El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo
Summary
Colorantes FM han sido de inestimable ayuda en la comprensión de la dinámica sináptica. FM son normalmente seguidos bajo el microscopio de fluorescencia en condiciones de estimulación diferente. Sin embargo, fotoconversión de tintes FM combinada con el microscopio electrónico permite la visualización de los distintos grupos de vesículas sinápticas, entre los componentes de la ultraestructura otra parte, en botones sinápticos.
Abstract
La fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática (exocitosis) es un paso necesario en la liberación de neurotransmisores y la comunicación neuronal. Las vesículas se recuperan de la membrana plasmática (endocitosis) y se agruparon junto con el grupo general de vesículas dentro de la terminal nerviosa, hasta que se someten a un nuevo exo-y el ciclo de endocitosis (reciclaje de vesículas). Estos procesos han sido estudiados usando una variedad de técnicas como la microscopía electrónica, las grabaciones de electrofisiología, amperometría y medidas de capacitancia. Es importante destacar que, durante las últimas dos décadas una serie de marcadores marcados con fluorescencia surgido, lo que las técnicas ópticas para rastrear las vesículas en la dinámica de su reciclaje. Uno de los marcadores más comúnmente utilizado es el estirilo o FM tinte 1; estructuralmente, todos los tintes FM contiene una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático y uno o más dobles enlaces (Fig. 1B). Un experimento clásico tinte FM para etiquetar un grupo de vesículas consiste en bañar la preparación (Fig. 1AI) con el colorante durante la estimulación del nervio (eléctrica o con alto contenido de K +). Esto induce reciclaje de vesículas y la posterior carga del medio de contraste en las vesículas recientemente endocitosis (Fig. 1A I-III). Después de cargar las vesículas con el tinte, una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte sin que desencadenan la liberación de FM a través de exocitosis (Fig. 1A IV-V), proceso que puede ser seguido por el control de la disminución de la intensidad de fluorescencia (decoloración).
A pesar de los tintes FM han contribuido en gran medida en el campo de reciclaje de vesículas, que no es posible determinar la localización exacta o la morfología de las vesículas individuales mediante microscopía de fluorescencia convencional. Por esa razón, se explica aquí cómo colorantes FM también se puede utilizar como marcadores endocítica mediante microscopía electrónica, a través de fotoconversión. La técnica fotoconversión explota la propiedad de los tintes fluorescentes para generar especies reactivas de oxígeno en condiciones de iluminación intensa. Preparativos marcados con fluorescencia se sumergen en una solución que contiene diaminobencidina (DAB) y se ilumina. Las especies reactivas generadas por las moléculas de colorante oxidar el DAB, que forma un precipitado estable, insoluble que tiene un aspecto oscuro y se pueden distinguir fácilmente en el microscopio electrónico de 2,3. Como DAB sólo es oxidado en las inmediaciones de las moléculas fluorescentes (como las especies reactivas de oxígeno son de corta duración), la técnica se asegura de que las estructuras sólo la etiqueta fluorescente va a contener la precipitación de electrones de alta densidad. La técnica permite así que el estudio de la ubicación exacta y la morfología de la forma activa de reciclaje orgánulos.
Protocol
Discussion
A pocos pasos críticos deben ser tomados en cuenta:
- La incubación DAB debe realizarse sólo después de un lavado profundo y enfriamiento de los preparativos. De lo contrario el glutaraldehído no reaccionado va a interactuar con DAB y provocar su precipitación (por lo general en forma de cristales planos, que no son densos a los electrones). Preparados en los casos esta precipitación se lleva a cabo en abundancia rara vez son útiles para microscopía electrónica.
- Veces la iluminación debe …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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