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Biology

CRISPR/Cas9 सिस्टम का उपयोग करके सेंट्रोमियर-एसोसिएटेड प्रोटीन-E CENP-E-/- नॉकआउट सेल लाइन्स का उत्पादन

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65476
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

यह लेख CRISPR/Cas9 प्रणाली और तीन फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीतियों का उपयोग करके सेंट्रोमियर से जुड़े प्रोटीन-ई (CENP-E) नॉकआउट कोशिकाओं के निर्माण की रिपोर्ट करता है। हमने CENP-E अवरोधकों की विशिष्टता और विषाक्तता को मान्य करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए CENP-E नॉकआउट सेल लाइन का उपयोग किया है, जो दवा विकास और जैविक अनुसंधान के लिए उपयोगी है।

Abstract

CRISPR (क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट)/Cas9 सिस्टम विभिन्न जीवों में सटीक और कुशल जीन एडिटिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। सेंट्रोमियर से जुड़े प्रोटीन-ई (सीएनपी-ई) एक प्लस-एंड-डायरेक्टेड किनेसिन है जो कीनेटोकोर-माइक्रोट्यूब्यूल कैप्चर, क्रोमोसोम अलाइनमेंट और स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट के लिए आवश्यक है। हालांकि सीईएनपी-ई प्रोटीन के सेलुलर कार्यों का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, लेकिन पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके सीईएनपी-ई प्रोटीन के प्रत्यक्ष कार्यों का अध्ययन करना मुश्किल हो गया है क्योंकि सीईएनपी-ई पृथक्करण आमतौर पर स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट सक्रियण, सेल चक्र गिरफ्तारी और कोशिका मृत्यु की ओर जाता है। इस अध्ययन में, हमने मानव HeLa कोशिकाओं में CENP-E जीन को पूरी तरह से खटखटाया है और CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके CENP-E-/- HeLa कोशिकाओं को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया है।

सेल कॉलोनी स्क्रीनिंग, गुणसूत्र संरेखण फेनोटाइप, और सीईएनपी-ई प्रोटीन की फ्लोरोसेंट तीव्रता सहित तीन अनुकूलित फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीतियों की स्थापना की गई, जो प्रभावी रूप से स्क्रीनिंग दक्षता और सीईएनपी-ई नॉकआउट कोशिकाओं की प्रयोगात्मक सफलता दर में सुधार करती है। महत्वपूर्ण रूप से, CENP-E विलोपन के परिणामस्वरूप गुणसूत्र मिसलिग्न्मेंट, BUB1 माइटोटिक चेकपॉइंट सेरीन/थ्रेओनीन किनेज B (BubR1) प्रोटीन का असामान्य स्थान और माइटोटिक दोष होते हैं। इसके अलावा, हमने CENP-E- विशिष्ट अवरोधकों के लिए एक पहचान विधि विकसित करने के लिए CENP-E नॉकआउट HeLa सेल मॉडल का उपयोग किया है।

इस अध्ययन में, सीईएनपी-ई अवरोधकों की विशिष्टता और विषाक्तता को मान्य करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण स्थापित किया गया है। इसके अलावा, यह पत्र सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली का उपयोग करके सीईएनपी-ई जीन संपादन के प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो कोशिका विभाजन में सीईएनपी-ई के तंत्र की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। इसके अलावा, सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइन सीईएनपी-ई अवरोधकों की खोज और सत्यापन में योगदान देगी, जिसमें एंटीट्यूमर दवा विकास, सेल जीव विज्ञान में कोशिका विभाजन तंत्र के अध्ययन और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं।

Introduction

इंजीनियर जीनोम संपादन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और जीवों में जीन के लक्षित संशोधनों की मध्यस्थता करता है। यूकेरियोट्स में, साइट-विशिष्ट उत्परिवर्तन को अनुक्रम-विशिष्ट न्यूक्लियस के अनुप्रयोगों द्वारा पेश किया जा सकता है जो लक्ष्य डीएनए1 के समरूप पुनर्संयोजन को उत्तेजित करते हैं। हाल के वर्षों में, जस्ता उंगली nucleases (ZFNs) 2,3, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रभावक nucleases (TALENs) 4,5, और होमिंग meganucleases 6,7 सहित कई जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों, विशिष्ट साइटों पर जीनोम क्लीव करने के लिए इंजीनियर किया गया है, लेकिन इन दृष्टिकोणों जटिल प्रोटीन इंजीनियरिंग और निरर्थक प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की आवश्यकता है. अध्ययनों से पता चला है कि प्रकार द्वितीय प्रोकैरियोटिक क्लस्टर नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (सीआरआईएसपीआर)/कैस प्रणाली एक कुशल जीन संपादन तकनीक है, जो विशेष रूप से कोशिकाओं और प्रजातियों 8,9,10,11की एक विस्तृत विविधता में आरएनए-निर्देशित, साइट विशिष्ट डीएनए दरार मध्यस्थता है. Cas9 जीन नॉकआउट तकनीक ने बुनियादी जीव विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा12 के क्षेत्र में क्रांति ला दी है।

बैक्टीरिया और अधिकांश आर्किया ने एक आरएनए-आधारित अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित की है जो वायरस और प्लास्मिड13 को पहचानने और नष्ट करने के लिए सीआरआईएसपीआर और कैस प्रोटीन का उपयोग करती है। स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस Cas9 (SpCas9) एंडोन्यूक्लिएज में RuvC जैसा हॉलिडे जंक्शन रिसॉल्वेज़ (RuvC) और हिज-असन-हिज़ (HNH) डोमेन होता है, जो सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरएनए) युक्त सिंथेटिक सिंगल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) प्रदान करके अनुक्रम-विशिष्ट, डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) को कुशलतापूर्वक मध्यस्थ कर सकता है और ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआरएनए (tracrRNA)14,15,16. डीएसबी को इंडल-फॉर्मिंग गैर-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) या होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग के माध्यम से मरम्मत की जा सकती है, जो स्तनधारी कोशिकाओं 1,8 में सम्मिलन, विलोपन, या निशान-कम एकल न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन सहित कई उत्परिवर्तन का परिचय देता है। त्रुटि-प्रवण एनएचईजे और उच्च-निष्ठा एचडीआर मार्ग दोनों का उपयोग सम्मिलन या विलोपन के माध्यम से जीन नॉकआउट की मध्यस्थता के लिए किया जा सकता है, जो फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन और समय से पहले कोडन10 को रोक सकता है।

कोशिका विभाजन 17,18,19के दौरान कीनेटोकोर-सूक्ष्मनलिका लगाव और गुणसूत्र संरेखण के लिए किनेसिन-7 सीईएनपी-ई की आवश्यकता होती है। एंटीबॉडी माइक्रोइंजेक्शन20,21, एसआईआरएनए की कमी22,23, रासायनिक निषेध 24,25,26, और सीईएनपी-ई के आनुवंशिक विलोपन 27,28,29 गुणसूत्र मिसलिग्न्मेंट की ओर जाता है, स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट और माइटोटिक दोषों की सक्रियता, जिसके परिणामस्वरूप एन्यूप्लोइडी और क्रोमोसोमल अस्थिरता 19,30 होती है. चूहों में, सीईएनपी-ई विलोपन असामान्य विकास और विकास 27,29,31 के बहुत प्रारंभिक चरणों में भ्रूण घातकता में परिणाम. CENP-E के आनुवंशिक विलोपन आमतौर पर गुणसूत्र misalignment और कोशिका मृत्यु 26,27,29, कार्यों और CENP-ई प्रोटीन के तंत्र का अध्ययन करने में एक बाधा है की ओर जाता है.

एक हालिया अध्ययन ने एक ऑक्सिन-इंड्यूसिबल सीआरआईएसपीआर/कैस 9 जीन-संपादन विधि32 का उपयोग करके एक सशर्त सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइन स्थापित की है, जो अपेक्षाकृत कम समय33 में सीईएनपी-ई प्रोटीन के तेजी से क्षरण को सक्षम बनाता है। हालांकि, आज तक, स्थिर सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइनें स्थापित नहीं की गई हैं, जो सीईएनपी-ई जीव विज्ञान में एक अनसुलझी तकनीकी चुनौती है। आनुवंशिक मजबूती34, आनुवंशिक मुआवजा प्रतिक्रियाओं 35,36,37, और जटिल इंट्रासेल्युलर वातावरण को ध्यान में रखते हुए, सीईएनपी-ई के पूर्ण विलोपन के प्रत्यक्ष परिणाम जटिल और अप्रत्याशित हो सकते हैं, गुणसूत्र संरेखण, धुरी विधानसभा चौकी, और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों के तंत्र की जांच के लिए सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइनों को स्थापित करना महत्वपूर्ण है।

कैंसर के उपचार के लिए CENP-E अवरोधकों की खोज और अनुप्रयोग महत्वपूर्ण हैं। आज तक, सात प्रकार के CENP-E अवरोधक पाए गए हैं और संश्लेषित किए गए हैं, जिनमें GSK923295 और इसके डेरिवेटिव24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a] पाइरीडिन मचान डेरिवेटिव40,41, यौगिक-A42,43, सिंटेलिन 44,45, UA6278446, और बेंजो [d] pyrrolo[2,1-b] थियाज़ोल डेरिवेटिव47 शामिल हैं. इन अवरोधकों में, GSK923295 एक एलोस्टेरिक और कुशल CENP-E अवरोधक है जो CENP-E के मोटर डोमेन से बांधता है और CENP-E सूक्ष्मनलिका-उत्तेजित ATPase गतिविधि को 3.2 ± 0.2 nM24,25 के Ki के साथ रोकता है। हालांकि, सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं पर GSK923295 के निरोधात्मक प्रभावों की तुलना में, नैदानिक कैंसर रोगियों में GSK923295 के चिकित्सीय प्रभाव आदर्श48,49 नहीं हैं, जिसने सीईएनपी-ई के लिए GSK923295 की विशिष्टता के बारे में भी चिंता जताई। इसके अलावा, CENP-E प्रोटीन पर अन्य CENP-E अवरोधकों की विशिष्टता और दुष्प्रभाव कैंसर अनुसंधान में महत्वपूर्ण मुद्दे हैं।

इस अध्ययन में, हमने CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके HeLa कोशिकाओं में CENP-E जीन को पूरी तरह से खटखटाया है। सीईएनपी-ई जीन संपादन की स्क्रीनिंग दक्षता और सफलता दर में सुधार के लिए सेल कॉलोनी स्क्रीनिंग, गुणसूत्र संरेखण फेनोटाइप, और सीईएनपी-ई प्रोटीन की फ्लोरोसेंट तीव्रता सहित तीन अनुकूलित फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीतियों की स्थापना की गई है। इसके अलावा, CENP-E नॉकआउट सेल लाइनों CENP-E के लिए उम्मीदवार यौगिकों की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

1. CRISPR/Cas9 जीन नॉकआउट वैक्टर का निर्माण

  1. मानव CENP-E जीन पर लक्ष्य जीनोमिक डीएनए अनुक्रम का चयन करें (GenBank परिग्रहण संख्या। NM_001286734.2) और एक ऑनलाइन सीआरआईएसपीआर डिजाइन उपकरण (http://crispor.tefor.net/) का उपयोग करके एसजीआरएनए को डिजाइन करें।
  2. एक एकल जीनोमिक अनुक्रम इनपुट करें, "होमो सेपियन्स-मानव-यूसीएससी दिसंबर 2013 (एचजी 38 विश्लेषण सेट) + एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी): डीबीएसएनपी 148" के जीनोम का चयन करें, और प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति "20 बीपी-एनजीजी-एसपीसीएएस 9" का चयन करें। विशिष्टता स्कोर50, अनुमानित दक्षता10, और न्यूनतम ऑफ-लक्ष्य के अनुसार, sgRNA-1, 5'-CGGCCCACTCGCAGCAGA-3' और sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGGGCTC-3' सहित दो गाइड अनुक्रम चुनें।
  3. एकल-फंसे डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एसएसओडीएन) को ऑर्डर और संश्लेषित करें। ddH2O में ssODN को 100 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। फॉस्फोराइलेट और एसजीआरएनए ओलिगोस को एनील करने के लिए, फॉरवर्ड ओलिगो के 1 माइक्रोन, रिवर्स ओलिगो के 1 माइक्रोन, टी 4 पॉली न्यूक्लियोटाइड किनेज के 0.5 माइक्रोन, टी 4 पॉली न्यूक्लियोटाइड किनेज बफर के 1 माइक्रोन, और आरनेस मुक्त पानी के 6.5 माइक्रोन को पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूब में जोड़ें, और ट्यूब को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें; फिर, 5 डिग्री सेल्सियस मिनट -1 पर 25 डिग्री सेल्सियस तक रैंप।
  4. बीबीएसEquation 1 प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके pX458 प्लाज्मिड को पचाएं। pX458 प्लाज्मिड का 1 μg, 10x बफर G का 2 μL, BbsEquation 1 का 1 μL जोड़ें, और 1.5 mL अपकेंद्रित्र ट्यूब में RNase-मुक्त ddH2O से 20 μL जोड़ें। ट्यूब को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार स्तंभ डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर रैखिक प्लाज्मिड शुद्ध.
  5. sgRNA ओलिगोस को pX458 प्लाज्मिड (pSpCas9(BB)-2A-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) प्लाज्मिड, Addgene ID. 48138) में लिगेट करें। annealed oligonucleotides के 1 μL, रैखिक प्लाज्मिड के 25 एनजी, 10x T4 डीएनए बंधाव बफर के 1 μL, T4 डीएनए ligase (350 U/μL) के 0.5 μL जोड़ें और एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ddH2O के साथ 10 μL तक बनाते हैं। 2 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर बंधाव समाधान सेते हैं।
  6. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सक्षम DH5α कोशिकाओं के साथ निर्मित प्लाज्मिड के 10 माइक्रोन को इनक्यूबेट करें, 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी का झटका, और तुरंत उन्हें 5 मिन के लिए बर्फ पर रखें। लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें और एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) युक्त एलबी प्लेट पर कोशिकाओं को बीज दें। इसे 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और प्रतिरोधी क्लोन को स्क्रीन करें।
  7. एक निष्फल विंदुक टिप के साथ 5-10 एकल कालोनियों का चयन करें और उन्हें एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ एलबी माध्यम की 1 एमएल संस्कृति में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें और इसे 12-16 घंटे के लिए 180 आरपीएम पर हिलाएं।
  8. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें। U6-Fwd प्राइमर 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' का उपयोग करके U6 प्रमोटर साइट से सेंगर अनुक्रमण द्वारा प्रत्येक कॉलोनी के प्लास्मिड डीएनए को मान्य करें।
  9. निकालें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एंडो मुक्त प्लाज्मिड डीएनए किट का उपयोग प्लास्मिड शुद्ध.

2. CENP-E नॉकआउट HeLa कोशिकाओं का अभिकर्मक, अलगाव और स्क्रीनिंग

  1. Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में संस्कृति HeLa कोशिकाओं 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
  2. 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्रिप्सिन/एथिलीन डायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, धीरे से पाइपिंग करके कोशिकाओं को अलग करें, और फिर, सेल मार्ग के लिए 1: 4 के कमजोर पड़ने के अनुपात में नई प्लेटों में कोशिकाओं को बीज दें।
  3. एक 12 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं बीज, और अभिकर्मक से पहले 60-70% संगम करने के लिए संस्कृति. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार संदर्भित अभिकर्मकों का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में pX458-एसजीआरएनए प्लास्मिड को ट्रांसफ़ेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    1. धीरे ट्यूब ए में मान्य pX458-एसजीआरएनए प्लास्मिड के 1 माइक्रोग्राम और कम सीरम माध्यम के 50 माइक्रोन मिलाएं। फिर, धीरे अभिकर्मक अभिकर्मक के 2 माइक्रोन और ट्यूब बी में कम सीरम माध्यम के 50 माइक्रोन मिश्रण ट्यूब ए और बी अलग से 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते ट्यूबों.
    2. ट्यूब ए और ट्यूब बी दोनों को धीरे से मिलाएं और 5 मिन के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। मिश्रण को 12-अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ें, 6 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और मध्यम को एक ताजा डीएमईएम माध्यम से बदलें।
  4. अभिकर्मक दक्षता के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 24 घंटे या 48 घंटे के बाद हेला कोशिकाओं की जांच करें। 48 घंटे के लिए अभिकर्मक के बाद, 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्रिप्सिन/ईडीटीए का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट हेला कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग कर दें, न्यूबॉयर कक्ष या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, और कोशिकाओं को तीन अलग-अलग 96-अच्छी प्लेटों में प्लेट करें धारावाहिक कमजोर पड़ने के तरीकों10 के अनुसार प्रत्येक ट्रांसफ़ेक्ट आबादी के लिए।
  5. कोशिकाओं को एक आर्द्र इनक्यूबेटर में लौटाएं और फिर उन्हें एक और 1-2 सप्ताह के लिए संस्कृति दें। हर 3 दिनों में एक बार संस्कृति माध्यम बदलें। फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग और सीईएनपी-ई नॉकआउट के सत्यापन के लिए, 5-7 दिनों के लिए 24-अच्छी या 12-अच्छी प्लेटों में कोशिकाओं को अलग और विस्तारित करें।
  6. 10x और 20x उद्देश्य लेंस से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छोटे सेल कॉलोनी व्यास के साथ उत्परिवर्ती कोशिकाओं स्क्रीन.
    नोट: सीईएनपी-ई उत्परिवर्तन आमतौर पर सेल कॉलोनियों में विभाजित कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि का परिणाम है, जो सीईएनपी-ई उत्परिवर्ती कोशिकाओं की स्क्रीनिंग के लिए प्रमुख संकेतकों में से एक हो सकता है।
  7. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार स्तंभ पशु जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर डीएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं हार्वेस्ट. पीसीआर प्रतिक्रियाओं को निम्नानुसार सेट करें: टाक पोलीमरेज़ का 0.25 माइक्रोन, 10x बफर का 5 माइक्रोन (एमजी2+ प्लस), डीएनटीपी मिश्रण का 4 माइक्रोन, डीएनए टेम्पलेट का 500 एनजी, फॉरवर्ड ओलिगो का 1 माइक्रोन, रिवर्स ओलिगो का 1 माइक्रोन, और डीडीएच2ओ से 50 माइक्रोन समायोजित करें। जीन प्रवर्धन के लिए निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम सेटिंग्स का उपयोग करें: 98 डिग्री सेल्सियस, 10 एस; 98 डिग्री सेल्सियस, 10 एस, 55 डिग्री सेल्सियस, 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस, 33 चक्रों के लिए 60 एस; 72 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: लक्ष्य स्थान की क्लोनिंग के लिए विशिष्ट प्राइमर निम्नानुसार सूचीबद्ध हैं: CENP-E लक्ष्य F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E लक्ष्य R1, 5'-AGATCTCCCCTCTCCTCTC-3'; CENP-E लक्ष्य F2, 5'-TGGTAACTGCATTGTGTGTTCTAC-3'; CENP-E लक्ष्य R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'।
  8. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार pMD18-T वेक्टर में लक्ष्य डीएनए को लिगेट करें। क्लोन के चयन के लिए सक्षम DH5α कोशिकाओं और संस्कृति में लिगेटेड प्लास्मिड ट्रांसफ़ेक्ट करें।
  9. CENP-E नॉकआउट के प्रकार निर्धारित करने के लिए सेंगर अनुक्रमण करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्लाज्मिड निष्कर्षण किट का उपयोग प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें। एम 13 आगे और रिवर्स प्राइमरों का उपयोग कर प्रत्येक कॉलोनी के प्लाज्मिड डीएनए के सेंगर अनुक्रमण बाहर ले जाना. M13F प्राइमर, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R प्राइमर, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'।
  10. बीज जंगली प्रकार और CENP-ई उत्परिवर्ती HeLa कोशिकाओं पर 12 मिमी कांच coverslips एक 24 अच्छी तरह से थाली, क्रमशः. पूरा डीएमईएम माध्यम निकालें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड/फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) लगानेवाला समाधान में कोशिकाओं को ठीक करें।
  11. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) समाधान के साथ नाभिक दाग. स्क्रीन और गुणसूत्र संरेखण के फेनोटाइप के आधार पर CENP-E उत्परिवर्ती कोशिकाओं को एक योजना फ्लोर 40x/संख्यात्मक एपर्चर (एनए) 0.75 उद्देश्य से लैस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मान्य करें।
  12. स्क्रीन और CENP-E प्रोटीन के immunofluorescence धुंधला और विश्लेषण (अनुभाग 3 देखें) का उपयोग कर CENP-ई नॉकआउट कोशिकाओं मान्य.

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और उच्च-रिज़ॉल्यूशन कन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड/पीबीएस लगानेवाला समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और 1x पीबीएस में 2 x 5 मिनट के लिए विसर्जित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं स्वस्थ स्थिति में हैं और कोशिकाओं को एकत्र किया जाता है और मेटाफ़ेज़ सेल टुकड़ी से बचने के लिए धीरे से तय किया जाता है।
  2. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.25% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के साथ कोशिकाओं को पारगम्य करें और उन्हें 2 x 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में विसर्जित करें।
  3. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1% बीएसए / पीबीएसटी (पीबीएस में 0.1% ट्वीन 20) के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें। 1% बीएसए/पीबीएसटी के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें और 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें, कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ 3 x 5 मिनट कुल्ला, और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी त्यागें और 3 एक्स 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में कोशिकाओं कुल्ला.
  6. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएपीआई के साथ नाभिक दाग. बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड्स माउंट करें। नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील।
  7. निरीक्षण और एक 63x/एनए 1.40 उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवियों रिकॉर्ड.

4. गुणसूत्र तैयारी और कैरियोटाइप विश्लेषण

  1. संस्कृति जंगली प्रकार और CENP-E-/- HeLa कोशिकाओं को पूर्ण DMEM माध्यम में 24 घंटे के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया जाता है और फिर, 5 घंटे के लिए 300 एनएम कोल्सीसिन के साथ जंगली प्रकार और CENP-E-/- HeLa कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. कोशिकाओं को 3 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्रिप्सिन/ईडीटीए के साथ इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में इकट्ठा करें।
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेटेंट को त्यागें, 0.075 मोल/एल केसीएल समाधान के 1.2 एमएल जोड़ें, और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, उपसर्ग के लिए लगानेवाला समाधान (मेथनॉल: ग्लेशियल एसिटिक एसिड = 3: 1) के 0.2 एमएल जोड़ें, और 1 मिनट के लिए धीरे से मिलाएं।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र, छर्रों को इकट्ठा करें, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लगानेवाला समाधान के 1.5 एमएल जोड़ें, और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, लगानेवाला समाधान के 0.6 एमएल जोड़ें, और एक सेल निलंबन तैयार. बर्फ स्लाइड पर 35-40 सेमी की ऊंचाई से सेल निलंबन की 3-5 बूँदें जोड़ें।
    नोट: 35-40 सेमी पर स्लाइड पर सेल निलंबन जारी करने के लिए ऊंचाई रखें; अन्यथा, गुणसूत्र बहुत अधिक छितरी हुई हो सकती हैं या एक दूसरे से अलग नहीं हो सकती हैं।
  7. एक शराब दीपक के साथ तुरंत स्लाइड सूखी, 7 मिनट के लिए 10% Giemsa धुंधला समाधान के साथ नमूने दाग, 2 मिनट के लिए बहते पानी के साथ स्लाइड कुल्ला, और एक योजना फ्लोर 40x / एनए 0.75 उद्देश्य से सुसज्जित एक प्रकाश खुर्दबीन का उपयोग कर नमूनों का निरीक्षण.

5. सेल कॉलोनी गठन परख

  1. 1,000-2,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से की एक सेल घनत्व पर 6 अच्छी तरह से प्लेटों में सेल निलंबन तैयार करें. धीरे प्लेटों को हिला समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए.
  2. 6-अच्छी प्लेटों को सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 सप्ताह के लिए इनक्यूबेट करें। हर 5 दिनों में एक बार संस्कृति माध्यम बदलें। 10x और 20x उद्देश्य लेंस से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को रिकॉर्ड करें। कालोनियों दिखाई दे रहे हैं जब कोशिकाओं फसल (एक क्लोन के भीतर कोशिकाओं के सैकड़ों).
  3. GSK923295 के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, 24 घंटे के लिए 6-अच्छी प्लेटों में कोशिकाओं को संस्कृति दें, और 10, 25, 50, 100 और 200 एनएम की अंतिम सांद्रता में 2 एमएल GSK923295 जोड़ें।
    नोट: सेल शेडिंग, जो नए क्लोन फार्म और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की स्क्रीनिंग को प्रभावित कर सकते हैं से बचने के लिए क्लोन गठन के प्रारंभिक चरण में संस्कृति पकवान कदम नहीं है.
  4. संस्कृति माध्यम त्यागें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1% पीएफए के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.1% क्रिस्टल बैंगनी धुंधला समाधान के साथ कालोनियों दाग. तीन बार 1x पीबीएस के साथ नमूने कुल्ला. सेल कालोनियों की छवियों को रिकॉर्ड करें और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक कॉलोनी के व्यास की मात्रा निर्धारित करें। सीधी रेखा चयन उपकरण चुनें, विश्लेषण करें पर क्लिक करें, माप चुनें और लंबाई रिकॉर्ड करें।
  5. 5 मिनट के लिए 10% एसिटिक एसिड समाधान के 1 एमएल के साथ कालोनियों कुल्ला. एक 96 अच्छी तरह से थाली में सतह पर तैरनेवाला समाधान के 200 माइक्रोन स्थानांतरण, और एक600 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर अवशोषण मूल्यों को मापा.

6. सेल व्यवहार्यता परख

  1. 24 अच्छी तरह से प्लेटों में कोशिकाओं बीज और संस्कृति 48 घंटे से 80-90% घनत्व के लिए कोशिकाओं कोशिका.
  2. 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्रिप्सिन/ईडीटीए के 100 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. एक विंदुक बंदूक के साथ कोशिकाओं के साथ पीबीएस के 400 माइक्रोन मिलाएं। 96 अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन के 100 माइक्रोन स्थानांतरण.
  4. 317 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के साथ प्रत्येक कुएं में एमटीएस समाधान के 20 माइक्रोन जोड़ें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार धीरे से मिलाएं। एक सीओ2 इनक्यूबेटर में 1-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  5. माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करकेए 490 एनएम के अवशोषण शिखर पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण मूल्यों को रिकॉर्ड करें। सेल मलबे और निरर्थक अवशोषण (सेल व्यवहार्यता = ए490 एनएम- ए630 एनएम) द्वारा योगदान की गई पृष्ठभूमि को घटाने के लिए ए630 एनएम के संदर्भ तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें।

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Representative Results

CENP-E-/- HeLa कोशिकाओं को CRISPR/Cas9 प्रणाली(चित्रा 1)का उपयोग करके सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया था। इस विधि की समयरेखा और महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक कदम चित्रा 1 में दिखाए गए हैं। सबसे पहले, हमने CENP-E-विशिष्ट sgRNAs को डिज़ाइन और संश्लेषित किया, sgRNAs को pX458 प्लास्मिड में annealed और ligated किया, प्लास्मिड को HeLa कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया, और उन्हें 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को अलग कर दिया गया था और धारावाहिक कमजोर पड़ने (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से प्लेट में वरीयता प्राप्त की गई थी। एकल कालोनियों का चयन किया गया और तीन फेनोटाइप-आधारित रणनीतियों का उपयोग करके जांच की गई। उत्परिवर्तन प्रकार और सीईएनपी-ई नॉकआउट कोशिकाओं को पीसीआर, सेंगर अनुक्रमण, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख(चित्रा 1ए)का उपयोग करके मान्य किया गया था। CENP-E जीन के एक्सॉन 1 और एक्सॉन 13 को गुणसूत्र 4 पर लक्ष्यीकरण स्थलों (चित्रा 1B)के रूप में चुना गया था। सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9 प्रणाली आरयूवीसी और एचएनएच एंडोन्यूक्लिज़ डोमेन का उपयोग करके प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रमों के समीपस्थ डीएसबी को प्रेरित कर सकती है, जो एनएचईजे मार्गों को ट्रिगर करती है और परिणामस्वरूप जीन संपादन-छोटे सम्मिलन, विलोपन और प्रतिस्थापन(चित्रा 1सी)का उपयोग कर सकती है। इन त्रुटि-प्रवण मरम्मत तंत्रों के कारण, हमने चार जीन नॉकआउट हेला सेल आबादी प्राप्त की। पीएक्स 458-एसजीआरएनए की अभिकर्मक दक्षता एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (चित्रा 1 डी) का उपयोग करके पता लगाया गया था। हमने नियंत्रण, लक्ष्य 1, और लक्ष्य 2 हेला कोशिकाओं(चित्रा 1ई)के जीनोमिक डीएनए को भी निकाला, लक्ष्य स्थान के डीएनए को बढ़ाया, और उन्हें डीएनए अनुक्रमण और उत्परिवर्तन प्रकार(चित्रा 1एफ)के सत्यापन के लिए पीएमडी18-टी में लिगेट किया। सारांश में, लगभग 100 क्लोनों की जांच की गई और चार स्थिर CENP-E नॉकआउट HeLa कोशिकाओं को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया, जिसमें + 1 bp (क्लोन 1 और क्लोन 2 में स्थिति 28), -7 bp का विलोपन (क्लोन 3 में स्थिति 1102-1108), और -1 bp का विलोपन (क्लोन 4 में स्थिति 1102 bp) (CENP-E कोडिंग अनुक्रम, जेनबैंक परिग्रहण सं. NM_001286734.2) (चित्रा 1जी, एच)। इन उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन और समय से पहले बंद हो गया, जिसके परिणामस्वरूप क्लोन 1/2 में CENP-E जीन और क्लोन 3/4 HeLa कोशिकाओं में दो CENP-E म्यूटेंट को पूरी तरह से हटा दिया गया।

CENP-E नॉकआउट प्रयोगों की दक्षता और प्रयोगात्मक सफलता में सुधार करने के लिए, तीन फेनोटाइप-आधारित स्क्रीन रणनीतियों का विकास किया गया था। ये चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2ए)का उपयोग करके सेल कॉलोनी स्क्रीनिंग पर आधारित थे,डीएपीआई धुंधला(चित्रा 2बी)का उपयोग करके गुणसूत्र संरेखण पर,और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख(चित्रा 2सी)का उपयोग करके सीईएनपी-ई प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता पर। सीआरआईएसपीआर/कैस 9 प्रणाली के महत्वपूर्ण चरणों में गाइड आरएनए क्लोनिंग, सेल लाइनों में पीएक्स 458-एसजीआरएनए का अभिकर्मक, 48 घंटे के लिए इनक्यूबेशन, 96-अच्छी तरह से प्लेट, सेल फसल, स्क्रीनिंग, और तीन फेनोटाइप-आधारित रणनीतियों(चित्रा 2डी)का उपयोग करके सत्यापन शामिल थे। नियंत्रण और CENP-E-/- समूहों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना पता चला है कि CENP-E प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता पूरी तरह से CENP-E-/- क्लोन 1 कोशिकाओं में खटखटाया गया था और CENP-E उत्परिवर्ती क्लोन 3 कोशिकाओं (चित्रा 2E) में काफी कमी आई है, जो आगे CENP-E के CRISPR/Cas9 मध्यस्थता जीन नॉकआउट की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करता है हेला कोशिकाओं में जीन। गुणसूत्र मिसलिग्न्मेंट के साथ मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं का अनुपात नियंत्रण समूह में 0.30 ± 0.21% से बढ़कर क्लोन 1 हेला कोशिकाओं में 4.15 ± 0.57% और क्लोन 3 हेला कोशिकाओं(चित्रा 2एफ)में 5.85 ± 0.80% हो गया। इस बीच, मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं का अनुपात नियंत्रण में 3.49 ± 0.47% से बढ़कर 5.86 ± 0.57% CENP-E-/- क्लोन 1 कोशिकाओं और CENP-E उत्परिवर्ती क्लोन 3 कोशिकाओं(चित्रा 2G)में 6.70 ± 0.77% हो गया। इसके अलावा, नियंत्रण समूह(चित्रा 2एच)की तुलना में सीईएनपी-ई विलोपन के बाद क्लोन 1 और क्लोन 3 समूहों में इंटरपेज़ कोशिकाओं का अनुपात थोड़ा बढ़ गया। सीईएनपी-ई विलोपन के बाद प्रोफ़ेज़, एनाफ़ेज़ और टेलोफ़ेज़ कोशिकाओं की दोनों दरों में थोड़ी कमी आई थी, जबकि सीईएनपी-ई विलोपन(चित्रा 2आई)के बाद मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं की दरों में वृद्धि हुई थी। CENP-E विलोपन के फेनोटाइप्स की और जांच करने के लिए, हमने स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट के एक प्रमुख प्रोटीन BubR1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन किया, और पाया कि BubR1 का स्थानीयकरण असामान्य था और BubR1 का कीनेटोकोर संचय CENP-E (चित्रा 2J-L) की अनुपस्थिति में काफी प्रभावित हुआ था।

सीईएनपी-ई नॉकआउट हेला कोशिकाओं की सेल वृद्धि और प्रसार क्षमता को बेहतर ढंग से समझने के लिए, क्लोन 1, क्लोन 2, क्लोन 3, और क्लोन 4 कोशिकाओं (चित्रा 3ए, बी) सहित चार सीईएनपी-ई-/- हेला कोशिकाओं के लिए कॉलोनी गठन परख और क्रिस्टल वायलेट धुंधला प्रदर्शन किया गया था। सीईएनपी-ई विलोपन के परिणामस्वरूप क्लोन गठन की क्षमता, छोटे कॉलोनी व्यास, और प्रत्येक क्लोन(चित्रा 3ए-डी)में सेल संख्या में कमी आती है, जो बताता है कि क्लोन गठन और सेल प्रसार के लिए सीईएनपी-ई आवश्यक है। इसके अलावा, हमने 3- (4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल) -5- (3-कार्बोक्सिमेथॉक्सीफेनिल) -2- (4-सल्फोफेनिल) -2 एच-टेट्राज़ोलियम, आंतरिक नमक (एमटीएस) विधि का उपयोग किया और सेल व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन किया, और पाया कि नियंत्रण समूह में 1.05 ± 0.00 की तुलना में, सेल व्यवहार्यता मूल्यों को सीईएनपी-ई-/- हेला कोशिकाओं(चित्रा 3ई)में 0.01 ± 0.01 और 0.79 ± 0.00 तक घटा दिया गया था). गुणसूत्र स्थिरता में CENP-E की भूमिकाओं की और जांच करने के लिए, हमने गुणसूत्र की तैयारी, गिएम्सा धुंधला और कैरियोटाइप विश्लेषण किया, और जंगली प्रकार के हेला कोशिकाओं में 67.09 ± 0.50 से गुणसूत्र संख्या में कमी पाई गई सीईएनपी-ई-/- हेला कोशिकाओं में 56.08 ± 0.6 - 61.68 ± 0.83 CENP-E-/- HeLa कोशिकाओं (चित्रा 3F,G)। साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सीईएनपी-ई विलोपन सेल प्रसार, कॉलोनी गठन और सेल व्यवहार्यता को काफी रोकता है, जो बताता है कि सीईएनपी-ई सेल विकास, प्रसार और गुणसूत्र स्थिरता के लिए आवश्यक है।

इस अध्ययन में, सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइन को सीईएनपी-ई-विशिष्ट अवरोधकों की पहचान और सत्यापन के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में विकसित किया गया है। सीईएनपी-ई अवरोधकों की विशिष्टता और विषाक्तता को मान्य करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण स्थापित किया गया है(चित्रा 4)। एक उदाहरण के रूप मेंGSK923295 24,25 का उपयोग करते हुए, हमने GSK923295 की सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ जंगली प्रकार के हेला कोशिकाओं और सीईएनपी-ई-/- क्लोन 1 हेला सेल लाइनों का इलाज किया और कॉलोनी गठन परख और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख(चित्रा 4)का उपयोग करके इन दो हेला कोशिकाओं पर सीईएनपी-ई अवरोधकों के प्रभावों का पता लगाया). 6 अच्छी तरह से प्लेटों में टीका लगाया एकल कोशिकाओं कॉलोनी गठन assays के अधीन थे. कोशिकाओं को GSK923295 की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया और 2-3 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया गया और फिर आगे के विश्लेषण (चित्रा 4ए-डी) के लिए काटा गया। क्रिस्टल वायलेट धुंधला होने के बाद, जंगली प्रकार के हेला कोशिकाओं और सीईएनपी-ई-/- कोशिकाओं के कॉलोनी व्यास को इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था। जंगली प्रकार HeLa कोशिकाओं में, कॉलोनी गठन काफी GSK923295 की बढ़ती सांद्रता के उपचार के बाद कमी आई थी. इसके अलावा, जंगली प्रकार के हेला कोशिकाओं(चित्रा 4बी-डी)में सीईएनपी-ई निषेध के बाद कॉलोनियों के व्यास छोटे हो गए। विशेष रूप से, CENP-E नॉकआउट क्लोन 1 HeLa कोशिकाओं ने GSK923295 की विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में क्लोन व्यास में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं दिखाई, जो बताता है कि GSK923295 एक विशिष्ट अवरोधक है जिसमें कोई महत्वपूर्ण ऑफ-टारगेट प्रभाव नहीं है और 10 एनएम से 10 माइक्रोन की एकाग्रता सीमा पर कोई स्पष्ट विषाक्त दुष्प्रभाव नहीं है।

इसके बाद, जंगली प्रकार के हेला कोशिकाओं और सीईएनपी-ई-/- कोशिकाओं में गुणसूत्र संरेखण फेनोटाइप की जांच इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख(चित्रा 4ई)का उपयोग करके की गई थी। मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला है कि 50 एनएम, 100 एनएम, 400 एनएम, 2 माइक्रोन, और 10 माइक्रोन GSK923295(चित्रा 4ई,एफ)के उपचार के बाद मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं के अनुपात में काफी वृद्धि हुई है। इसके अलावा, जंगली प्रकार के हेला कोशिकाओं में गलत संरेखित गुणसूत्रों में उल्लेखनीय वृद्धि की तुलना में, सीईएनपी-ई-/- क्लोन 1 हेला कोशिकाएं GSK923295 की विभिन्न सांद्रता से प्रभावित नहीं थीं। एक साथ लिया गया, यह सीईएनपी-ई-/- क्लोन 1 सेल लाइन एक विशिष्ट प्रकार की GSK923295-प्रतिरोधी सेल लाइन है, जो सीईएनपी-ई विलोपन और अनुकूलन, आनुवंशिक अतिरेक34, और संभावित आनुवंशिक क्षतिपूर्ति प्रभाव 35,36,37के कारण सीईएनपी-ई अवरोधकों का जवाब नहीं देती है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि CENP-E-/- क्लोन 1 HeLa सेल CENP-E अवरोधकों की विशिष्टता, विषाक्तता और दुष्प्रभावों को मान्य करने के लिए एक शक्तिशाली और उपयोगी उपकरण है।

Figure 1
चित्र 1: CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके CENP-E-/- HeLa कोशिकाओं का निर्माण। (ए) सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9 वेक्टर निर्माण, अभिकर्मक, सेल क्लोन गठन और चयन, और कार्यात्मक सत्यापन के लिए प्रोटोकॉल समयरेखा। एसजीआरएनए डिजाइन, पीएक्स 458-एसजीआरएनए प्लास्मिड के निर्माण और उत्परिवर्ती कोशिकाओं की स्क्रीनिंग सहित सीईएनपी-ई-/- सेल लाइनों के निर्माण के लिए समयरेखा। (बी) रैखिक pX458 वेक्टर में sgRNA के क्लोनिंग का एक योजनाबद्ध मॉडल। गुणसूत्र 4 में CENP-E जीन के एक्सॉन 1 और एक्सॉन 13 को लक्ष्य स्थलों के रूप में चुना गया था। (सी) जीन संपादन के लिए सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9 प्रणाली के तंत्र। डीएसबी के बाद गैर-समरूप अंत में शामिल होने से तीन यादृच्छिक उत्परिवर्तन उत्पन्न होते हैं, जिसमें सम्मिलन, विलोपन और प्रतिस्थापन शामिल हैं। (डी)हेला कोशिकाओं की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों को pX458-sgRNA1 (लक्ष्य 1) और pX458-sgRNA2 (लक्ष्य 2) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (ई) नियंत्रण, लक्ष्य 1, और लक्ष्य 2 में जीनोमिक डीएनए के प्रतिनिधि अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन। (एफ-एच) नियंत्रण में लक्ष्य क्षेत्रों के सेंगर अनुक्रमण परिणाम, क्लोन 1, और क्लोन 3 समूह। पीसीआर प्रवर्धन पृथक क्लोन 1 और क्लोन 3 कोशिकाओं में लक्ष्य स्थान के लिए विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमरों का उपयोग किया गया था. डीएनए के टुकड़ों को pMD18-T वैक्टर में क्लोन किया गया और क्लोन गठन और सेंगर अनुक्रमण के लिए DH5α E. कोलाई में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। प्रतिनिधि अनुक्रमण परिणाम दिखाए जाते हैं। क्लोन 1 HeLa कोशिकाओं में, 28 बीपी पर + 1 बीपी का सम्मिलन था। क्लोन 2 HeLa कोशिकाओं में, 28 बीपी पर + 1 बीपी का सम्मिलन भी था। क्लोन 3 में, 1,102-1,108 बीपी पर -7 बीपी का विलोपन था। क्लोन 4 में, 1,102 बीपी पर -1 बीपी का विलोपन था। इन दो उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप एक फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन और CENP-E प्रोटीन में समय से पहले रुक जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता सीईएनपी-ई नॉकआउट हेला सेल लाइनों की निर्माण और फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीति। (ए) स्क्रीनिंग रणनीति सेल कॉलोनियों पर आधारित है। नियंत्रण समूह की तुलना में, CENP-E नॉकआउट कोशिकाओं ने विभाजित कोशिकाओं में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (बी) स्क्रीनिंग रणनीति गुणसूत्र संरेखण पर आधारित है। नियंत्रण समूह की तुलना में, CENP-E नॉकआउट कोशिकाओं ने गुणसूत्र मिसलिग्न्मेंट में वृद्धि दिखाई। कई गुणसूत्र CENP-E विलोपन के बाद धुरी ध्रुव के समीपस्थ स्थित थे। डीएपीआई नीला। स्केल बार = 10 माइक्रोन (सी) स्क्रीनिंग रणनीति सीईएनपी-ई प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता पर आधारित है। CENP-E, हरा। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (डी) सीआरआईएसपीआर/कैस 9 प्रणाली का निर्माण। CENP-E-विशिष्ट sgRNA को pX458 प्लास्मिड में लिगेट किया गया था और सत्यापन के लिए अनुक्रमित किया गया था। pX458-sgRNA प्लास्मिड एक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर HeLa कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत. कोशिकाओं को 0.25% ट्रिप्सिन/ईडीटीए का उपयोग करके लाइज़ किया गया था, जो 96-वेल प्लेट में वरीयता प्राप्त थी, और सेल कॉलोनियों के गठन के लिए सुसंस्कृत थी। (ई)नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में सीईएनपी-ई और α-ट्यूबुलिन की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। डीएपीआई (DAPI), नीला; CENP-E, हरा; α-ट्यूबलिन, लाल। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (एफ) नियंत्रण समूह और सीईएनपी-ई-/- समूहों में मिसलिग्न्मेंट गुणसूत्रों के साथ मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 0.30 ± 0.21%, एन = 9; क्लोन 1, 4.15 ± 0.57%, एन = 9; क्लोन 3, 5.85 ± 0.80%, n = 9. (जी) नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 3.49 ± 0.47%, एन = 9; क्लोन 1, 5.86 ± 0.57%, एन = 9; क्लोन 2, 6.70 ± 0.77%, n = 9. (एच) नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में इंटरपेज़ कोशिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 70.08 ± 2.71%, एन = 7; क्लोन 1, 86.77 ± 0.91%, एन = 7; क्लोन 3, 87.67 ± 0.91%, n = 7. (I) नियंत्रण और CENP-E-/- समूहों का माइटोटिक सूचकांक विश्लेषण, जिसमें प्रोफ़ेज़, मेटाफ़ेज़, एनाफ़ेज़ और टेलोफ़ेज़ कोशिकाओं के अनुपात शामिल हैं। (जे) नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में BubR1 और CENP-B की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। डीएपीआई (DAPI), नीला; BubR1, हरा; CENP-B, लाल। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (K) नियंत्रण और CENP-E-/- समूहों में BubR1 और CENP-B का लाइन-स्कैन विश्लेषण। X-अक्ष सापेक्ष दूरी को इंगित करता है। वाई-अक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता को इंगित करता है। (एल) नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में BubR1 की सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता(साइटोप्लाज्म में कीनेटोचोर्स/BubR1 की प्रतिदीप्ति तीव्रता) की प्रतिदीप्ति तीव्रता। नियंत्रण, 1.44 ± 0.10, एन = 16; क्लोन 1, 0.98 ± 0.07, n = 18. सभी रेखांकन के लिए, मतलब ± SEM दिखाया गया था। चित्रा 2 एफ-आई में, एनोवा डनेट की कई तुलना परीक्षण। एनएस, पी > 0.05; **, पी < 0.01; , पी < 0.001; , पी < 0.0001। चित्रा 2 एल में, अप्रकाशित छात्र का टी-परीक्षण। , पी < 0.001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल कॉलोनी गठन, सेल व्यवहार्यता परख, और कैरियोटाइप विश्लेषण सहित सीईएनपी-ई नॉकआउट हेला कोशिकाओं के सेल विकास परख। (ए) नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में सेल कॉलोनी की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (बी) नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में सेल कॉलोनी के प्रतिनिधि क्रिस्टल वायलेट धुंधला। स्केल बार = 1 सेमी। (सी) जंगली प्रकार (नियंत्रण) और सीईएनपी-ई-/- समूहों में प्रति क्लोन कोशिकाओं की संख्या। जंगली प्रकार, 81.97 ± 4.09, एन = 32; क्लोन 1, 31.52 ± 2.51, एन = 33; क्लोन 2, 13.97 ± 1.31, n = 33. क्लोन 3, 48.48 ± 3.01, एन = 33; क्लोन 4, 33.39 ± 1.87, n = 33। (डी)सेल कॉलोनी की सापेक्ष सेल व्यवहार्यता कोए 600 एनएम पर क्रिस्टल वायलेट अवशोषण द्वारा मापा गया था। जंगली प्रकार, 0.42 ± 0.00, एन = 6; क्लोन 1, 0.12 ± 0.00, एन = 6; क्लोन 2, 0.13 ± 0.00, n = 6. क्लोन 3, 0.18 ± 0.00, एन = 6; क्लोन 4, 0.12 ± 0.00, n = 6. (ई) एमटीएस और सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके जंगली प्रकार और सीईएनपी-ई-/- समूहों की सेल व्यवहार्यता। जंगली प्रकार, 1.05 ± 0.00, एन = 8; क्लोन 1, 0.77 ± 0.01, एन = 8; क्लोन 2, 0.67 ± 0.01, n = 7. क्लोन 3, 0.79 ± 0.00, एन = 7; क्लोन 4, 0.66 ± 0.01, n = 7. (एफ) जंगली प्रकार और सीईएनपी-ई-/- समूहों में प्रति कोशिका गुणसूत्र संख्या। जंगली प्रकार, 67.09 ± 0.50, एन = 66; क्लोन 1, 61.68 ± 0.83, एन = 105; क्लोन 2, 56.08 ± 0.6, n = 106। क्लोन 3, 61.28 ± 0.63, एन = 90; क्लोन 4, 64.18 ± 0.83, n = 61। (जी) नियंत्रण समूह और सीईएनपी-ई-/- समूह में फैले गुणसूत्र की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 10 माइक्रोन. सभी रेखांकन के लिए, एनोवा डनेट की कई तुलना परीक्षण। त्रुटि सलाखों, मतलब ± SEM. **, पी < 0.01; , पी < 0.001; , पी < 0.0001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीईएनपी-ई अवरोधकों की विशिष्टता और विषाक्तता को मान्य करने के लिए सीईएनपी-ई नॉकआउट हेला कोशिकाओं का उपयोग करना। (ए) GSK923295 के विभिन्न सांद्रता के उपचार के बाद नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों के प्रतिनिधि क्रिस्टल वायलेट धुंधला हो जाना। स्केल बार = 1 सेमी (बी) GSK923295 के विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के बाद नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूहों में सेल कॉलोनी की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 50 माइक्रोन (सी) GSK923295 के विभिन्न सांद्रता के उपचार के बाद नियंत्रण समूह में सेल कालोनियों के व्यास. नियंत्रण, 28.68 ± 0.85 माइक्रोन, एन = 149; 10 एनएम, 25.40 ± 0.86 माइक्रोन, एन = 223; 25 एनएम, 26.07 ± 0.68 माइक्रोन, एन = 255; 50 एनएम, 26.41 ± 0.60 माइक्रोन, एन = 180; 100 एनएम, 16.02 ± 0.32 माइक्रोन, एन = 185; 200 एनएम, 15.61 ± 0.29 माइक्रोन, एन = 185। (डी) GSK923295 की विभिन्न सांद्रता के उपचार के बाद सीईएनपी-ई-/ समूहों में सेल कॉलोनियों के व्यास। क्लोन 1, 17.64 ± 0.40 माइक्रोन, एन = 230; 10 एनएम, 17.98 ± 0.39 माइक्रोन, एन = 230; 25 एनएम, 15.03 ± 0.26 माइक्रोन, एन = 230; 50 एनएम, 16.14 ± 0.32 माइक्रोन, एन = 230; 100 एनएम, 21.13 ± 0.42 माइक्रोन, एन = 230; 200 एनएम, 19.00 ± 0.40 सेमी, एन = 230। (ई)नियंत्रण में α-ट्यूबुलिन की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां और GSK923295, डीएपीआई की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के बाद सीईएनपी-ई-/ α-ट्यूबिलिन, हरा। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (एफ) GSK923295 के विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के बाद नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/- समूह में मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं का अनुपात। (जी) GSK923295 की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के बाद नियंत्रण और सीईएनपी-ई-/ सभी रेखांकन के लिए, एनोवा डनेट की कई तुलना परीक्षण। त्रुटि सलाखों, मतलब ± SEM. ns, p > 0.05; *, पी < 0.05; **, पी < 0.01; , पी < 0.0001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

किन्सिन-7 सीईएनपी-ई कोशिका विभाजन 17,19,20के दौरान गुणसूत्र संरेखण और धुरी विधानसभा चौकी में एक प्रमुख नियामक है। सीईएनपी-ई के आनुवंशिक विलोपन आमतौर पर धुरी विधानसभा चौकी, सेल चक्र गिरफ्तारी, और कोशिका मृत्यु 27,29,51,52 के सक्रियण में परिणाम. इस प्रकार, स्थिर सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइनों का निर्माण सीईएनपी-ई जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण अनसुलझा मुद्दा है। इस अध्ययन में, CENP-E नॉकआउट HeLa कोशिकाओं को CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया है। इस अध्ययन ने तीन अनुकूलित फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीतियों की स्थापना की है - सेल कॉलोनी स्क्रीनिंग, गुणसूत्र संरेखण फेनोटाइप, और सीईएनपी-ई प्रोटीन की फ्लोरोसेंट तीव्रता - जो सीईएनपी-ई नॉकआउट कोशिकाओं की दक्षता और सफलता दर में काफी सुधार करती है।

इस अध्ययन में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, ऑफ-टारगेट प्रभावों को कम करने के लिए अनुकूलित एसजीआरएनए डिजाइन करना आवश्यक है। दूसरा, लिपिड आधारित अभिकर्मकों, electroporation, या lentivirus अभिकर्मक के माध्यम से सुसंस्कृत कोशिकाओं में CRISPR प्लास्मिड के अभिकर्मक अभिकर्मक दक्षता और जीन दस्तक सेल अनुपात में सुधार कर सकते हैं. इसके अलावा, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई 53,54,55 और puromycin चयन 56,57 के अनुप्रयोगों स्क्रीन की गति में तेजी लाने और प्रयोगात्मक अवधि छोटा होगा. तीसरा, जीन नॉकआउट फेनोटाइप का सत्यापन पीसीआर, वेस्टर्न ब्लॉट, इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख और जीनोमिक डीएनए अनुक्रमण द्वारा पूरा किया जा सकता है। चौथा, CENP-E नॉकआउट फेनोटाइप के कार्यात्मक विश्लेषण सेल प्रसार परख, immunofluorescence, सेल चक्र विश्लेषण, और उच्च संकल्प इमेजिंग सहित assays की एक किस्म का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है.

जेडएफएन और टैलेन जैसी पारंपरिक जीनोम संपादन तकनीकों की तुलना में, सीआरआईएसपीआर/कैस 9 प्रणाली सादगी, उच्च दक्षता, अनुकूलन में आसानी, बहुमुखी प्रतिभा और मल्टीप्लेक्स क्षमता10सहित कई फायदे प्रदर्शित करती है। इसके अलावा, सीआरआईएसपीआर/कैस 9 प्रणाली को उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और बड़े पैमाने पर इंजीनियरिंग परियोजनाओं58,59के लिए बढ़ाया जा सकता है। सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली को एक कुशल जीन संपादन तकनीक के रूप में भी अनुकूलित किया गया है जो कई जीनों60 में एक-चरण उत्परिवर्तन को सक्षम बनाता है, जो कार्यात्मक रूप से निरर्थक जीन, बातचीत करने वाले जीन और पॉलीजेनिक आनुवंशिक रोगों के अध्ययन को तेज करता है। इसके अलावा, सीआरआईएसपीआर/कैस 9 प्रणाली को इसकी दक्षता और बहुमुखी प्रतिभा में सुधार किया जा सकताहै 8. उच्च निष्ठा एचडीआर मार्ग, एक वैकल्पिक प्रमुख डीएनए मरम्मत मार्ग, भविष्य10 में कोशिकाओं को विभाजित करने में लक्ष्य स्थान पर सटीक जीन संपादन मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, कई एसजीआरएनए के सह-अभिकर्मक के परिणामस्वरूप कोशिकाओं में सीईएनपी-ई के बड़े विलोपन और पूर्ण नॉकआउट हो सकते हैं, जो सीईएनपी-ई नॉकआउट कोशिकाओं की स्थिरता और विश्वसनीयता में सुधार करता है।

CRISPR/Cas9 प्रणाली की एक प्रमुख सीमा यह है कि SpCas9 ऑफ-टारगेट म्यूटाजेनेसिस से ग्रस्त है, जो कभी-कभी जीनोम में अनपेक्षित साइटों को लक्षित करता है और ऑफ-टारगेट प्रभावों की ओर जाता है। यह बेहतर गाइड शाही सेना डिजाइन, बंद लक्ष्य भविष्यवाणी एल्गोरिदम, और पूरे जीनोम अनुक्रमण10,59 द्वारा कम से कम किया जा सकता है. वैकल्पिक Cas12a या Cas13 प्रोटीन53 के उपयोग, आधार संपादकों61 के उपयोग, और Cas9 प्रोटीन और गाइड RNA12 की डिलीवरी सहित कई दृष्टिकोण, ऑफ-टारगेट प्रभावों को कम करने के लिए विकसित किए गए हैं। दूसरी सीमा यह है कि व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस Cas9 (SpCas9) को लक्ष्य लोकी मान्यता के लिए एक आवश्यक 5'-NGG PAM की आवश्यकता होती है, जो जीनोम में SpCas9 के लक्ष्य स्थलों के चयन को सीमित करता है। इंजीनियर SpCas9 वेरिएंट का विकास जो आराम से या विविध PAMs को पहचानता है, CRISPR/Cas9 जीनोम इंजीनियरिंग टूलबॉक्स 62,63,64 में Cas9 की लक्ष्य सीमा को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, कई मामलों में, सीआरआईएसपीआर/कैस 9 प्रणाली मोज़ेकवाद की ओर जाता है और सेल आबादी65 में विभिन्न संपादन में परिणाम। कुछ जानवरों Cas9 प्रोटीन, जो कुछ प्रजातियों12,66 में अपने अनुप्रयोगों को सीमित करने के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित कर सकते हैं. इन सीमाओं के बावजूद, CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम संपादन और बुनियादी विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी, जीन थेरेपी और चिकित्सा में जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली जीन संपादन तकनीक बनी हुई है।

सीईएनपी-ई और इसके अवरोधकों के इंटरैक्शन मोड और आणविक तंत्र कोशिका जीव विज्ञान और कैंसर अनुसंधान में महत्वपूर्ण अनुसंधान क्षेत्र हैं। साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन और आणविक जीव विज्ञान अध्ययनों से पता चला है कि GSK923295 Ile182 और Thr183 के साथ और CENP-E प्रोटीन के साथ बातचीत करता है, हेलिक्स α2 और α3 के बीच और लूप 525 के पास सैंडविच किया जा रहा है। इस अध्ययन में, CENP-E नॉकआउट HeLa सेल लाइन को CENP-E अवरोधकों की विशिष्टता और विषाक्तता के सत्यापन के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है। आज तक, अधिकांश CENP-E अवरोधकों की बाध्यकारी साइटों और तंत्रों को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। आणविक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग67, परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी68, ऑप्टिकल चिमटी69, आणविक संरचना संशोधनों, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी70, और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी71,72 के संयोजन बातचीत साइटों और सीईएनपी-ई निषेध के तंत्र के स्पष्टीकरण में योगदान देंगे। भविष्य में, विशिष्ट साइटों पर सीईएनपी-ई के होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत-मध्यस्थता लक्ष्य संशोधन सीईएनपी-ई जीन संपादन कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं, जो सीईएनपी-ई-विशिष्ट अवरोधकों के विशिष्ट बाध्यकारी साइटों और तंत्र को प्रकट करने में मदद करेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम उपयोगी चर्चाओं के लिए फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में साइटोस्केलेटन प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम जून-जिन लिन, झी-होंग हुआंग, लिंग लिन, ली-ली पांग, लिन-यिंग झोउ, शी लिन, और मिन-ज़िया वू को सार्वजनिक प्रौद्योगिकी सेवा केंद्र, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम उनके समर्थन के लिए फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में बेसिक मेडिकल साइंसेज के प्रायोगिक शिक्षण केंद्र में सी-यी झेंग, यिंग लिन और क्यूई के को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82001608 और 82101678), फ़ुज़ियान प्रांत, चीन का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2019J05071), विज्ञान और प्रौद्योगिकी के नवाचार के लिए संयुक्त निधि, फ़ुज़ियान प्रांत, चीन (अनुदान संख्या 2021Y9160), और फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी उच्च-स्तरीय प्रतिभा वैज्ञानिक अनुसंधान स्टार्ट-अप फंडिंग प्रोजेक्ट (अनुदान संख्या XRCZX2017025)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

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References

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जीवविज्ञान अंक 196 CENP-E नॉकआउट सेंट्रोमियर से जुड़े प्रोटीन-ई किन्सिन काइनेटोकोर-सूक्ष्मनलिका कैप्चर क्रोमोसोम संरेखण स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट HeLa कोशिकाएं फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग क्रोमोसोम मिसलिग्न्मेंट BUB1 माइटोटिक चेकपॉइंट सेरीन/थ्रेओनीन किनेज बी (BubR1) माइटोटिक दोष
CRISPR/Cas9 सिस्टम का उपयोग करके सेंट्रोमियर-एसोसिएटेड प्रोटीन-E <em>CENP-E<sup>-/-</sup></em> नॉकआउट सेल लाइन्स का उत्पादन
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