スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強
Summary
FM色素は、シナプスのダイナミクスの理解に非常に貴重な助けとなった。 FMSは、通常、異なる刺激条件の中に蛍光顕微鏡下で続いている。しかし、電子顕微鏡と組み合わせてFM色素の光変換は、シナプスboutonsで、他の超微細構造のコンポーネント間で、明確なシナプス小胞プールの可視化が可能になります。
Abstract
形質膜（エキソサイトーシス）とシナプス小胞の融合は、神経伝達物質の放出と神経細胞のコミュニケーションに必要なステップです。彼らは新しいエキソおよびエンドサイトーシスのサイクル（小胞のリサイクル）を受けるまで、小胞はその後、形質膜（エンドサイトーシス）から取得し、神経終末内の小胞の一般的なプールと一緒にグループ化されます。これらのプロセスは、電子顕微鏡、電気生理学的記録、アンペロメトリーとキャパシタンスの測定など、さまざまな手法を用いて研究されている。重要なのは、最後の二十年の間に蛍光標識したマーカーの数は、光学技術は、そのリサイクルのダイナミクスに小胞を追跡できるように、浮上した。最も一般的に使用されるマーカーの一つは、スチリルまたはFM色素1であり、構造的に、すべてのFM色素は親水性の頭部と芳香環と1つまたは複数の二重結合（図1B）を介して接続親油性尾が含まれています。小胞のプールをラベル付けするために古典的なFM色素の実験は、神経の刺激（電気的または高K +の）中に色素と（図1Ai）準備の入浴で構成されています。これは最近、エンドサイトーシス小胞（図1A I – III）に小胞のリサイクルと染料のその後のロードを誘発する。染料、色素フリーバスの刺激の第二ラウンドで小胞をロードした後にエキソサイトーシスを介してFMのリリース（図1A IV – V）、蛍光強度の減少（脱色）を監視し続けることができますプロセスの引き金となるでしょう。
FM色素が小胞のリサイクルの分野に大きく貢献しているが、それは従来の蛍光顕微鏡を使用して、個々の小胞の正確な局在や形態を決定することはできません。また、光変換を介して、電子顕微鏡を用いてエンドサイトーシスのマーカーとして使用する方法をFM色素そのため、我々はここで説明する。光電変換技術は、強烈な照明下での活性酸素種を生成する蛍光色素のプロパティを利用している。蛍光標識された調製物は、ジアミノベンジジン（DAB）を含む溶液に浸漬し、点灯されています。色素分子によって生成される反応種は暗い外観を持っているし、簡単に電子顕微鏡2,3で区別することができる安定した、不溶性の沈殿物を形成するDABを、酸化する。 DABにのみ蛍光分子（活性酸素種は短命であるため）のすぐ近くに酸化されるように、テクニックだけ蛍光標識構造は電子密度の高い沈殿物を含むとしていることを保証します。テクニックは、このように積極的に細胞内小器官のリサイクルの正確な位置と形態の研究をすることができます。
Protocol
Discussion
いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。
- DABのインキュベーションは、準備の徹底した洗浄と急冷後に行ってください。そうでなければ非反応グルタルアルデヒドは、DABと相互作用し、（通常は高密度電子ではないフラットな結晶の形で）その降水量が発生します。この降水量が豊富に行われる準備は、電子顕微鏡のためまれに使用できます。
- 照明時間は、異?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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