Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten
Summary
Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan dat vergemakkelijkt de behandeling van<em> Arabidopsis thaliana</em> Zaailingen voorafgaand aan de cell sorting.
Abstract
Hoge-resolutie, celtype-specifieke analyse van genexpressie vergroot begrip van de ontwikkelings-regelgeving en reacties op prikkels uit de omgeving in een meercellig organisme. In situ hybridisatie en reportergen visualisatie kan in beperkte mate worden gebruikt voor dit doel, maar voor hoge resolutie kwantitatieve RT-PCR of high-throughput transcriptoom-brede analyse van de isolatie van RNA uit bepaalde celtypen is vereiste. Cellulaire dissociatie van weefsel expressie brengen van een fluorescerend eiwit marker in een bepaald celtype en de daaropvolgende Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) maakt het mogelijk om voldoende hoeveelheden materiaal te verzamelen voor RNA-extractie, cDNA synthese / versterking en microarray analyse.
Een uitgebreide set van celtype-specifieke tl-reporter-lijnen is beschikbaar voor de plant onderzoeksgemeenschap. In dit geval worden twee marker lijnen van de Arabidopsis thaliana wortel gebruikt: P SCR:: GFP (endodermis en rust midden) en P WOX5:: GFP (quiescent center). Grote aantallen (duizenden) van zaailingen zijn hydroponically of op agarplaten geteeld en geoogst om voldoende wortel materiaal voor verdere analyse te verkrijgen. Cellulaire dissociatie van plantmateriaal wordt bereikt door enzymatische afbraak van de celwand. Deze procedure maakt gebruik van een hoge osmolariteit-geïnduceerde plasmolyse en commercieel beschikbaar cellulasen, om pectinasen en hemicellulasen vrijkomen protoplasten in de oplossing.
FACS van GFP-positieve cellen maakt gebruik van de visualisatie van de groene versus de rode emissie spectra van protoplasten opgewekt door een 488 nm laser. GFP-positieve protoplasten kunnen worden onderscheiden door hun verhoogde ratio van groen naar rood emissie. Protoplasten worden meestal direct gesorteerd op RNA-extractie buffer en opgeslagen voor verdere verwerking op een later tijdstip.
Deze techniek is geopenbaard worden eenvoudig en uitvoerbaar zijn. Verder wordt aangetoond dat het kan worden gebruikt zonder moeite om voldoende aantallen cellen te isoleren voor het transcriptoom analyse, zelfs voor zeer schaars celtypes (bv. quiescent center cellen). Ten slotte wordt een groei setup voor Arabidopsis zaailingen aangetoond dat in staat stelt eerdere ongecompliceerde behandeling van de planten naar cel sorteren (bijvoorbeeld voor het celtype-specifieke analyse van de biotische of abiotische stress-reacties). Mogelijke aanvullende toepassingen voor FACS van plantenprotoplasten worden besproken.
Protocol
Discussion
Protoplasten kunnen in principe worden afgeleid uit een verscheidenheid van plantaardige weefsels, het optimaliseren van gunstige voorwaarden zal sterk RNA kwaliteit en kwantiteit te verbeteren. Zowel de protoplasting oplossing en de electieve gebruikte incubatiebuffer invloed zal dit aspect.
Veel verschillende fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de mogelijkheden van de gebruikte FACS, bijvoorbeeld GFP, RFP, YFP, GVB of hun vele varianten en derivaten. De…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (subsidie niet. DBI 0.519.984) en de National Institutes of Health (subsidie niet. 5R01GM078279) ..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
