ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング
Summary
ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。
Abstract
ゼブラフィッシュは、長く生きて透明な胚のタイムラプスイメージングが開発中の細胞および分子メカニズムを研究するために利用されている。ここでは、長期的なイメージングのためのゼブラフィッシュ胚をマウントする方法を説明し、共焦点顕微鏡を用いたタイムラプス画像のキャプチャを自動化する方法を示します。我々はまた、二光子顕微鏡に搭載されたフェムト秒レーザーの集光力を用いてゼブラフィッシュの末梢感覚軸索の個々の枝に制御された、正確なダメージを作成する方法を説明します。成功した二光子軸索切断のためのパラメータは、それぞれの顕微鏡用に最適化されている必要があります。我々は二つの例を提供するためにカスタムされた2光子顕微鏡とツァイス510共焦点/二光子の両方で二光子軸索切断のデモンストレーションを行います。
ゼブラフィッシュの三叉神経感覚ニューロンは、感覚神経特異的プロモーター1によって駆動トランスジェニックラインを発現GFPで可視化することができる。我々は直接ゼブラフィッシュ胚の生体内での感覚軸索再生を観察するためにこのゼブラフィッシュの三叉神経モデルを適応している。それが固化すると胚はtricaineで麻酔し、アガロースのドロップ内に配置。固定された胚は、フェニルチオ尿素（PTU）リンガーズで満たされたイメージングチャンバー内に封入されています。我々は、胚が連続して12から48時間のためにこれらのチャンバーでイメージングできることを見出した。単一の共焦点イメージは、軸索切断の目的のサイトを決定するためにキャプチャされます。関心領域は画像処理による2光子顕微鏡の低、非損傷電力下感覚軸索に位置しています。軸索切断の目的のサイト上で拡大した後、電力が増加し、その定義された領域の単一のスキャンでは、軸索を切断するのに十分です。複数の場所タイムラプスイメージングは、直接、負傷から軸索の回復を観察するために共焦点顕微鏡に設定されています。
Protocol
Discussion
我々は正確に末梢感覚軸索をaxotomizeすると、直接生活ゼブラフィッシュの胚で再生を観察するために説明する方法を使用している。ゼブラフィッシュにおける長期タイムラプス共焦点イメージングは、 生体内で多くの発達過程を観察するために使用することができます。説明する2つの光子軸索切断の手順は、多くの異なる実験の目的のために変更することができます。我々は、細胞?…
Acknowledgements
我々は議論をタイムラプスイメージングのための取付けに関するアドバイスはキャシージュバン、地元の組織の損傷を作成するには、二光子顕微鏡を用いて上での最初のアドバイスのためにマーク寺崎に感謝、そしてSagastiとPortera – Cailliauラボ。初期の実験は、ウッズホール、マサチューセッツ州の海洋生物学研究所のグラス財団のフェローとして、ASによって行われた。 Sagastiラボの仕事はホワイト財団、Klingenstein財団、生物科学におけるバローズウェルカム基金のキャリア賞からの補助金によって支えられている。
References
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