طريقة محسنة لعزل الحمض النووي الريبي من الصنوبر Loblolly ( P. taeda L.) والأنواع الأخرى الصنوبرية
Summary
العديد من الأنسجة النباتية ، بما في ذلك اللحاء والخشب من الصنوبر loblolly (<em> صنوبر taeda</em> L.) ، تحتوي على مستويات عالية من السكريات والفينولات التي تتداخل مع تنقية الحمض النووي الريبي. يناقش هذا العرض التقديمي تقنيات حصاد الميداني نمت الأنسجة وعزل الحمض النووي الريبي ذات نوعية كافية لميكروأرس الجينومية والتحليلات الأخرى.
Abstract
الأنسجة المعزولة من الأنواع الصنوبرية ، وبخاصة أولئك الذين ينتمون إلى عائلة Pinaceae ، مثل الصنوبر loblolly (<em> صنوبر taeda</em> L.) ، تحتوي على تركيزات عالية من مركبات الفينول والسكريات التي تتداخل مع تنقية الحمض النووي الريبي. العزلة ذات جودة عالية من الحمض النووي الريبي هذه الأنواع تتطلب إجراءات صارمة لجمع الأنسجة في هذا المجال والعمل على وضع بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي يتألف من عدة خطوات استخراج العضوية من أجل عزل الحمض النووي الريبي ذات نوعية كافية لميكروأري الجينومية والتحليلات الأخرى. عزل ذات جودة عالية من الحمض النووي الريبي الميداني بجمع عينات من الصنوبر loblolly صعبة يمكن ان يكون ، ولكن تعديلات عدة على مستوى الأنسجة وإجراءات عزل الحمض النووي الريبي تحسن كثيرا من النتائج. مدى تدهور RNA زيادات عامة إذا لم يتم بشكل صحيح العينات التي تم جمعها ونقلها من الميدان ، ولا سيما خلال مواسم الحصاد على نطاق واسع. ويمكن زيادة غلة مجموع عينات الحمض النووي الريبي بشكل ملحوظ في تحطيم مصنع النيتروجين السائل المجمد قبل RNA العزلة ، وخصوصا عندما تأتي من عينات الأنسجة الخشبية. هذا يرجع أساسا إلى وجود عوامل المؤكسدة ، مثل مركبات الفينول ، والسكريات التي هي على حد سواء الحالية على مستويات عالية في مقتطفات من الأنسجة الخشبية لمعظم الأنواع الصنوبرية. إن لم يكن إزالة ، ويمكن لهذه الملوثات تحمل أكثر مما يؤدي إلى مشاكل ، مثل تدهور RNA ، التي تؤدي إلى انخفاض غلة والفقراء عينة الحمض النووي الريبي الجودة. يمكن المرحل من المركبات الفينولية ، فضلا عن السكريات ، وخفض أيضا أو حتى القضاء تماما على نشاط أو الناسخ العكسي polymerases الأخرى المستخدمة عادة لتخليق [كدنا]. ويجب على وجه الخصوص ، RNA الموجهة لاستخدامه كقالب لالمزدوج تقطعت بهم السبل التوليف [كدنا] في توليد مكتبات [كدنا] ، واحد الذين تقطعت بهم السبل التوليف [كدنا] لPCR أو في qPCR ، أو لتجميع المواد المستهدفة ميكروأري تكون من أعلى مستوى من الجودة إذا ما توصل الباحثون يتوقعون للحصول على النتائج المثلى. تقنيات عزل الحمض النووي الريبي استخداما بالنسبة للعديد من الأنواع النباتية الأخرى وغالبا ما تكون غير كافية من حيث قدرتها على إزالة هذه الملوثات من عينات الصنوبرية ، وبالتالي لم تسفر مجموع عينات الحمض النووي الريبي مناسبة للتلاعب المصب. في هذا الفيديو نظهر أساليب الجمع الميداني للأنسجة الصنوبرية ، بدءا من قطع شجرة عمرها الأربعين ، إلى حصاد اللحاء ، الخشب الثانوي ، وتفاعل الخشب الخشب. نظهر ايضا بروتوكولا العزلة الحمض النووي الريبي التي أسفرت باستمرار عالية الجودة الحمض النووي الريبي للتلاعب الأنزيمية لاحقة.
Protocol
Discussion
يمكن الحصول على نوعية عالية من الحمض النووي الريبي الأنواع الصنوبرية يكون مهمة صعبة نظرا لمستويات عالية من مركبات الفينول والسكاريد موجودة في الأنسجة الخشبية. بدءا من البروتوكول التي وضعتها تشانغ وآخرون. (1) ، وجدنا أن استخراج أكثر صرامة وتنظيف خطوات تؤدي إلى العزلة …
Acknowledgements
نود أن نشكر الأشخاص الذين التالي دون مساعدة مجموعة من الأنسجة الصنوبر لن يكون ممكنا : الدكتور جو نيرن ، Bryman مات ، مايكل بوردو ، Bagal Ujwal ، جين Huizhe ، وأماندا بوفييه.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
