Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe
Summary
FM Farbstoffe haben eine unschätzbare Hilfe für das Verständnis der synaptischen Dynamik worden. FMs sind in der Regel unter dem Fluoreszenzmikroskop bei unterschiedlichen Bedingungen Stimulation gefolgt. Allerdings ermöglicht Photokonversion FM Farbstoffe mit Elektronenmikroskopie kombiniert die Visualisierung verschiedener synaptischer Vesikel-Pools, unter anderem Ultrastruktur Komponenten in synaptischen boutons.
Abstract
Die Fusion von synaptischen Vesikeln mit der Plasmamembran (Exozytose) ist ein erforderlicher Schritt in die Freisetzung von Neurotransmittern und die neuronale Kommunikation. Die Vesikel werden dann von der Plasmamembran (Endozytose) abgerufen und zusammen mit dem allgemeinen Pool von Vesikeln innerhalb der Nervenendigung gruppiert, bis sie eine neue Exo-und Endozytose-Zyklus (Vesikel Recycling) zu unterziehen. Diese Prozesse wurden untersucht mit einer Vielzahl von Techniken wie der Elektronenmikroskopie, Elektrophysiologie Aufnahmen, Amperometrie und Kapazitätsmessungen. Wichtig ist, dass in den letzten zwei Jahrzehnten eine Reihe von fluoreszenzmarkierten Marker entwickelt, so dass optische Techniken, um Vesikel in deren Recycling Dynamik zu verfolgen. Einer der am häufigsten verwendeten Marker ist der Styryl-oder FM-Farbstoff 1, strukturell, enthalten alle FM Farbstoffe einem hydrophilen Kopf und einen lipophilen Schwanz durch einen aromatischen Ring und einen oder mehrere Doppelbindungen (Abb. 1B) verbunden. Ein klassischer FM Farbstoff experimentieren, um einen Pool von Vesikeln Etikett besteht in Baden die Vorbereitung (Abb. 1Ai) mit dem Farbstoff während der Stimulation des Nervs (elektrisch oder mit hoher K +). Dies induziert Vesikel-Recycling und die anschließende Beladung des Farbstoffs in jüngster Zeit durch Endozytose Vesikel (Abb. 1A i-iii). Nach dem Laden der Vesikel mit Farbstoff, eine zweite Runde der Stimulation in einem Farbstoff-freie Bad löst die FM durch Exozytose (Abb. 1A iv-v), Prozess, der durch die Überwachung der Fluoreszenz-Intensität zu verringern (Entfärbung) verfolgt werden kann.
Obwohl FM Farbstoffe stark auf den Bereich der Vesikel-Recycling beigetragen haben, ist es nicht möglich, die genaue Lokalisation und Morphologie der einzelnen Vesikel mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie bestimmen. Aus diesem Grund erklären wir hier, wie FM-Farbstoffe können auch als endocytischen Marker mit Hilfe der Elektronenmikroskopie verwendet werden, durch Photokonversion. Die Photokonversion Technik nutzt die Eigenschaft von Fluoreszenzfarbstoffen an reaktiven Sauerstoffspezies unter intensiver Beleuchtung erzeugen. Fluoreszenzmarkierten Präparate werden in einer Lösung mit Diaminobenzidin (DAB) getaucht und beleuchtet. Reaktive Spezies durch die Farbstoffmoleküle generiert oxidieren die DAB, die eine stabile, unlösliche Niederschlag, ein dunkles Aussehen hat und kann problemlos in der Elektronenmikroskopie 2,3 unterschieden werden Formen. Da DAB ist nur in der unmittelbaren Nähe von fluoreszierenden Molekülen (wie die reaktive Sauerstoff-Spezies kurzlebig sind) oxidiert, sorgt für die Technik, die nur fluoreszenzmarkierten Strukturen werden den Elektronen-dichten Niederschlag enthalten. Die Technik ermöglicht so die Studie über die genaue Lage und Morphologie der aktiv Recycling Organellen.
Protocol
Discussion
Ein paar kritische Schritte sollten berücksichtigt werden:
- Die DAB Inkubation sollten nur nach gründlichem Waschen und Abschrecken der Vorbereitungen durchgeführt werden. Andernfalls wird der nicht umgesetzte Glutaraldehyd wird mit DAB zu interagieren und zu seinen Niederschlag (in der Regel in Form von flachen Kristallen, die nicht Elektron dichten). Die Vorbereitungen, wo dieser Niederschlag findet reichlich sind selten brauchbar für die Elektronenmikroskopie.
- Illumination Zeiten sollten opt…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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