Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей
Summary
FM красители имели неоценимую помощь в понимании синаптических динамики. Главы МИД, как правило, следуют под флуоресцентного микроскопа при различных условиях стимуляции. Тем не менее, фотопревращения FM красителей в сочетании с электронной микроскопии позволяет визуализации различных синаптических пузырьков бассейнов, среди других компонентов ультраструктура, в синаптических boutons.
Abstract
Слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной (экзоцитоз) является необходимым шагом в выпуске нейромедиатора и нейронные связи. Пузырьки затем выбираться из плазматической мембраны (эндоцитоз) и группируются вместе с общим бассейном пузырьков внутри нервного окончания, пока они не проходят новые экзо-и эндоцитоза цикла (пузырька утилизации). Эти процессы были изучены с использованием различных методов, таких как электронная микроскопия, электрофизиологии записей, amperometry и измерения емкости. Важно отметить, что в течение последних двух десятилетий число флуоресцентно меченых маркеров появились, позволяя оптические методы для отслеживания пузырьков в их динамике утилизации. Один из наиболее часто используемых маркеров стирил или FM красителя 1; структурно, все FM красители содержат гидрофильные головы и липофильный хвост подключен через кольцо ароматических и одну или несколько двойных связей (рис. 1В). Классическая FM эксперимент красителя для маркировки пул везикул состоит в ванной подготовки (рис. 1Ai) с красителем при стимуляции нерва (электрически или с высоким K +). Это вызывает переработки пузырек и последующие загрузки красителя в недавно эндоцитарных пузырьки (рис. 1А I-III). После загрузки пузырьки с красителем, второй раунд стимуляции в краситель без ванны вызовет FM-релиз через экзоцитоза (рис. 1А IV-V), процесс, который может сопровождаться мониторинга флуоресценции снижение интенсивности (destaining).
Хотя FM красителей внесли большой вклад в области переработки пузырьков, это не представляется возможным определить точную локализацию и морфологии отдельных пузырьков с помощью обычной флуоресцентной микроскопии. По этой причине мы объясняем здесь, как FM-красители могут также быть использованы в качестве маркеров endocytic с помощью электронной микроскопии, через фотопреобразования. Фотопреобразования техника использует свойства флуоресцентных красителей для генерации активных форм кислорода при интенсивном освещении. Флуоресцентно меченных препаратов погружен в раствор, содержащий диаминобензидина (DAB) и освещены. Активные формы порожденные молекулы красителя окисляется DAB, который образует стабильный, нерастворимый осадок, который имеет темно внешнему виду и можно легко отличить в электронной микроскопии 2,3. Как DAB только окисляется в непосредственной близости от флуоресцентных молекул (как активных форм кислорода недолговечны), техника гарантирует, что только флуоресцентно меченных структуры будет содержать электронно-плотного осадка. Технику таким образом, позволяет изучение точное местоположение и морфология активно переработки органелл.
Protocol
Discussion
Несколько важных шагов должно быть принято во внимание:
- Инкубационный DAB следует проводить только после тщательного промывания и тушения препаратов. В противном случае, не реагировал глутаральдегида будут взаимодействовать с DAB и вызывают ее осадков (как правило, в виде плоских…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
