Canlı Drosophila Embriyolarının Mikroenjeksiyonunun: Reaktiflerin Gelişmekte Olan Embriyoya Erken Teslimi

- Canlı Drosophila embriyolarını toplayın ve şeffaf olmayan korozyonlarını çıkarın. Daha sonra, cam bir kapakçık üzerine, sıvı heptan içinde çözünmüş bant yapıştırıcısı olan bir heptane tutkal çizgisi uygulayın. Şimdi dekonsiyone olmuş embriyoları idare edebilmek için, örnekleri üst üste dikkatlice yapıştırıcıya hizalayın.

Embriyoları kısmen kurutmak için kapakları bir dehidrasyon odasına aktarın. Bu, enjeksiyonlar sırasında veya sonrasında sitoplazmik sızıntıyı önleyecektir. Daha sonra, kapak saplarını çıkarın ve embriyolara oksijenin yayılmasına izin verirken daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoları halokarbon yağı ile örtün.

Mikroenjeksiyonu gerçekleştirmek için uyumlu bir mikroskop üzerinde mikroenjeksiyon sistemi kullanın. Göz parçalarından bakarak, enjeksiyon çözeltisi ile önceden yüklenmiş hem embriyoları hem de iğneyi tanımlayın. İğneyi açın ve tutarlı ve uygun boyutta sıvı damlalar ürettiğinden emin olun. Sonra, iğneyi embriyonun içine getirin ve uygun hacmi enjekte edin. İğneyi dışarı getirin ve kalan embriyolar için enjeksiyonu tekrarlayarak bir sonrakine geçin.

Örnek protokolde, hücre bölünmesinin canlı görüntüleme çalışmaları için Drosophila embriyo mikroenjeksiyonunun bir gösterimini göreceğiz.

- Kapak sapını kurmadan önce, çift yapışkan bandı açarak ve 100 mililitrelik bir şişeye yerleştirerek heptan yapıştırıcısı yapın. Yaklaşık 50 mililitre hetan ekleyin, şişeyi kapatın ve birkaç gün sallayın.

Embriyoları hazırlamadan önce, enjeksiyondan önce embriyoların yerleştirileceği bir dehidrasyon odası yapın. Bunu yapmak için, 35 milimetrelik bir kabın bir kısmını 100 milimetrelik petri kabının içine bir "masa" yapmak için koyun. Drierite'in yüksekliğinin "tablodan" ve kapaktan daha yüksek olmaması için etrafına susuz kalsiyum sülfat olan Drierite ekleyin.

Embriyoları hazırlamaya başlamak için, önce üzüm suyu tabağını her saat maya ile değiştirerek onları lay kafesten toplayın. Embriyolar, koleksiyonun başlamasından yaklaşık iki saat sonra görüntülenmelidir. Kapak kapağını hazırlamak için, bir mikroskop slaytının bir tarafına yerleştirin ve dört köşeyi aşağı bantlayın, böylece hareket etmez.

Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, kapak üzerindeki bir çizgiye bir heptane tutkal tabakası koyun. Tutkal viskoz olmamalıdır ve birkaç saniye içinde kurumalıdır. Çok kalınsa, daha fazla heptan ekleyin.

Son olarak, kapakçığın yanındaki kaydırağa bir parça çift yapışkan bant koyun. Nemlendirilmiş bir fırça ile embriyoları üzüm suyu tabağından dikkatlice alın ve slayttaki çift yapışkan bant üzerine yerleştirin.

Daha sonra, bir cımbızın yarısını kullanarak embriyoları koroner kırılana kadar çift yapışkan bandın üzerine yuvarlayın. Embriyoyu hafifçe korozyonun üzerine yuvarlayarak alın, böylece cımbıza yapışır ve embriyonun uzun tarafına paralel olarak kapak üzerindeki heptan yapıştırıcısına yerleştirin.

Bir sıraya 10 ila 20 embriyo yerleştirin. Örtüleri çıkarın ve üç ila sekiz dakika boyunca dehidrasyon odasına yerleştirin. Süre lokal neme ve enjekte edilecek miktara bağlıdır. Daha sonra, kapakları vakum yağı ile metal bir odaya yerleştirin. Son olarak, daha fazla dehidratasyondan kaçınmak için embriyoları halokarbon yağı ile örtün. Embriyolar artık enjeksiyona hazırdır.

İlk olarak, embriyoları 16X hedefi altında bulun. Embriyoları uzaklaştırın ve odak düzlemini hareket ettirmeden iğneyi bulun. İğneyi ortaleyin ve X veya Y yönünde hareket ettirmeden yukarı taşıyın.

İğneyi açmak için, kapak ucunun kenarını görüş alanına koyun, ancak bir iğnenin olacağı yere koymayın ve iğneyi aynı odak düzlemine küsmeyin. Çok dikkatli bir şekilde, iğneye çarpana kadar kapak kapağını hareket ettirin ve yavaşça açın.

Şimdi embriyoları görünüme getirin. İğneyi yağa küstür ve iğneden güzel sıvı damlaları elde etmeyi unutmayın. Embriyoyu iğneye sabit bir şekilde hareket ettirin, embriyoya bir damla enjekte edin ve sonra embriyoyu uzaklaştırın. Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, 60 veya 100X hedefi olan bir konfokal mikroskop üzerinde gözleme hazırdırlar.