Etudier Piscines vésicules synaptiques utilisant des colorants styryle photoconversion
Summary
Colorants FM ont été d'une aide précieuse dans la compréhension de la dynamique des synapses. FMS sont normalement suivies sous le microscope à fluorescence dans des conditions de stimulation différents. Toutefois, photoconversion de colorants FM combinée avec la microscopie électronique permet la visualisation des différents bassins des vésicules synaptiques, parmi les composants ultrastructure d'autres, en boutons synaptiques.
Abstract
La fusion des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique (exocytose) est une étape nécessaire dans la libération de neurotransmetteurs et de la communication neuronale. Les vésicules sont ensuite extraites de la membrane plasmique (endocytose) et regroupés avec la catégorie générale des vésicules au sein de la terminaison nerveuse, jusqu'à ce qu'ils subissent une nouvelle exo-endocytose et du cycle (recyclage des vésicules). Ces processus ont été étudiés en utilisant une variété de techniques comme la microscopie électronique, les enregistrements électrophysiologiques, l'ampérométrie et des mesures de capacitance. Surtout, au cours des deux dernières décennies un certain nombre de marqueurs marqués par fluorescence émergé, permettant de suivre les techniques optiques vésicules dans leur dynamique de recyclage. L'un des marqueurs les plus couramment utilisés est le styryle ou FM colorant 1; structurellement, tous les colorants contiennent FM une tête hydrophile et une queue lipophile reliés par un anneau aromatique et une ou plusieurs doubles liaisons (Fig. 1B). Une expérience de teinture classique FM pour étiqueter un pool de vésicules consiste à baigner la préparation (fig. 1AI) avec le colorant lors de la stimulation du nerf (électriquement ou avec haute K +). Cela induit le recyclage des vésicules et le chargement ultérieur de la teinture dans des vésicules récemment endocytose (figure 1A I-III). Après le chargement des vésicules avec un colorant, un second tour de la stimulation dans un bain de teinture sans se déclencher la libération FM par exocytose (Fig. 1A IV-V), processus qui peut être suivie par une surveillance de la diminution d'intensité de fluorescence (décoloration).
Bien que les colorants FM ont grandement contribué au domaine de recyclage des vésicules, il n'est pas possible de déterminer la localisation exacte ou la morphologie des vésicules individuels en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Pour cette raison, nous expliquons ici comment FM colorants peuvent également être utilisés comme marqueurs de l'endocytose utilisant la microscopie électronique, à travers photoconversion. La technique exploite la propriété photoconversion de colorants fluorescents pour générer des espèces réactives de l'oxygène sous un éclairage intense. Les préparatifs marqués par fluorescence sont immergés dans une solution contenant diaminobenzidine (DAB) et illuminé. Espèces réactives générées par les molécules de colorant oxyder le DAB, qui forme une société stable, précipité insoluble qui a un aspect sombre et peuvent être facilement distingués en microscopie électronique 2,3. Comme DAB n'est oxydé dans le voisinage immédiat de molécules fluorescentes (comme les espèces réactives de l'oxygène sont de courte durée), la technique garantit que les structures ne sont marqués par fluorescence va contenir le précipité denses aux électrons. La technique permet donc l'étude de l'emplacement exact et la morphologie des activement le recyclage des organelles.
Protocol
Discussion
A quelques critiques devraient être prises en compte:
- L'incubation DAB doit être effectuée uniquement après un lavage soigneux et trempe des préparatifs. Sinon, le glutaraldéhyde n'ayant pas réagi va interagir avec le DAB et provoquer sa précipitation (généralement sous la forme de cristaux plats, qui ne sont pas denses aux électrons). Les préparatifs où cette précipitation a lieu en abondance sont rarement exploitables pour la microscopie électronique.
- Reprises éclairage d…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
