Summary

Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

Published: February 15, 2010
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Summary

Corantes FM tem sido de inestimável ajuda na compreensão da dinâmica sináptica. FMs são normalmente seguidos sob o microscópio de fluorescência em condições de estimulação diferente. No entanto, fotoconversão de corantes FM combinado com microscopia eletrônica permite a visualização de distintas piscinas das vesículas sinápticas, entre outros componentes ultra-estrutura, em boutons sináptica.

Abstract

A fusão das vesículas sinápticas com a membrana plasmática (exocitose) é uma etapa necessária na liberação de neurotransmissores e comunicação neuronal. As vesículas são então recuperados da membrana plasmática (endocitose) e agrupados com o grupo geral de vesículas dentro do terminal nervoso, até que se submetem a um exo-e novo ciclo de endocitose (reciclagem das vesículas). Esses processos têm sido estudados usando uma variedade de técnicas como microscopia eletrônica, gravações de eletrofisiologia, amperometria e medições de capacitância. Importante, durante as últimas duas décadas uma série de marcadores fluorescente etiquetado surgiram, permitindo que técnicas ópticas para acompanhar vesículas na dinâmica a sua reciclagem. Um dos marcadores mais comumente utilizado é o styryl ou FM corante 1; estruturalmente, todos os corantes FM conter uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectados através de um anel aromático e um ou mais duplas ligações (Figura 1B). Uma experiência clássica corante FM para rotular um conjunto de vesículas consiste em banhar a preparação (Fig. 1Ai) com o corante durante a estimulação do nervo (eletricamente ou com alto K +). Isto induz a reciclagem vesícula eo carregamento posterior do corante em vesículas recentemente endocytosed (Fig. 1A i-iii). Depois de carregar as vesículas com corante, uma segunda rodada de estímulo em um banho de tintura livre provocaria a liberação FM através de exocitose (Figura 1A iv-v), processo que pode ser seguido através do monitoramento da diminuição da intensidade de fluorescência (descoloração).

Embora as tinturas FM têm contribuído grandemente para o campo da reciclagem de vesícula, não é possível determinar a localização exata ou morfologia das vesículas individuais por meio de microscopia de fluorescência convencional. Por essa razão, vamos explicar aqui como FM corantes também podem ser usados ​​como marcadores endocítica meio de microscopia eletrônica, através fotoconversão. A técnica fotoconversão explora a propriedade de corantes fluorescentes para gerar espécies reativas de oxigênio sob iluminação intensa. Preparações fluorescente etiquetado estão submersos em uma solução contendo diaminobenzidina (DAB) e iluminado. Espécies reativas geradas pelo moléculas de corante oxidar o DAB, que forma um precipitado estável e insolúveis que tem uma aparência escura e pode ser facilmente distinguido em microscopia eletrônica 2,3. Como DAB é apenas oxidado nas imediações de moléculas fluorescentes (como as espécies reativas de oxigênio são de curta duração), a técnica garante que as estruturas só fluorescente etiquetado estão indo para conter o precipitado elétron-denso. A técnica permite, assim, o estudo da localização exata e morfologia ativamente reciclagem organelas.

Protocol

1) Elaboração de Drosophila melanogaster junção neuronal muscular (MNJ) Prepare padrão Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM de sacarose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. Dissecar a preparação em solução salina (1,1). As larvas Drosophila é pined dorsal lateral-up em um prato Sylgard; o lado dorsal é seccionado longitudinal, e os órgãos internos são removidos. A preparação é então esticada e pined. Vários músculos…

Discussion

A poucos passos críticos devem ser levados em conta:

  • A incubação DAB deve ser realizada somente após a lavagem completa e extinção dos preparativos. Caso contrário, o glutaraldeído não reagiu irá interagir com DAB e causar a sua precipitação (tipicamente na forma de cristais de plano, que não são elétron denso). Preparações em que essa precipitação ocorre abundantemente raramente são utilizáveis ​​para microscopia eletrônica.
  • Vezes a iluminação deve ser otimizada, por m…

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
FM 1-43   Invitrogen F10317  
Epon resin   Plano R1030  
di-aminobenzidine hydrochloride   Sigma D5905  
50% Glutaraldehyde   AppliChem A3166 EM grade
Sylgard   Dow Corning 104186298  
Axioskop 2 FS plus   Zeiss    
Objective 20x 0.5 NA   Olympus   Dry objective
100W Hg Lamp   Zeiss    
Lamp housing with back mirror   Zeiss 1007-980  
MRm camera   Zeiss 0445-554 Image acquisition
Ex. Filter (HQ 470/40)   AHF F49-671  
Dichroic (495 DCLP)   AHF F33-100  
Em. Filter (HQ 500 LP)   AHF F42-018  
EM   Zeiss    
Proscan CCD HSS   Proscan Electronic Sys.   1024 x 1024

References

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Cite This Article
Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J. Vis. Exp. (36), e1790, doi:10.3791/1790 (2010).

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