שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ ' taeda ל) ומינים אחרים Conifer
Summary
הצמח וברקמות רבים, כולל השיפה ו העצה של אורן loblolly (<em> Pinus taeda</em> ל), מכילים רמות גבוהות של phenolics ופוליסכרידים שמפריעים טיהור RNA. מצגת זה דן טכניקות הקציר השדה גדל רקמות הבידוד של רנ"א באיכות מספקת microarrays ומנתח גנומית אחרים.
Abstract
רקמות שבודד מינים כוניפאר, בעיקר אלה השייכים למשפחת Pinaceae, כגון אורן loblolly (<em> Pinus taeda</em> ל), מכילים ריכוז גבוה של תרכובות פנוליות ופוליסכרידים שמפריעים טיהור RNA. בידוד איכותיים RNA ממינים אלה מחייב איסוף קפדני רקמות נהלים בתחום וכן את העסקתם של פרוטוקול בידוד RNA מורכב מספר שלבים מיצוי אורגני כדי לבודד RNA באיכות מספקת microarray גנומי וניתוחים אחרים. הבידוד באיכות גבוהה RNA מן השדה שנאספו אורן loblolly דגימות יכול להיות מאתגר, אבל כמה שינויים ברקמת תקן ונהלים RNA בידוד לשפר באופן משמעותי את התוצאות. היקף השפלה RNA כללי מגדילה אם דגימות אינם נאספים כראוי והעבירו מהשדה, במיוחד במהלך רחב היקף היבול. סך התשואות RNA ניתן להגדיל באופן משמעותי טחנת במקפיא חנקן נוזלי לפני RNA בידוד על ידי דגימות כתישה, במיוחד כאשר מגיעים דגימות מרקמות וודי. זה בעיקר בשל נוכחותם של סוכני חמצון, כגון תרכובות פנוליות, ופוליסכרידים כי הן נוכח רמות גבוהות של תמציות מרקמות של מינים מעוצים כוניפאר ביותר. אם לא יוסר, מזהמים אלו יכולות לשאת מעל המובילים לבעיות, כגון רנ"א השפלה, כי בעקבות התשואות נמוכות מדגם באיכות ירודה RNA. שריד של תרכובות פנוליות, כמו גם סוכרים, יכול גם להפחית או אפילו לבטל לחלוטין את הפעילות של transcriptase הפוכה או polymerases השני הנפוץ לסינתזה cDNA. בפרט, RNA נועד לשמש כתבנית לסינתזה פעמיים תקועים cDNA בדור של ספריות cDNA, חד גדילי סינתזה cDNA עבור PCR או qPCR של, או לסינתזה של חומרים היעד microarray חייב להיות באיכות הגבוהה ביותר אם החוקרים לצפות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. טכניקות בידוד RNA מועסקים בדרך כלל על מיני צמחים רבים אחרים הם לעתים קרובות מספיק ביכולתם להסיר מזהמים אלה מדגימות כוניפאר ולכן לא התשואה הכולל דגימות RNA מתאים מניפולציות במורד הזרם. בסרטון הזה אנחנו מדגימים שיטות לאיסוף השדה של רקמות כוניפאר, החל כריתת עץ בן ארבעים, על קצירת של השיפה, העצה המשנית, ועץ העצה התגובה. אנחנו גם להדגים פרוטוקול בידוד RNA אשר הניב באופן עקבי באיכות גבוהה של רנ"א מניפולציות האנזימטית הבאים.
Protocol
Discussion
קבלת באיכות גבוהה RNA ממינים כוניפאר יכול להיות משימה קשה בהתחשב רמות גבוהות של תרכובות פנוליות וכן פוליסכריד נמצא ברקמות וודי. החל פרוטוקול שפותח על ידי Chang et al. (1), נמצא כי מיצוי קפדני יותר לנקות צעדים להוביל לבידוד עקבית של RNA מסך מאוד איכותי של וודי וודי שונים שאינם ר…
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאנשים הבאים שללא עזרתה אוסף של רקמות אורן לא היה אפשרי: ד"ר ג'ו נעים, מאט Bryman, מיכאל בורדו, Ujwal Bagal, Huizhe ג'ין, ואמנדה Bouffier.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
