Un metodo migliorato di isolamento dell'RNA da Pino Loblolly ( P. taeda L.) e altre specie di conifere
Summary
Tessuti vegetali, tra cui floema e xilema di pino loblolly (<em> Pinus taeda</em> L.), contengono alti livelli di fenoli e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione di RNA. Questa presentazione discute le tecniche per la raccolta del campo coltivato tessuti e l'isolamento di RNA di qualità sufficiente per microarray e analisi genomiche di altri.
Abstract
Tessuti isolati da specie di conifere, in particolare quelli appartenenti alla famiglia delle Pinaceae, come il pino loblolly (<em> Pinus taeda</em> L.), contengono alte concentrazioni di composti fenolici e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione di RNA. Isolamento di alta qualità RNA da queste specie richiede rigorose procedure di tessuto raccolta sul campo e l'impiego di un protocollo di isolamento del RNA costituito da più fasi di estrazione organica al fine di isolare l'RNA di qualità sufficiente per microarray ed altre analisi genomiche. L'isolamento di alta qualità RNA da campioni raccolti sul campo pino loblolly può essere impegnativo, ma diverse modifiche ai tessuti standard e procedure di isolamento dell'RNA migliorare notevolmente i risultati. Il grado di degradazione dell'RNA generale aumenta se i campioni non sono adeguatamente raccolti e trasportati dal campo, specialmente durante grandi raccolti. Totale rendimenti RNA può essere aumentato in modo significativo da campioni polverizzando in un mulino di azoto liquido congelatore prima di RNA isolamento, soprattutto se i campioni provengono da tessuti legnosi. Ciò è dovuto principalmente alla presenza di agenti ossidanti, come i composti fenolici e polisaccaridi che sono entrambi presenti ad alti livelli in estratti dai tessuti legnosi di specie più conifere. Se non rimosso, questi contaminanti possono riportare le porta a problemi, come l'RNA degradazione, che si traducono in basse rese e un povero campione di qualità RNA. Riporto di composti fenolici, così come polisaccaridi, può anche ridurre o persino eliminare completamente l'attività della trascrittasi inversa o altre polimerasi comunemente utilizzato per la sintesi del DNA. In particolare, l'RNA destinati ad essere utilizzati come modello per doppio filamento sintesi di cDNA per la generazione di librerie di cDNA a singolo filamento la sintesi del DNA per PCR o qPCR, o per la sintesi di materiali bersaglio di microarray deve essere di ottima qualità se i ricercatori si aspettano per ottenere risultati ottimali. Tecniche di isolamento dell'RNA comunemente impiegato per molte altre specie di piante sono spesso insufficienti nella loro capacità di rimuovere questi contaminanti da campioni di conifere e quindi non resa totale campioni di RNA adatto per le manipolazioni a valle. In questo video ci dimostrano i metodi per la raccolta settore dei tessuti di conifere, iniziando con l'abbattimento di un quarantenne albero, per la raccolta di floema, xilema secondario, e il legno xilema reazione. Abbiamo anche dimostrare un protocollo di isolamento di RNA che ha sempre prodotto di alta qualità RNA per le successive manipolazioni enzimatiche.
Protocol
Discussion
Ottenere di alta qualità RNA da specie di conifere può essere un compito difficile, visti gli elevati livelli di composti fenolici e polisaccaride che si trova nei tessuti legnosi. A partire dal protocollo sviluppato da Chang et al. (1), abbiamo trovato che l'estrazione più rigorosa e ripulire gradini conducono all'isolamento coerente di altissima qualità RNA totale da woody diversi e non-tessuti legnosi campionato da una grande varietà di specie di conifere. Questo video ha dimostrato non solo il nostro pr…
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare le seguenti persone senza il cui aiuto la collezione di tessuti pino non sarebbe stato possibile: Dr. Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, e Amanda Bouffier.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
