overlevelsen og funksjonaliteten til de transplanterte cellene10. For å overvinne disse utfordringene legges det nå vekt på utvikling av biomaterialbærere for å støtte stamcellenes levedyktighet og funksjon.
Tredimensjonal (3D) cellekultur forbedrer celle-til-celle- og celle-til-matrise-interaksjon in vitro for å gi et miljø som bedre ligner in vivo-miljøet 11. Hydrogeler har blitt grundig studert som en klasse av biomaterialbærere som gir et 3D-miljø for stamcellekultur. Disse strukturene er laget av vann og tverrbundne polymerer12. Innkapsling av ADSC i hydrogel har praktisk talt ingen cytotoksisk effekt på cellene under kultur, samtidig som cellens levedyktighetopprettholdes 6. Stamceller dyrket i 3D demonstrerer forbedret oppbevaring av stammen og forbedret differensieringskapasitet13. På samme måte viste hydrogelfrøede ADSC-er økt levedyktighet og akselerert sårlukking i dyremodeller14. Videre øker hydrogelinnkapsling signifikant engraftment og oppbevaring av ADSC i sår15,16. TrueGel3D er laget av en polymer, enten polyvinylalkohol eller dextran, størknet av en tverrbinder, enten cyklodekstrin eller polyetylenglykol17. Gelen er en syntetisk hydrogel som ikke inneholder noen animalske produkter som kan forstyrre forsøkene eller utløse en immunreaksjon under transplantasjonen av gelen til en pasient mens den effektivt etterligner en ekstracellulær matrise18. Gelen er fullt tilpassbar ved å endre sammensetningen og individuelle komponenter. Den kan huse forskjellige stamceller og støtte differensiering av flere celletyper ved å justere stivheten til gelen19. Festesteder kan opprettes ved tilsetning av peptider20. Gelen er nedbrytbar ved utskillelse av metalloproteases, noe som muliggjør cellemigrasjon21. Til slutt er det klart og gir mulighet for avbildningsteknikker.
PBM er en minimalt invasiv og lett utført form for lavnivå laserterapi som brukes til å stimulere intracellulære kromoforer. Ulike bølgelengder fremkaller forskjellige effekter på celler22. Lys i det røde til nær-infrarøde området stimulerer økt adenosintrifosfat (ATP) og reaktiv oksygenproduksjon (ROS) ved å øke fluksen gjennom elektrontransportkjeden23. Lys i de blå og grønne områdene stimulerer lysstyrte ionkanaler, noe som muliggjør den ikke-spesifikke tilstrømningen av kationer, som kalsium og magnesium, til celler, som er kjent for å forbedre differensiering24. Nettoeffekten er genereringen av sekundære budbringere som stimulerer transkripsjonen av faktorer som utløser nedstrøms cellulære prosesser som migrasjon, spredning og differensiering25. PBM kan brukes til å prekondisjonere celler til å proliferere eller differensiere før transplantasjon av cellene til et ugunstig miljø, for eksempel skadet vev26. PBM før og etter transplantasjon (630 nm og 810 nm) eksponering av ADSC forbedret levedyktigheten og funksjonen til disse cellene in vivo betydelig i en diabetisk rottemodell27. Regenerativ medisin krever et tilstrekkelig antall celler for effektiv reparasjon av vev28. I 3D-cellekultur har ADSC vært assosiert med langsommere proliferasjonshastigheter sammenlignet med todimensjonal cellekultur6. PBM kan imidlertid brukes til å øke 3D-cellekulturprosessen til ADSC ved å øke levedyktigheten, spredning, migrasjon og differensiering29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og programvare som brukes i denne protokollen. Protokollen er grafisk oppsummert i figur 1.
1. Todimensjonal (2D) cellekultur
MERK: Immortaliserte ADSC (1 x106 celler) lagres ved -195,8 °C i flytende nitrogen i et kryopreserveringshetteglass som inneholder 1 ml cellefrysemedier.
- Klargjøre 2D-cellegjenvinningsmediet og 2D-kulturkolben
- Overfør 39 ml av basalmediet til et 50 ml sentrifugerør
- Berik basalmediet med 20% føtal bovint serum (FBS; 10 ml) og antibiotika (1 ml) (0,5 ml penicillin-streptomycin og 0,5 ml amfotericin B).
- Forkondisjoner en T75-kolbe ved å overføre 6 ml av cellegjenvinningsmediet til kolben og inkubere den ved 37 °C, 5 % CO2 og 85 % fuktighet i 45 minutter (dette kan gjøres mens du utfører cellegjenopprettingstrinnene for å spare tid).
MERK: Varm hele mediet til 37 °C før bruk og oppbevar det ved 4 °C i maksimalt 1 uke.
- 2D-celle utvinning
- Fjern en cryovial fra oppbevaringstanken for flytende nitrogen og tin hetteglasset raskt i et vannbad ved 37 °C, til det er helt tint.
- Spinn ned kryovialet med en sentrifuge ved 1006 x g i 5 minutter (20 °C) og fjern deretter supernatanten.
- Resuspender de pelleterte cellene ved hjelp av 1 ml forvarmet cellegjenopprettingsmedium.
- Fordel de suspenderte cellene jevnt i den forkondisjonerte kolben (sluttvolum på 7 ml) og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 og 85 % fuktighet.
- Etter 24 timer kastes og erstattes cellegjenvinningsmediet.
- Bytt kulturmediet hver 2-3 dag til kolben blir sammenflytende med celler.
- Høsting av 2D-kulturkolbe i enkeltcellesuspensjon og celletall
- Fjern 2D-kulturkolben fra inkubatoren og kast kulturmediet i en passende avfallsbeholder.
- Overfør 10 ml skylleoppløsning til kolben for å skylle cellene og fjerne avfall og proteinoppbygging. Deretter kastes skylleoppløsningen.
- Tilsett 6 ml løsrivelsesløsning til kulturkolben for å løsne cellene. Inkuber kolben ved 37 °C, 5 % CO2 og 85 % fuktighet i 2 minutter.
MERK: Observer kolben under et mikroskop for å bekrefte at alle celler er løsrevet. Hvis ikke, trykk forsiktig på kolben og inkuber i et minutt til. - Når alle cellene er løsrevet, overfør cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugerør og tilsett 1 ml av cellegjenopprettingsmediet (inneholdende 20% FBS) til røret. Dette vil nøytralisere effekten av løsrivelsesløsningen.
- Sentrifuger røret i 5 minutter ved 1711 x g (20 °C).
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml av komplette medier.
- Fjern 10 μL av cellesuspensjonen, plasser den i et 500 μL mikrosentrifugerør og bland det med 10 μL trypanblå i forholdet 1: 1.
- Plasser 10 μL av trypan blue cell solution mix i et celletellekammer i duplikat.
- Plasser celletellekammeret i den automatiserte celletelleren. Celletelleren vil indikere totalt antall celler per ml, samt antall levedyktige og døde celler. Beregn gjennomsnittlig levedyktig celleantall og antall levedyktige celler som trengs for å bli innebygd i 3D-hydrogelen (trinn 2.2.6).
2. 3D cellekultur
- Klargjøring av 3D komplett kulturmedium
- Overfør 44 ml av basalmediet til et 50 ml sentrifugerør.
- Berik mediet med 10% FBS (5 ml) og antibiotika (1 ml) (0,5 ml penicillin-streptomycin og 0,5 ml amfotericin B).
MERK: Varm hele mediet til 37 °C før bruk, og oppbevar det ved 4 °C i maksimalt én uke.
- Klargjøre hydrogelen
- Forbered rask dextran ved å sentrifugere (1000 x g i 30 s ved 20 °C) hetteglasset med rask dextran for å konsentrere materialet. Tilsett 175 mikrol vann til det raske dekstranglasset for å oppnå en endelig konsentrasjon på 30 mmol/l reaktive grupper.
- Virvel røret (middels hastighet i 30 s) som inneholder den raske dextranoppløsningen til materialet er fullstendig oppløst. Inkuber det oppløste materialet på is i 5 minutter. Sentrifuger røret, virvle det kort og hold det på is under videre bruk.
- Sentrifuger tverrbinderen (1000 x g i 30 s ved 20 °C) for å konsentrere materialet. Tilsett 188 mikrol vann til hetteglasset med tverrbinder for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 mmol/l tiolgrupper.
- Virvel røret (middels hastighet i 30 s) som inneholder tverrbindingsløsningen til alt materialet er oppløst. Inkuber den oppløste tverrbinderen ved romtemperatur (RT) i 5 minutter. Sentrifuger røret, kort virvel, og hold det på RT under videre bruk.
- Tilpass hydrogelprotokollen fra 30 μL til 10 μL for kostnadsreduksjon (se tabell 1 for spesifikke detaljer).
- Forbered cellesuspensjonen for å oppnå en såtetthet på 2,5 x 103 celler per 10 μL hydrogel.
- Kombiner komponentene i henhold til tabell 1 for å lage en masterblanding. Overfør 9 μL av masterblandingen til en brønn i en 96-brønns stripeplate.
- Stivn gelen ved å tilsette 1 μL av den nedbrytbare tverrbinderen 3 minutter etter at masterblandingen er overført.
- Dekk hydrogelene med 170 μL forvarmede komplette kulturmedier. Inkubere i 1 time. Etter 1 time, bytt ut kulturmediet.
MERK: De hydrogel-innebygde cellene er klare for videre eksperimentering eller analyse i 3D-kultursystemet. Følg tilleggsprotokoller etter behov for nedstrømsprogrammer.
3. Eksponering for fotobiomodulering
- Sette opp laseren
- Sett opp diodelasersystemet for enten grønne (525 nm) eller nær-infrarøde (825 nm) bølgelengder. Slå på laserne og la dem varme opp i anbefalt varighet.
- Stabiliser laserens utgangseffekt ved å la dem nå en jevn tilstand. Dette sikrer konsekvent og nøyaktig bestråling.
- Mål utgangseffekten til laserne ved hjelp av en laserstrømmåler. Registrer effektverdiene for hver bølgelengde.
- Bruk ligning 1 (laserbestrålingstid) til å beregne laserbestrålingstiden. Erstatt verdiene fra tabell 2 til ligning 1 for å bestemme riktig bestrålingstid for hver fluens. I ligning 1 representerer "r" radiusen til bestrålingssonen til laseren.
Ligning 1 - Se tabell 2 for spesifikke parametere som trengs for beregningen, inkludert fluenser (5 J/cm² eller 10 J/cm²) og lasereffekt.
- Bestråling av 3D-cellekulturer
- Etter å ha byttet ut hele mediet (trinn 2.2.9), plasser 96-brønnsplaten som inneholder hydrogel-innebygde celler under diodelasersystemet. Bestråle hydrogelene med beregnet laserbestrålingstid for valgt fluens (5 J/cm² eller 10 J/cm²) ved valgt bølgelengde (grønn eller nær-infrarød). Derfor vil kulturene bare få en enkelt dose.
- Sørg for at hver eksperimentgruppe ledsages av en kontroll (n = 4), bestående av ADSC innebygd i hydrogel uten PBM-eksponering.
MERK: Bruk alltid vernebriller som passer til bølgelengden til lyset du jobber med. Laserne brukes utenfor et sikkerhetsskap; Derfor er det avgjørende viktig å desinfisere området før bruk. - Inkuber dyrkningsplatene ved 37 °C, 5 % CO2 og 85 % fuktighet i løpet av forsøkene. Inkuber platene i 24 timer for den første analysen eller 10 dager for den andre analyseperioden, etter bestråling.
4. Morfologi
- Invertert lysmikroskopi
- Slå på det omvendte lysmikroskopet og la det varme opp i noen minutter. Forsikre deg om at mikroskopet er riktig justert og kalibrert.
- Forbered prøven for observasjon på et mikroskopglass eller en spesialisert cellekulturfat, avhengig av eksperimentelt oppsett. Kalibrer mikroskopet for optimale bildeforhold.
- Juster innstillingene for fokus, lysstyrke og kontrast etter behov. Velg 20x objektivlinsen på mikroskopet for å observere og registrere cellemorfologi.
- Plasser prøven på mikroskopstadiet og fokuser på cellene av interesse ved hjelp av okularet. Bruk okularet eller kameravisningen, observer og registrer cellemorfologien. Vær oppmerksom på celleform, størrelse og eventuelle særegne egenskaper.
- Fest kameramodulen til mikroskopet. Sett opp kameraet for digital bildebehandling. Sørg for riktig tilkobling og kommunikasjon mellom kameraet og mikroskopet.
- Bruk 20x objektivlinsen til å ta digitale bilder av de observerte cellene. Bruk kamerakontrollene til å justere eksponering, fokus og andre relevante innstillinger.
MERK: Forsikre deg om at de fangede bildene er av høy kvalitet og gir en representativ visning av cellemorfologien. - Start bildebehandlingsprogramvaren på datamaskinen. Ta bildet og bruk analyseverktøyene i programvaren til å analysere cellemorfologi.
- Mål celledimensjoner, telle celler eller utfør relevant analyse basert på eksperimentelle mål.
- Legg til en passende skalalinje til bildene ved hjelp av programvaren. Bruk den kjente forstørrelsen av mikroskopmålet til å representere skalaen til bildene nøyaktig.
5. Biokjemiske analyser
- Cell utvinning
MERK: Cellene må gjenvinnes fra hydrogelen i en enkeltcellesuspensjon for videre nedstrøms biokjemiske analyser.- Forbered den enzymatiske cellegjenopprettingsløsningen. I et sterilt miljø fremstilles en arbeidsløsning ved å fortynne den enzymatiske cellegjenvinningsløsningen med fosfatbufret saltvann (PBS) i forholdet 1:20 (Løsning: PBS). Hvis det kreves gjenvinning av celler fra et bestemt antall geler eller brønner, beregner du det totale volumet som kreves basert på 30 μL gjenvinningsløsning per gel.
- Tilsett 30 μL av arbeidsløsningen til hver gel eller brønn som inneholder cellene som trenger utvinning. Sørg for grundig og jevn fordeling av gjenvinningsløsningen ved å gynge eller virvle platen forsiktig. Inkuber platen med gjenvinningsløsningen i henhold til anbefalt inkubasjonstid. Denne informasjonen kan vanligvis finnes i produktdatabladet eller protokollen levert av leverandøren.
- Etter inkubasjonsperioden, fjern forsiktig platen fra inkubatoren. Sentrifuger platene ved 1409 x g i 5 minutter (20 °C) for å pelletere cellene. Se produktdatabladet eller protokollen for anbefalte sentrifugeringsforhold. Når sentrifugeringen er fullført, kast forsiktig supernatanten, vær forsiktig så du ikke forstyrrer cellepelleten.
- Resuspender de pelleterte cellene forsiktig i 220 μL steril PBS. Sørg for grundig blanding for å oppnå en homogen encellesuspensjon. Cellene er nå klare for nedstrøms biokjemiske analyser. Følg de spesifikke protokollene for de tiltenkte analysene, med tanke på arten av de gjenopprettede cellene og kravene til eksperimentelt oppsett.
- Cytotoksisitetsanalyse av laktatdehydrogenase (LDH)
- For hver brønn, fjern forsiktig 50 μL komplett kulturmedium, og sørg for minimal forstyrrelse av cellelaget.
- Tilsett 50 μL av cytotoksisitetsreagenset direkte til hver brønn som inneholder de resterende 50 mikrol kulturmedier. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned for å sikre grundig blanding av prøven med reagenset.
- Forbered en positiv kontroll. Sett opp triplikate brønner med 5 μL 10x lyseløsning per 50 μL positive kontrollceller inkludert i settet.
- Inkuber platen ved anbefalt temperatur og varighet. Dette trinnet gjør det mulig for cytotoksisitetsreagenset å lyse cellene og frigjøre LDH i kulturmediet.
- Etter inkubasjonsperioden, tilsett 50 μL av stoppoppløsningen direkte til hver brønn som inneholder cytotoksisitetsreagenset og cellelysat. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned for å sikre riktig stopp av reaksjonen.
MERK: Stoppløsningen stopper ytterligere LDH-frigjøring og sikrer stabiliteten til fargeutviklingen. - Sett opp den spektrofotometriske plateleseren i henhold til produsentens instruksjoner. Registrer absorbansen til hver brønn ved 490 nm. Denne bølgelengden er spesifikk for den kolorimetriske deteksjonen av formazanproduktet generert av LDH-reaksjonen.
- Trekk bakgrunnsabsorbansavlesninger fra begge behandlingsgruppene og kontrollbrønnene. Få bakgrunnsavlesninger fra brønner som inneholder media og cytotoksisitetsreagenser uten celler.
- Analyser de korrigerte absorbansverdiene for hver prøve for å bestemme cytotoksisitetsnivået. Høyere absorbansverdier indikerer økt LDH-frigjøring og følgelig høyere cytotoksisitet.
- Sørg for at hver eksperimentell gruppe og kontroll besto av fire repetisjoner (trinn 3.2.2) for statistisk nøyaktighet. Beregne og importere gjennomsnittlig absorbans for hver gruppe og kontroll til et passende statistisk program.
- Sammenlign resultatene mellom behandlingsgrupper og egnede kontroller for å vurdere de cytotoksiske effektene nøyaktig og registrere alle absorbansavlesninger, beregninger og eksperimentelle forhold for fremtidig referanse.
- ATP-spredningsanalyse
- I et sterilt miljø blandes 50 μL av de gjenvunnede cellene med 50 μL av ATP-reagenset i hver brønn.
MERK: Juster volumet av celler og reagenser basert på antall brønner og eksperimentell design. Oppretthold konsistente forhold for nøyaktige resultater. - Legg tallerkenen på en shaker og rist kraftig i mørket i 5 min. Dette trinnet sikrer grundig blanding av cellene med reagenset. Etter risting, inkuber platen i ytterligere 25 min ved RT. Denne inkubasjonsperioden tillater reagenset å lyse cellene og generere et luminescerende signal proporsjonalt med mengden ATP tilstede.
- Sett opp plateleseren i henhold til produsentens instruksjoner for luminescensdeteksjon. Mål luminescens fra hver brønn som inneholder cellelysat og ATP-reagens. Forsikre deg om at plateleseren er satt til å måle luminescens med passende innstillinger.
- Trekk bakgrunnsluminescensavlesninger fra begge behandlingsgruppene og kontrollbrønnene. Få bakgrunnsavlesninger fra brønner som bare inneholder ATP-reagenset og PBS uten celler.
- Analyser de korrigerte luminescensverdiene for hver prøve for å bestemme ATP-nivåer, som reflekterer celleproliferasjon eller levedyktighet.
- Sørg for at hver eksperimentell gruppe og kontroll besto av fire repetisjoner (trinn 3.2.2) for statistisk nøyaktighet. Beregn og importer gjennomsnittlig luminescens for hver gruppe og kontroll til et passende statistisk program.
- Sammenlign resultatene mellom behandlingsgrupper og relevante kontroller for å vurdere ATP-spredning nøyaktig. Registrer alle luminescensavlesninger, beregninger og eksperimentelle forhold for fremtidig referanse.
MERK: For alle biokjemiske analyser i settform, følg settets håndbok eller protokoll levert av produsenten for spesifikke detaljer, for eksempel anbefalte inkubasjonstider, konsentrasjoner og eventuelle ytterligere trinn eller hensyn. Følg alltid laboratoriets sikkerhetsretningslinjer ved håndtering av kjemikalier og biologiske materialer.
- I et sterilt miljø blandes 50 μL av de gjenvunnede cellene med 50 μL av ATP-reagenset i hver brønn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vurdere morfologien og visuelt undersøke hydrogelenes celletetthet ble det brukt invers mikroskopi (figur 2). ADSC-ene beholdt en avrundet morfologi 24 timer etter såing og PBM-eksponering. Cellene ble spredt gjennom gelen som enkeltceller eller i druelignende klynger. Morfologien var uendret etter 10 dager i 3D-kultur. Ingen definitiv forskjell i morfologi ble notert mellom eksperimentgruppene og kontrollgruppene eller mellom de forskjellige eksperimentelle gruppene.
For å vurdere cytotoksiske effekter av PBM-eksponering og 3D-kultur med hydrogel ble LDH-lekkasje målt (figur 3). Det var ingen signifikante forskjeller mellom eksperimentgruppene og kontrollpersonene ved 24 timer eller 10 dager, noe som indikerer at PBM-eksponering og hydrogelkultur ikke hadde noen skadelig effekt på cellene.
Cellulære proliferasjonsrater ble målt ved å måle ATP-innholdet i ADSC (figur 4). PBM-eksponering resulterte i økt proliferasjonsrate i alle eksperimentelle grupper sammenlignet med kontrollgruppene. Ved 24 timer etter PBM-eksponering stimulerte bølgelengden på 525 nm de høyeste spredningshastighetene. Ved 10-dagersmerket viste imidlertid bølgelengden på 825 nm overlegne spredningshastigheter sammenlignet med bølgelengden på 525 nm. På slutten av 10-dagers kulturperioden viste gruppen 825 nm, 10 J/cm2 den høyeste spredningshastigheten.
Figur 1: Oversikt over protokollen. Oppsummert protokoll som fremhever fremstilling av hydrogelen i 96 brønnplater, PBM-eksponering og måling av morfologi og biokjemiske analyser ved 24 timer og 10 dager etter PBM-eksponering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: ADSC selvaggregert etter såing. Cellene beholdt en rund til oval morfologi og ble fordelt i hydrogelen som enten enkeltceller eller aggregater med et druelignende klaseutseende ved (A) 24 timer og (B) 10 dager etter såing og PBM-eksponering. Ingen definitiv endring ble observert etter 10 dagers inkubasjon. Ved bruk av kontroller (1 og 4), 525 nm ved 5 J / cm2 (2) og 10 J / cm2 (5) eller 825 nm ved henholdsvis 5 J / cm2 (3) og 10 J / cm2 (6). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cellulær LDH-lekkasje som måling av cytotoksisitet 24 timer og 10 dager etter PBM-eksponering, ved bruk av en 525 nm og 825 nm diode (5 J/cm2 og 10 J/cm2) i hydrogelen. Ingen signifikant økning i cytotoksisitet ble observert sammenlignet med eksperimentell kontroll. Den positive kontrollen var representativ for fullstendig celledød. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Cellulær ATP som måling av spredning 24 timer og 10 dager etter PBM-eksponering, ved bruk av en 525 nm og 825 nm diode (5 J / cm2 og 10 J / cm2) i hydrogelen. PBM-eksponering stimulerte økte proliferasjonsrater i alle eksperimentelle grupper på begge tidspunkter og begge fluenser. Signifikante forskjeller (P < 0,001) er angitt med ***. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Komponent | Volum (μL) per brønn |
| SLO-Dextran polymer (30 mmol/l) | 0.7 |
| Cell suspensjon | 2 |
| Buffer | 0.8 |
| Vann | 5.5 |
| Tverrbinder | 1 |
| Totalt volum | 10 |
Tabell 1: Hydrogel (10 μL) reagensvolum.
| Laser parametere | Grønn (G) | Nær infrarødt (NIR) |
| Lyskilde | Diode Laser | Diode Laser |
| Bølgelengde (nm) | 525 | 825 |
| Utgangseffekt (mW) | 553 | 515 |
| Strømtetthet (mW/cm2) | 57.48 | 53.53 |
Tabell 2: Laserparametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC er en ideell celletype å bruke til regenerativ medisin, da de stimulerer ulike prosesser for å hjelpe til med sårheling 3,4. Det er imidlertid flere utfordringer som må omgås, for eksempel dårlig overlevelse og ineffektiv inntransplantasjon av cellene i et skadested9. Immortaliserte celler ble brukt som en kommersielt tilgjengelig cellelinje, da de kan passeres i flere generasjoner sammenlignet med primære celler, de trenger ikke å høstes, er godt karakterisert og er homogene populasjoner som sikrer konsistente resultater31. Målet med denne studien var å bestemme det økende potensialet for PBM på proliferasjon og cytotoksisitet av ADSC, ved bruk av 3D-cellekultur. Produsentens protokoll for en 30 μL hydrogel er tilpasset en 10 μL for å spare kostnad32. Dette reduserte volumet gjorde imidlertid forberedelsen og håndteringen av gelen vanskeligere.
ADSC-er har vist seg å aggregere seg selv i et 3D-miljø33. På samme måte i denne studien dannet cellene celleaggregater med et druelignende utseende. Imidlertid ble også enkeltleggingsceller identifisert. Cell shedding er en kjent egenskap av sfæroider der cellene blir løsrevet fra hoved sfæroid eller aggregat kroppen og slippes ut i kulturmiljøet. Celleutskillelse kan skyldes cellulær proliferasjon, hvor levedyktige celler kastes under mitose og tillater migrasjon34. Alternativt kan shedding skyldes celledød og tap av sfæroid eller aggregatform35, spesielt i svært store sfæroider på grunn av en voksende nekrotisk kjerne. Cellene vedtok en avrundet morfologi i 3D-kultur, sammenlignet med en spindelform i 2D-kulturer. I tråd med funnene fra lignende studier, skyldes disse resultatene mangel på festesteder eller ekstracellulær matrise for cellene å feste seg til 6,9. Videre viste cellene ingen signifikant migrasjon i gelen, noe som ytterligere antyder behovet for festesteder36. Det anbefales å legge til et adhesjonspeptid eller et annet ekstracellulært matriksprotein for å lette festing, vedheft og migrasjon. En begrensning av studien var bruken av invers lysmikroskopi for å observere 3D-morfologien til ADSC-ene i stedet for Z-stabling. PBM-eksponering og 3D-kultur hadde ingen signifikant effekt på cytotoksisiteten til ADSC både ved 24 timer og 10 dager etter eksponering, noe som indikerer at hydrogelkultur og PBM er trygge og ikke har noen negativ innvirkning på cellene 6,26. I 3D-cellekultur har ADSC vært assosiert med langsommere proliferasjonshastigheter sammenlignet med 2D-cellekultur. Dette støttes av de lave proliferasjonsratene av de normale kontrollene i den nåværende studien6. PBM (525 nm og 825 nm) økte spredningsratene for ADSC betydelig i 3D-kultur. Til å begynne med fremkalte det grønne lyset (525 nm) ved både 5 J/cm2 og 10 J/cm2 fluenser de høyeste spredningsratene sammenlignet med det nær-infrarøde lyset (825 nm). Ved 10-dagersmerket har imidlertid det nær-infrarøde lyset (825 nm) de høyeste spredningshastighetene ved både 5 J / cm2 og 10 J / cm2 fluenser. Tilsvarende har PBM (525 nm og 825 nm) vist seg å øke spredningshastigheten i 2D-kulturer37. Det anbefales også å inkludere en bølgelengdekombinasjonsgruppe, da andre studier har rapportert en synergistisk effekt av grønt og nær-infrarødt lys.
Avslutningsvis er hydrogelen som brukes en syntetisk hydrogel med enorm tilpasningskapasitet for å dekke behovene til ulike applikasjoner. Den nåværende studien har vist at gelen ikke har noen cytotoksisk effekt på celler i kultur over en 10-dagers periode. Videre viste PBM et positivt forsterkningspotensial ved å betydelig oppregulere spredningsraten til ADSC, til tross for at de var i et 3D-kulturmiljø. Dermed kan denne hydrogelen tjene som en mulig biomaterialbærer for transplantasjon i sår. Fremtidige undersøkelser bør være rettet mot å teste gelens potensielle evne til å bistå i sårheling ved hjelp av dyreforsøk. Hvis resultatene fra dyreforsøk er gunstige, er det tenkt at pasientavledede ADSC-er kan høstes, innkapsles og forsterkes med PBM før transplantasjon i sår for å bistå i sårheling i kliniske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, stipendnummer TTK2205035996; Department of Science and Innovation (DSI) finansiert African Laser Centre (ALC), tilskuddsnummer HLHA23X oppgave ALC-R007; Universitetsforskningsrådet, stipendnummer 2022URC00513; Department of Science and Technology's South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI), stipendnummer 98337. Finansiørene hadde ingen rolle i utformingen av studien, innsamlingen, analysen, tolkningen av dataene eller manusskrivingen. Forfatterne takker University of Johannesburg (UJ) og Laser Research Center (LRC) for deres bruk av fasilitetene og ressursene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M.
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
