植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別
Summary
植物材料から、特定の種類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている<em>シロイヌナズナ</em細胞選別の前に>苗。
Abstract
遺伝子発現の高解像度、細胞型特異的な分析は非常に発達規制とあらゆる多細胞生物の環境刺激に対する反応の理解を深める。situハイブリダイゼーションおよびレポーター遺伝子の可視化でできる限られた範囲で、この目的のために使用されるが、高分解能の定量のためにすることにRT – PCRまたはハイスループットトランスクリプトーム全体の分析、特定の細胞型からのRNAの分離は必須です。特定の細胞型とそれに続く蛍光活性化細胞選別（FACS）で蛍光タンパク質マーカーを発現する組織の細胞の解離により、RNA抽出、cDNA合成/増幅とマイクロアレイ解析のために材料の十分な量を収集することができます。
細胞タイプ特異的蛍光レポーターラインの拡張セットは、植物の研究コミュニティに利用可能です。このケースでは、 シロイヌナズナの根の2つのマーカ線が使用されています：P SCR：：GFP（内皮および静止センター）とP WOX5：：GFP（静止センター）。苗の大量（数千）は水耕や寒天プレート上で成長し、さらなる分析のために十分なルートの材料を得るために収穫されます。植物素材の細胞の解離は、細胞壁の酵素消化によって実現されます。この手順では、高浸透圧誘導性の原形質分離と溶液中にプロトプラストを解放するために市販のセルラーゼ、ペクチナーゼ及びヘミセルラーゼを使用しています。
GFP陽性細胞のFACSは、488 nmレーザーで励起されたプロトプラストの赤色発光スペクトル対緑の可視化を利用しています。 GFP陽性のプロトプラストは、赤色発光の緑色のそれらの比の上昇によって区別することができます。プロトプラストは、通常のRNA抽出緩衝液に直接ソートされ、後での処理のために保存されています。
この手法は単純で実用的であることが明らかになりました。さらに、それはそれであっても非常に希少な種類の細胞（ 例えば、静止中心の細胞）のために、トランスクリプトーム解析のために細胞の十分な数字を分離するために困難なく使用できることが示されている。最後に、シロイヌナズナ実生の成長のセットアップは、セルソーティング（細胞の種類に固有の生物的または非生物的ストレス応答の解析のためなど ）する前に、植物の合併症の治療を可能にすることが示されている。植物プロトプラストのFACSのための潜在的な補足の使い方が説明されています。
Protocol
Discussion
プロトプラストは、原則として、植物組織の様々な由来することが、有利な条件の最適化は大幅にRNAの質と量を強化することができます。 protoplastingソリューションと使用される選択科目インキュベーションバッファーの両方が、この側面に影響を与えます。
多くの異なる蛍光タンパク質は、YFP、CFPまたはそれらの多くの変種および誘導体、 例えば、GFP、RFP、使?…
Acknowledgements
この作品は、国立科学財団（助成金なし。DBI 0519984）と国立衛生研究所（助成金なし。5R01GM078279）によってサポートされていました..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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