Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo
Summary
Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.
Abstract
Peixe-zebra tem sido utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento por lapso de tempo de imagem do embrião vivo transparente. Aqui nós descrevemos um método para montar embriões zebrafish de longo prazo de imagem e demonstrar como automatizar a captura de imagens de lapso de tempo usando um microscópio confocal. Descrevemos também um método para criar danos, controlado precisa para ramos individuais de axônios sensitivos periféricos em zebrafish usando o poder concentrado de um laser de femtosegundos montado em um microscópio de dois fotões. Os parâmetros para axotomia dois fótons de sucesso deve ser otimizada para cada microscópio. Vamos demonstrar dois fótons axotomia em ambos um costume construída microscópio de dois fótons e uma Zeiss 510 / confocal de dois fótons para fornecer dois exemplos.
Zebrafish trigeminal neurônios sensoriais podem ser visualizados em uma linha de transgênicos expressando GFP dirigido por um promotor neurônio sensorial específica 1. Nós adaptamos este modelo zebrafish trigeminal para observar diretamente a regeneração do axônio sensorial em que vivem os embriões do zebrafish. Embriões são anestesiados com tricaina e posicionado dentro de uma gota de agarose como ela se solidifica. Embriões imobilizado são selados dentro de uma câmara de imagem cheia de phenylthiourea (PTU) Ringers. Nós descobrimos que os embriões podem ser continuamente trabalhada, nas câmaras de 12-48 horas. A única imagem confocal é então capturado para determinar o local desejado para a axotomia. A região de interesse está localizado no microscópio de dois fotões por imagem os axônios sensoriais em baixa, o poder não-prejudicial. Depois de ampliar no local desejado de axotomia, a potência é aumentada e uma única varredura da região definida é suficiente para romper o axônio. Múltiplas localização de imagens de lapso de tempo é então configurado em um microscópio confocal para observar diretamente a recuperação de uma lesão axonal.
Protocol
Discussion
Nós temos usado os métodos descritos com precisão axotomize periféricos axônios sensitivos e observar diretamente a regeneração no embrião do zebrafish vida. Longo prazo de imagens de lapso de tempo confocal em zebrafish pode ser usado para observar muitos processos de desenvolvimento in vivo. O procedimento axotomia dois fótons descritos podem ser modificadas para muitos diferentes objetivos experimentais. Temos usado o mesmo procedimento geral para extirpar toda trigeminal corpos celulares dos neurô…
Acknowledgements
Agradecemos a Mark Terasaki para aconselhamento inicial sobre o uso de um microscópio de dois fótons para criar dano tecidual local, Kathy Joubin para aconselhamento sobre a montagem de lapso de tempo de imagem, e os laboratórios Sagasti e portera-Cailliau para as discussões. Experimentos iniciais foram realizados por AS como Fellow da Fundação grama nos laboratórios de Biologia Marinha de Woods Hole, MA. Trabalho no laboratório Sagasti foi suportada por concessões da Fundação Whitehall, a Fundação Klingenstein, e um Burroughs Wellcome Fund Prémio Carreira em Ciências Biológicas.
References
- Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15, 804-814 (2005).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Sacconi, L. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Yanik, M. F. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822-822 (2004).
- Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. Mechanisms of laser cellular microsurgery. Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).
