Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo
Summary
Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.
Abstract
Zebrafish sono stati a lungo utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo da parte time-lapse imaging del embrione vivente trasparente. Qui si descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging e di dimostrare come automatizzare la cattura di time-lapse immagini utilizzando un microscopio confocale. Abbiamo anche descrivere un metodo per creare controllato e preciso per i danni di singoli rami periferici assoni sensoriali in zebrafish utilizzando la potenza concentrata di un laser a femtosecondi montato su un microscopio a due fotoni. I parametri per il successo a due fotoni assotomia deve essere ottimizzato per ogni microscopio. Dimostreremo a due fotoni assotomia sia su un personalizzato costruito a due fotoni e un microscopio Zeiss 510 / confocale a due fotoni per fornire due esempi.
Zebrafish neuroni sensoriali del trigemino possono essere visualizzati in una linea transgenici che esprimono GFP guidata da un promotore dei neuroni sensoriali specifici 1. Abbiamo adattato questo modello zebrafish trigemino di osservare direttamente la rigenerazione degli assoni sensitivi in vita embrioni di zebrafish. Embrioni sono anestetizzati con tricaine e posizionato all'interno di una goccia di agarosio come si solidifica. Embrioni immobilizzati sono sigillati all'interno di una camera piena di immagini phenylthiourea (PTU) suonerie. Abbiamo scoperto che gli embrioni possono essere continuamente ripreso in queste camere per 12-48 ore. Una singola immagine confocale viene poi catturato per determinare il sito desiderato assotomia. La regione di interesse si trova sul microscopio a due fotoni per immagini gli assoni sensoriali in basso, che non infligge danno potere. Dopo lo zoom sul sito desiderato assotomia, la potenza è aumentata e una singola scansione di quella regione definita è sufficiente per recidere l'assone. Multiple location time-lapse imaging è quindi impostare su un microscopio confocale per osservare direttamente il recupero da un infortunio assonale.
Protocol
Discussion
Abbiamo usato i metodi descritti per axotomize proprio assoni periferici sensoriali e di osservare direttamente la rigenerazione di un embrione in zebrafish vivente. A lungo termine time-lapse confocale in zebrafish può essere usato per osservare molti processi di sviluppo in vivo. I due fotoni assotomia procedura descritta può essere modificata per molti scopi diversi sperimentali. Abbiamo usato la stessa procedura generale per l'ablazione intero trigemino corpi cellulari dei neuroni sensoriali, con lo z…
Acknowledgements
Ringraziamo Segna Terasaki per la consulenza iniziale utilizzando un microscopio a due fotoni per creare danni del tessuto locale, Kathy Joubin per un consiglio su montaggio per time-lapse imaging, ed i laboratori Sagasti e Portera-Cailliau per le discussioni. Le prime esperienze sono state eseguite da AS come Fellow Grass Fondazione presso i laboratori di biologia marina di Woods Hole, Massachusetts. Lavoro in laboratorio Sagasti è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Whitehall, la Fondazione Klingenstein, e un Premio alla Carriera Burroughs Wellcome Fondo in Scienze Biologiche.
References
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