שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות
Summary
כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.
Abstract
דג הזברה כבר מזמן מנוצל כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של פיתוח על ידי הדמיה זמן לשגות של העובר שקוף החיים. כאן אנו מתארים שיטה לעלות עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך להדגים כיצד להפוך את לכידתו של זמן לשגות תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal. כמו כן, אנו מתארים שיטה כדי ליצור נזק מבוקר, מדויקת ענפים בודדים של אקסונים חושית הפריפריה דג הזברה באמצעות כוח ממוקד של לייזר femtosecond רכוב על מיקרוסקופ שני הפוטונים. הפרמטרים עבור axotomy שני הפוטונים מוצלח חייב להיות מותאם לכל מיקרוסקופ. נדגים שני הפוטונים axotomy משני מיקרוסקופ אישית שני הפוטונים בנוי 510 Zeiss / confocal שני הפוטונים לתת שתי דוגמאות.
נוירונים דג הזברה חושית trigeminal ניתן דמיינו ב-GFP קו מהונדס המבטא מונע על ידי האמרגן תא עצב תחושתי ספציפי 1. אנחנו צריכים להתאים את המודל הזה trigeminal דג הזברה ישירות לקיים התחדשות האקסון חושית חיים עוברי דג הזברה. עוברים מורדמים עם tricaine וממוקמים בתוך טיפת agarose כפי שהיא מחזקת. עוברים משותקת סגורים בתוך תא הדמיה מלאים phenylthiourea (PTU) האצבעות. מצאנו כי עוברי ניתן הדמיה ברציפות במשך 12-48 שעות בתאי אלה. תמונה confocal אחד הוא נתפס לאחר מכן כדי לקבוע את האתר הרצוי axotomy. האזור של עניין נמצא על מיקרוסקופ שני הפוטונים על ידי הדמיה אקסונים חושית תחת צריכת חשמל נמוכה שאינם מזיקים,. לאחר התקרבות באתר הרצוי axotomy, הכוח הוא גדל סריקה אחת של אזור מוגדר מספיק כדי לנתק את האקסון. הדמיה מרובים זמן לשגות במיקום מוגדר אז על מיקרוסקופ confocal ישירות לקיים axonal התאוששות מפציעה.
Protocol
Discussion
השתמשנו בשיטות המתוארות במדויק axotomize אקסונים חושית הפריפריה ישירות לקיים התחדשות בעובר חי דג הזברה. ארוך טווח זמן לשגות הדמיה confocal של דג הזברה יכול לשמש כדי לצפות תהליכים התפתחותיים רבים in vivo. הליך שני הפוטונים axotomy המתואר יכול להיות שונה עבור מטרות רבות ניסויים…
Acknowledgements
אנו מודים סמן Terasaki לייעוץ ראשוני באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים ליצור נזק לרקמות מקומיות, קתי Joubin עצה על הרכבה הדמיה זמן לשגות, לבין Sagasti ו-Portera Cailliau מעבדות לדיונים. הניסויים הראשוניים בוצעו על ידי AS כמו עמית גראס קרן במעבדות לביולוגיה ימית בוודס הול, מסצ'וסטס. עבודה במעבדה Sagasti נתמך על ידי מענקים מקרן וייטהול, קרן Klingenstein, וכן פרס קרן Wellcome בורוז קריירה במדעי הביולוגיה.
References
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
