植物原生质体的荧光激活细胞分选
Summary
一个隔离特定的细胞类型，从植物材料的方法是证明。这种技术采用特定类型的细胞，细胞分离和荧光激活细胞分选表达荧光蛋白的转基因标记线。此外，增长的设置是在这里建立，有利于治疗<em>拟南芥</em>细胞分选前的幼苗。
Abstract
高分辨率，细胞类型特异性基因表达分析，大大提高了发育调控的理解和在任何多细胞生物体的环境刺激的反应原位杂交和报告基因的可视化，可以在有限的范围内为此目的使用，但对于高分辨率的定量。 RT – PCR或高通量转录全分析特定的细胞类型的RNA分离是必要的。细胞表达一种荧光蛋白标记的组织，在一个特定的细胞类型和随后的荧光激活细胞分选（FACS）的解离，使人们有可能足够数量的材料收集RNA提取，cDNA合成/扩增和基因芯片分析。
一个广泛的细胞类型特异性荧光记者行，是植物研究界。在这种情况下， 拟南芥根的两个标记线：P可控硅：GFP（内皮和静态中心） 和P WOX5：绿色荧光蛋白（静态中心） 。大量的幼苗（千）水培或平板和收获，以获得足够的根材料作进一步的分析。是通过细胞壁的酶消化细胞分解的植物材料。此过程使得使用高渗透压引起质壁分离和市售的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶释放到溶液中的原生质体。
GFP阳性细胞流式细胞仪使用可视化的绿色与红色的发射光谱由488 nm激光激发的原生质体。 GFP阳性的原生质体可以区分增加绿色比红色发射。原生质体是典型的排序直接到RNA的提取液和存储在稍后的时间进一步处理。
这种技术是显示简单和可行的。此外，它表明，它可以毫无困难地使用隔离足够数量的细胞转录组分析的，即使是非常稀少的细胞类型 （如静态的中心细胞）。最后，证明了拟南芥幼苗的生长设置，使无并发症治疗的植物细胞分选前（如生物或非生物的应激反应的细胞类型特异性分析）。讨论可能的补充使用植物原生质体的流式细胞仪。
Protocol
Discussion
原生质体，原则上可以来自多种植物组织，优化了有利条件，将大大提高RNA的质量和数量。 protoplasting解决方案和选修孵化缓冲会影响这方面的问题。
许多不同的荧光蛋白可以使用，这取决于所用流式细胞仪的功能，如GFP，RFP，YFP，CFP资格或他们的许多变种及衍生工具。标志物的表达不只是可以驱动细胞类型特异性启动子或增强子陷阱，如下所示，但也由你最喜欢的发…
Acknowledgements
这项工作是支持由美国国家科学基金会（授予没有。DBI 0519984）和美国国立卫生研究院（赠款。5R01GM078279）..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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