מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח
Summary
שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת טיפול<em> ארבידופסיס thaliana</em> השתילים לפני מיון התא.
Abstract
ברזולוציה גבוהה, סוג ספציפי תא ניתוח של ביטוי גנים משפר באופן משמעותי את ההבנה של תקנה התפתחותית ולתגובות לגירויים סביבתיים באורגניזם כלשהו תאיים. ההכלאה ב באתרו גן להדמיה עיתונאי יכול במידה מוגבלת לשמש למטרה זו אבל ברזולוציה גבוהה כמותי RT-PCR או תפוקה גבוהה transcriptome רחב ניתוח הבידוד של RNA מתוך סוגי תאים מסוים הנדרש. נייד ניתוק של רקמת להביע סמן חלבון פלואורסצנטי בסוג תאים ספציפיים ומיון הבאים פלואורסצנטי תא פעיל (FACS) מאפשרת לאסוף כמות מספקת של חומר להפקת RNA, cDNA ניתוח סינתזה / הגברה microarray.
סט נרחב של סוג ספציפי שורות תאים כתב ניאון זמין לקהילה מחקר הצמח. במקרה זה, שתי שורות סמן השורש thaliana ארבידופסיס משמשים: P SCR: GFP (endodermis מרכז שקט) ו-P WOX5: GFP (מרכז שקט). מספר רב (אלפים) של השתילים גדלים hydroponically או על צלחות אגר וקצרו להשיג חומר שורש מספיק לניתוח נוסף. נייד ניתוק של חומר צמחי מושגת על ידי עיכול אנזימטי של התא הקיר. הליך זה עושה שימוש plasmolysis osmolarity-Induced גבוה cellulases זמינים מסחרית, pectinases ו hemicellulases לשחרר protoplasts לתוך פתרון.
FACS-GFP חיובי תאים עושה שימוש להדמיה של ירוק לעומת ספקטרום פליטה אדום של protoplasts נרגש לייזר 488 ננומטר. GFP חיובי protoplasts ניתן להבחין ביחס מוגברת שלהם ירוק פליטה אדום. Protoplasts ממוינות בדרך כלל ישירות לתוך חוצץ מיצוי RNA ומאוחסנים לעיבוד נוסף במועד מאוחר יותר.
טכניקה זו מתגלה להיות פשוטה מבחינה מעשית. יתר על כן, הוא הראה כי ניתן להשתמש בו ללא קושי לבודד בכמות מספקת של תאים עבור ניתוח transcriptome, אפילו סוגי תאים נדירים מאוד (למשל תאים מרכז שקט). לבסוף, תוכנית ההתקנה של צמיחה עבור שתילים ארבידופסיס הוא הוכיח המאפשרת טיפול לא מסובך הצמחים לפני מיון התא (לדוגמא עבור סוג ספציפי של התא ניתוח של תגובות דחק ביוטי או אביוטי). משלים פוטנציאל לשימושים FACS של protoplasts צמח הם דנו.
Protocol
Discussion
Protoplasts יכול, באופן עקרוני, להיגזר במגוון של רקמות הצמח, אופטימיזציה תנאים נוחים יהיה מאוד לשפר את איכות וכמות RNA. הן פתרון protoplasting ואת חיץ הדגירה בחירה בשימוש ישפיעו על היבט זה.
רבים חלבוני ניאון שונים יכול לשמש, בהתאם ליכולות של FACS …
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק לא. DBI 0519984) לבין המכון הלאומי לבריאות (ללא מענק. 5R01GM078279) ..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
