Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توليد خطوط خلايا خروج المغلوب المرتبطة بالسنترومير Protein-E CENP-E-/- باستخدام نظام كريسبر / كاس 9

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65476
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

تشير هذه المقالة إلى بناء خلايا خروج المغلوب المرتبطة بالبروتين E (CENP-E) باستخدام نظام CRISPR / Cas9 وثلاث استراتيجيات فحص قائمة على النمط الظاهري. لقد استخدمنا خط الخلايا الضربة القاضية CENP-E لإنشاء نهج جديد للتحقق من خصوصية وسمية مثبطات CENP-E ، وهو أمر مفيد لتطوير الأدوية والبحوث البيولوجية.

Abstract

برز نظام كريسبر (التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام) / Cas9 كأداة قوية لتحرير الجينات بدقة وكفاءة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. البروتين E المرتبط بالسنترومير (CENP-E) هو كينيسين موجه بنهاية زائد مطلوب لالتقاط الأنابيب الدقيقة الحركية ، ومحاذاة الكروموسوم ، ونقطة تفتيش تجميع المغزل. على الرغم من أن الوظائف الخلوية لبروتينات CENP-E قد تمت دراستها جيدا ، فقد كان من الصعب دراسة الوظائف المباشرة لبروتينات CENP-E باستخدام البروتوكولات التقليدية لأن استئصال CENP-E يؤدي عادة إلى تنشيط نقطة تفتيش تجميع المغزل ، وتوقف دورة الخلية ، وموت الخلايا. في هذه الدراسة ، قمنا بإخراج جين CENP-E تماما في خلايا HeLa البشرية ونجحنا في إنشاء خلايا CENP-E-/- HeLa باستخدام نظام CRISPR / Cas9.

تم إنشاء ثلاث استراتيجيات فحص محسنة قائمة على النمط الظاهري ، بما في ذلك فحص مستعمرة الخلايا ، والأنماط الظاهرية لمحاذاة الكروموسومات ، وشدة الفلورسنت لبروتينات CENP-E ، والتي تعمل بشكل فعال على تحسين كفاءة الفحص ومعدل النجاح التجريبي لخلايا CENP-E بالضربة القاضية. الأهم من ذلك ، أن حذف CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم ، والموقع غير الطبيعي لبروتينات نقطة التفتيش الانقسامية BUB1 سيرين / ثريونين كيناز B (BubR1) ، والعيوب الانقسامية. علاوة على ذلك ، استخدمنا نموذج خلية HeLa بالضربة القاضية CENP-E لتطوير طريقة تحديد مثبطات CENP-E المحددة.

في هذه الدراسة ، تم وضع نهج مفيد للتحقق من خصوصية وسمية مثبطات CENP-E. علاوة على ذلك ، تقدم هذه الورقة بروتوكولات تحرير الجينات CENP-E باستخدام نظام CRISPR / Cas9 ، والذي يمكن أن يكون أداة قوية للتحقيق في آليات CENP-E في انقسام الخلايا. علاوة على ذلك ، سيساهم خط الخلايا الضربة القاضية CENP-E في اكتشاف مثبطات CENP-E والتحقق من صحتها ، والتي لها آثار مهمة على تطوير الأدوية المضادة للأورام ، ودراسات آليات انقسام الخلايا في بيولوجيا الخلية ، والتطبيقات السريرية.

Introduction

يتوسط تحرير الجينوم الهندسي التعديلات المستهدفة للجينات في مجموعة متنوعة من الخلايا والكائنات الحية. في حقيقيات النوى ، يمكن إدخال طفرات خاصة بالموقع من خلال تطبيقات النيوكليازات الخاصة بالتسلسل التي تحفز إعادة التركيب المتماثل للحمض النوويالمستهدف 1. في السنوات الأخيرة ، تم تصميم العديد من تقنيات تحرير الجينوم ، بما في ذلك نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) 2,3 ، والنوكليازات المستجيبة الشبيهة بمنشط النسخ (TALENs) 4,5 ، و meganucleases 6,7 ، لشق الجينومات في مواقع محددة ، ولكن هذه الأساليب تتطلب هندسة بروتين معقدة وإجراءات تجريبية زائدة عن الحاجة. أظهرت الدراسات أن النوع الثاني من بدائية النواة العنقودية المتجمعة بانتظام بين التكرارات القصيرة المتباعدة (CRISPR) / Cas هي تقنية فعالة لتحرير الجينات ، والتي تتوسط على وجه التحديد انقسام الحمض النووي الموجه بالحمض النووي الريبي والموقع في مجموعة واسعة من الخلايا والأنواع8،9،10،11. أحدثت تقنية الضربة القاضية الجينية CRISPR / Cas9 ثورة في مجالات البيولوجيا الأساسية والتكنولوجيا الحيوية والطب12.

طورت البكتيريا ومعظم العتائق نظاما مناعيا تكيفيا قائما على الحمض النووي الريبي يستخدم بروتينات كريسبر وكاس لتحديد وتدمير الفيروسات والبلازميدات13. العقدية المقيحة يحتوي Cas9 (SpCas9) endonuclease على محلول تقاطع هوليداي الشبيه ب RuvC (RuvC) ومجال His-Asn-His (HNH) ، والذي يمكنه التوسط بكفاءة في الفواصل ذات التسلسل المزدوج (DSBs) من خلال توفير الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه الاصطناعي (sgRNA) الذي يحتوي على CRISPR RNAs (crRNA) و crRNA المنشط (tracrRNA) 14،15،16. يمكن إصلاح DSBs من خلال مسار الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) أو مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) ، والذي يقدم طفرات متعددة ، بما في ذلك عمليات الإدراج أو الحذف أو بدائل النوكليوتيدات المفردة الخالية من الندبات ، في خلايا الثدييات 1,8. يمكن استخدام كل من NHEJ المعرض للخطأ ومسار HDR عالي الدقة للتوسط في خروج المغلوب الجيني من خلال عمليات الإدراج أو الحذف ، والتي يمكن أن تسبب طفرات إزاحة الإطار وكودونات التوقف المبكرة10.

مطلوب Kinesin-7 CENP-E لربط الأنابيب الدقيقة الحركية ومحاذاة الكروموسوم أثناء انقسام الخلايا17،18،19. الحقن المجهري للأجسام المضادة20،21 ، استنفاد siRNA22،23 ، التثبيط الكيميائي24،25،26 ، والحذف الجيني27،28،29 من CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم ، وتنشيط نقطة تفتيش تجميع المغزل والعيوب الانقسامية ، مما يؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية وعدم استقرار الكروموسومات19,30. في الفئران ، يؤدي حذف CENP-E إلى نمو غير طبيعي وفتك جنيني في المراحل المبكرة جدا من التطور27،29،31. عادة ما يؤدي الحذف الجيني ل CENP-E إلى اختلال الكروموسوم وموت الخلايا26،27،29 ، وهو ما يمثل عقبة في دراسة وظائف وآليات بروتينات CENP-E.

أنشأت دراسة حديثة خط خلية خروج المغلوب CENP-E مشروطا باستخدام طريقة تحرير الجينات CRISPR / Cas9 القابلة للحث على الأوكسين32 ، والتي تتيح التدهور السريع لبروتينات CENP-E في وقت قصير نسبيا33. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم يتم إنشاء خطوط خلايا خروج المغلوب CENP-E مستقرة ، وهو تحد تقني لم يتم حله في بيولوجيا CENP-E. بالنظر إلى المتانة الجينية34 ، واستجابات التعويض الجيني35،36،37 ، والبيئات المعقدة داخل الخلايا ، حيث أن العواقب المباشرة للحذف الكامل ل CENP-E قد تكون معقدة ولا يمكن التنبؤ بها ، فمن المهم إنشاء خطوط خلايا CENP-E للتحقيق في آليات محاذاة الكروموسوم ، ونقطة تفتيش تجميع المغزل ، ومسارات إشارات المصب.

يعد اكتشاف مثبطات CENP-E وتطبيقاتها أمرا مهما لعلاج السرطان. حتى الآن ، تم العثور على سبعة أنواع من مثبطات CENP-E وتوليفها ، بما في ذلك GSK923295 ومشتقاته24,25 ، PF-2771 38,39 ، مشتقات سقالة إيميدازو [1,2-a]بيريدين 40,41 ، مركب-A42,43 ، سينتيلين44,45 ، UA6278446 ، ومشتقات بنزو بيرولو [2,1-ب] ثيازول47. من بين هذه المثبطات ، GSK923295 هو مثبط CENP-E الخيفي والفعال الذي يرتبط بالمجال الحركي ل CENP-E ويثبط نشاط ATPase المحفز بالأنابيب الدقيقة CENP-E مع Ki من 3.2 ± 0.2 نانومتر24,25. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الآثار المثبطة ل GSK923295 على الخلايا السرطانية المستزرعة ، فإن الآثار العلاجية ل GSK923295 في مرضى السرطان السريري ليست مثالية48,49 ، مما أثار أيضا مخاوف بشأن خصوصية GSK923295 ل CENP-E. علاوة على ذلك ، فإن الخصوصية والآثار الجانبية لمثبطات CENP-E الأخرى على بروتينات CENP-E هي قضايا رئيسية في أبحاث السرطان.

في هذه الدراسة ، قمنا بإخراج جين CENP-E تماما في خلايا HeLa باستخدام نظام CRISPR / Cas9. تم إنشاء ثلاث استراتيجيات فحص محسنة قائمة على النمط الظاهري ، بما في ذلك فحص مستعمرة الخلايا ، والأنماط الظاهرية لمحاذاة الكروموسومات ، وكثافة الفلورسنت لبروتينات CENP-E ، لتحسين كفاءة الفحص ومعدل نجاح تحرير الجينات CENP-E. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام خطوط خلايا CENP-E لاختبار خصوصية المركبات المرشحة ل CENP-E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء ناقلات الضربة القاضية الجينية CRISPR / Cas9

  1. حدد تسلسل الحمض النووي الجينومي المستهدف على جين CENP-E البشري (GenBank Accession No. NM_001286734.2) وتصميم sgRNA باستخدام أداة تصميم CRISPR عبر الإنترنت (http://crispor.tefor.net/).
  2. أدخل تسلسلا جينوميا واحدا ، وحدد جينوم "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (مجموعة تحليل hg38) + تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs): dbSNP148" ، وحدد الشكل المجاور للفضاء الأولي "20 bp-NGG-spCas9". اختر تسلسلين دليليين ، بما في ذلك sgRNA-1 و 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' و sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3' ، وفقا لدرجات الخصوصية50 ، والكفاءة المتوقعة10 ، والحد الأدنى من الأهداف.
  3. ترتيب وتوليف oligonucleotides الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل (ssODNs). تمييع ssODNs في ddH2O إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومتر. لفسفرة وتلدين أوليغوس sgRNA ، أضف 1 ميكرولتر من oligo الأمامي ، و 1 ميكرولتر من oligo العكسي ، و 0.5 ميكرولتر من T4 polynucleotide kinase ، و 1 μL من T4 polynucleotide kinase buffer ، و 6.5 μL من الماء الخالي من RNase في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ ثم انزل إلى 25 درجة مئوية عند 5 درجات مئوية دقيقة -1.
  4. هضم البلازميد pX458 باستخدام إنزيم تقييد BbsEquation 1 . أضف 1 ميكروغرام من بلازميد pX458 ، و 2 ميكرولتر من 10x buffer G ، و 1 ميكرولتر من BbsEquation 1 ، وأضف ddH2O الخالي من RNase إلى 20 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. بعد ذلك ، قم بتنقية البلازميد الخطي باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي للعمود وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
  5. اربط أوليغوس sgRNA في بلازميد pX458 (pSpCas9 (BB) -2A-بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) بلازميد ، Addgene ID. 48138). أضف 1 ميكرولتر من قليل النوكليوتيدات الملدن ، و 25 نانوغرام من البلازميد الخطي ، و 1 ميكرولتر من 10x T4 عازلة لربط الحمض النووي ، و 0.5 ميكرولتر من T4 DNA ligase (350 U / μL) وتكوين ما يصل إلى 10 ميكرولتر مع ddH2O في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل. احتضان محلول الربط عند 16 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  6. احتضان 10 ميكرولتر من البلازميد المبني مع خلايا DH5α المختصة على الجليد لمدة 30 دقيقة ، وصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ووضعها على الفور على الجليد لمدة 5 دقائق. أضف 500 ميكرولتر من وسط لوريا بيرتاني (LB) وزرع الخلايا على صفيحة LB تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل). احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة وفحص المستنسخة المقاومة.
  7. حدد 5-10 مستعمرات مفردة بطرف ماصة معقم وانقلها إلى مزرعة 1 مل من وسط LB مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل). احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية ورجها عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  8. عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة استخراج البلازميد وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. تحقق من صحة الحمض النووي البلازميد لكل مستعمرة عن طريق تسلسل سانجر من موقع المروج U6 باستخدام التمهيدي U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. استخرج ونقي البلازميدات باستخدام مجموعة الحمض النووي البلازميد الخالية من الإندو وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.

2. نقل وعزل وفحص خلايا هيلا بالضربة القاضية CENP-E

  1. استزراع خلايا هيلا في وسط النسر المعدل Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. احتضان خلايا هيلا باستخدام 0.25٪ تريبسين / إيثيلين ديامين حمض رباعي الخليك (EDTA) عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق ، وفصل الخلايا عن طريق السحب برفق ، ثم زرع الخلايا في صفائح جديدة بنسبة تخفيف 1: 4 لمرور الخلية.
  3. زرع الخلايا في لوحة 12 بئرا ، وثقافة التقاء 60-70 ٪ قبل النقل. نقل بلازميدات pX458-sgRNA إلى خلايا HeLa باستخدام الكواشف المشار إليها وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    1. امزج بلطف 1 ميكروغرام من بلازميد pX458-sgRNA المصدق عليه و 50 ميكرولتر من وسط المصل المختزل في الأنبوب A. بعد ذلك ، امزج برفق 2 ميكرولتر من كاشف النقل و 50 ميكرولتر من وسط المصل المختزل في الأنبوب B. احتضان الأنابيب A و B بشكل منفصل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. امزج كل من الأنبوب A والأنبوب B برفق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف الخليط إلى طبق من 12 بئرا ، واحتضن الخلايا لمدة 6 ساعات ، واستبدل الوسط بوسط DMEM جديد.
  4. افحص خلايا هيلا بعد 24 ساعة أو 48 ساعة باستخدام مجهر مضان لكفاءة النقل. بعد النقل لمدة 48 ساعة ، قم بفصل خلايا HeLa المنقولة تماما باستخدام 0.25٪ trypsin / EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق ، واحسب عدد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer أو عداد الخلايا الآلي ، وقم بتقسيم الخلايا إلى ثلاث لوحات منفصلة من 96 بئرا لكل مجموعة منقولة وفقا لطرق التخفيف التسلسلي10.
  5. أعد الخلايا إلى حاضنة مرطبة ثم استزراعها لمدة 1-2 أسابيع أخرى. قم بتغيير وسط الثقافة مرة كل 3 أيام. للفحص القائم على النمط الظاهري والتحقق من خروج المغلوب CENP-E ، قم بفصل الخلايا وتوسيعها في 24 بئرا أو 12 لوحة بئر لمدة 5-7 أيام.
  6. افحص الخلايا الطافرة بأقطار مستعمرة خلايا أصغر باستخدام مجهر مقلوب مزود بعدسات موضوعية 10x و 20x.
    ملاحظة: عادة ما تؤدي طفرات CENP-E إلى زيادة كبيرة في عدد الخلايا المنقسمة في مستعمرات الخلايا ، والتي يمكن أن تكون أحد المؤشرات الرئيسية لفحص الخلايا الطافرة CENP-E .
  7. حصاد الخلايا لاستخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي الحيواني وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: 0.25 ميكرولتر من Taq polymerase ، 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x (Mg2+ plus) ، 4 ميكرولتر من مخاليط dNTP ، 500 نانوغرام من قالب الحمض النووي ، 1 ميكرولتر من oligo الأمامي ، 1 ميكرولتر من oligo العكسي ، واضبط ddH2O إلى 50 ميكرولتر. استخدم إعدادات برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية لتضخيم الجينات: 98 درجة مئوية ، 10 ثوان ؛ 98 درجة مئوية ، 10 ثوان ، 55 درجة مئوية ، 30 ثانية ، 72 درجة مئوية ، 60 ثانية لمدة 33 دورة ؛ 72 درجة مئوية ، 10 دقائق ، ثم امسك عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: ترد قائمة بالمواد الأولية المحددة لاستنساخ الموضع المستهدف على النحو التالي: الهدف F1 من CENP-E ، 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'؛ الهدف CENP-E R1 ، 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3 '؛ الهدف CENP-E F2 ، 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3 '؛ الهدف CENP-E R2 ، 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. اربط الحمض النووي المستهدف في ناقل pMD18-T وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. نقل البلازميد المربوط إلى خلايا DH5α المختصة وثقافة لاختيار المستنسخة.
  9. قم بإجراء تسلسل سانجر لتحديد أنواع خروج المغلوب CENP-E . عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة استخراج البلازميد وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. قم بإجراء تسلسل سانجر للحمض النووي البلازميد لكل مستعمرة باستخدام الاشعال الأمامية والخلفية M13. M13F التمهيدي، 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R التمهيدي ، 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. قم بزرع خلايا HeLa الطافرة من النوع البري و CENP-E على أغطية زجاجية مقاس 12 مم في صفيحة من 24 بئرا ، على التوالي. قم بإزالة وسط DMEM الكامل وثبت الخلايا في محلول مثبت 4٪ بارافورمالدهايد / محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  11. تلطيخ النوى بمحلول 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. فحص الخلايا الطافرة CENP-E والتحقق من صحتها بناء على النمط الظاهري لمحاذاة الكروموسوم باستخدام مجهر مضان مزود بخطة فلور 40x / الفتحة العددية (NA) 0.75 الهدف.
  12. فحص خلايا خروج المغلوب CENP-E والتحقق من صحتها باستخدام تلطيخ وتحليل التألق المناعي (انظر القسم 3) لبروتينات CENP-E.

3. تلطيخ المناعي والفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة

  1. ثبت الخلايا بمحلول مثبت بارافورمالدهايد / PBS بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وانغمس لمدة 2 × 5 دقائق في 1x PBS.
    ملاحظة: تأكد من أن الخلايا في حالة صحية وأن الخلايا يتم جمعها وتثبيتها برفق لتجنب انفصال الخلايا الطورية.
  2. قم بتخلل الخلايا بنسبة 0.25٪ Triton X-100 / PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق واغمرها في 1x PBS لمدة 2 × 5 دقائق.
  3. قم بحظر الخلايا باستخدام 1٪ BSA / PBST (0.1٪ Tween 20 في PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تمييع الأجسام المضادة الأولية بنسبة 1٪ BSA / PBST واحتضان العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة.
  4. تجاهل محاليل الأجسام المضادة الأولية ، وشطف الخلايا 3 × 5 دقائق مع 1x PBS ، واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  5. تخلص من الأجسام المضادة الثانوية واشطف الخلايا في 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  6. تلطيخ النوى مع DAPI في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط التثبيت. ختم الشرائح مع طلاء الأظافر.
  7. مراقبة وتسجيل الصور الفلورية باستخدام مجهر المسح متحد البؤر مزود بهدف 63x / NA 1.40.

4. إعداد كروموسوم وتحليل النمط النووي

  1. استزراع خلايا النوع البري وخلايا CENP-E-/- HeLa في وسط DMEM الكامل المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين لمدة 24 ساعة ثم احتضان خلايا CENP-E-/- HeLa من النوع البري مع 300 نانومتر كولشيسين لمدة 5 ساعات.
  2. احتضان الخلايا بنسبة 0.25٪ تربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وجمع الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  3. قم بطرد الخلايا عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المواد الطافية ، وأضف 1.2 مل من محلول KCl 0.075 مول / لتر ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بطرد الخلايا عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المواد الطافية ، وأضف 0.2 مل من المحلول المثبت (الميثانول: حمض الخليك الجليدي = 3: 1) للبادئة ، واخلطها برفق لمدة دقيقة واحدة.
  5. قم بطرد الخلايا عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وجمع الكريات ، وإضافة 1.5 مل من المحلول المثبت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. تخلص من المواد الطافية ، وأضف 0.6 مل من المحاليل المثبتة ، وقم بإعداد تعليق خلوي. أضف 3-5 قطرات من تعليق الخلية من ارتفاع 35-40 سم على شرائح الجليد.
    ملاحظة: حافظ على الارتفاع لتحرير تعليق الخلية على الشرائح عند 35-40 سم ؛ خلاف ذلك ، قد تكون الكروموسومات مشتتة للغاية أو غير منفصلة عن بعضها البعض.
  7. قم بتجفيف الشرائح على الفور باستخدام مصباح كحولي ، وقم بتلطيخ العينات بمحلول تلطيخ Giemsa بنسبة 10٪ لمدة 7 دقائق ، واشطف الشرائح بالماء الجاري لمدة 2 دقيقة ، وراقب العينات باستخدام مجهر ضوئي مجهز بهدف Plan Fluor 40x / NA 0.75.

5. مقايسة تشكيل مستعمرة الخلية

  1. قم بإعداد معلقات الخلايا في ألواح 6 آبار بكثافة خلية تتراوح بين 1000 و 2000 خلية / بئر. هز الألواح برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي.
  2. ضع الألواح المكونة من 6 آبار في حاضنة CO2 واحتضانها لمدة 2-3 أسابيع عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. تغيير وسط الثقافة مرة واحدة كل 5 أيام. سجل الصور باستخدام مجهر مقلوب مزود بعدسات موضوعية 10x و 20x. احصد الخلايا عندما تكون المستعمرات مرئية (مئات الخلايا داخل استنساخ).
  3. لدراسة تأثيرات GSK923295 ، قم بزراعة الخلايا في ألواح 6 آبار لمدة 24 ساعة ، وأضف 2 مل من GSK923295 بتركيزات نهائية تبلغ 10 و 25 و 50 و 100 و 200 نانومتر.
    ملاحظة: لا تحرك طبق الاستزراع في المرحلة المبكرة من تكوين الاستنساخ لتجنب تساقط الخلايا ، والتي يمكن أن تشكل استنساخا جديدا وتؤثر على فحص الخلايا المنقولة.
  4. تخلص من وسط الاستزراع وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 1٪ PFA في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تلطيخ المستعمرات بمحلول تلطيخ بنفسجي بلوري بنسبة 0.1٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. شطف العينات مع 1x PBS ثلاث مرات. سجل صور مستعمرات الخلايا وحدد أقطار كل مستعمرة باستخدام برنامج ImageJ. اختر أداة تحديد الخط المستقيم ، انقر تحليل، اختر قياس، وسجل الطول.
  5. شطف المستعمرات مع 1 مل من محلول حمض الخليك 10 ٪ لمدة 5 دقائق. نقل 200 ميكرولتر من المحاليل الطافية في صفيحة 96 بئرا ، وقياس قيم الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة عندA 600 نانومتر.

6. فحص صلاحية الخلية

  1. قم بزرع الخلايا في ألواح 24 بئرا واستزرع الخلايا بكثافة 48 ساعة إلى 80-90٪.
  2. احتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  3. مزيج 400 ميكرولتر من PBS مع الخلايا مع بندقية ماصة. نقل 100 ميكرولتر من معلقات الخلية إلى لوحة 96 بئر.
  4. أضف 20 ميكرولتر من محلول MTS في كل بئر بتركيز نهائي يبلغ 317 ميكروغرام / مل واخلطه برفق وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعات في حاضنة CO2 .
  5. سجل قيم الامتصاص لكل بئر عند ذروة الامتصاص البالغة490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة. استخدم طولا موجيا مرجعيا يبلغA 630 نانومتر لطرح الخلفية التي يساهم بها حطام الخلية والامتصاص غير المحدد (صلاحية الخلية = A490nm- A630 نانومتر).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء خلايا CENP-E-/- HeLa بنجاح باستخدام نظام CRISPR / Cas9 (الشكل 1). يوضح الشكل 1 الجدول الزمني والخطوات التجريبية الحرجة لهذه الطريقة. أولا ، قمنا بتصميم وتوليف sgRNAs الخاصة ب CENP-E ، وقمنا بتلدين وربط sgRNAs في بلازميد pX458 ، ونقل البلازميد إلى خلايا HeLa ، واستزراعهم لمدة 48 ساعة. تم فصل الخلايا المنقولة وزرعها في صفيحة 96 بئرا باستخدام التخفيفات التسلسلية (الشكل 1 أ). تم اختيار المستعمرات الفردية وفحصها باستخدام ثلاث استراتيجيات قائمة على النمط الظاهري. تم التحقق من صحة أنواع الطفرات وخلايا خروج المغلوب CENP-E باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل سانجر ومقايسات التألق المناعي (الشكل 1 أ). تم اختيار Exon 1 و exon 13 من جين CENP-E على الكروموسوم 4 كمواقع استهداف (الشكل 1B). يمكن لنظام CRISPR / Cas9 تحفيز DSBs القريبة من تسلسلات الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) باستخدام مجالات RuvC و HNH endonuclease ، والتي تؤدي إلى مسارات NHEJ وتؤدي إلى تحرير الجينات - إدخال صغير وحذف واستبدال (الشكل 1C). بسبب آليات الإصلاح المعرضة للخطأ هذه ، حصلنا على أربع مجموعات من خلايا HeLa بالضربة القاضية الجينية. تم الكشف عن كفاءة نقل pX458-sgRNA باستخدام مقايسة التألق المناعي (الشكل 1D). استخرجنا أيضا الحمض النووي الجينومي لخلايا هيلا الضابطة والهدف 1 والهدف 2 (الشكل 1E) ، وقمنا بتضخيم الحمض النووي للموضع المستهدف ، وربطناها في pMD18-T لتسلسل الحمض النووي والتحقق من أنواع الطفرات (الشكل 1F). باختصار ، تم فحص ما يقرب من 100 نسخة وتم إنشاء أربع خلايا HELA مستقرة بالضربة القاضية CENP-E بنجاح ، بما في ذلك إدخال + 1 bp (الموضع 28 في Clone 1 و Clone 2) ، وحذف -7 bp (الموضع 1102-1108 في Clone 3) ، وحذف -1 bp (الموضع 1102 bp في Clone 4) (تسلسل ترميز CENP-E ، رقم انضمام بنك الجينات NM_001286734.2) (الشكل 1G ، H). أدت هذه الطفرات إلى طفرات إزاحة الإطار والتوقفات المبكرة ، مما أدى إلى الحذف الكامل لجين CENP-E في Clone 1/2 واثنين من طفرات CENP-E في خلايا Clone 3/4 HeLa.

لتحسين الكفاءة والنجاح التجريبي لتجارب خروج المغلوب CENP-E ، تم تطوير ثلاث استراتيجيات للشاشة قائمة على النمط الظاهري. استندت هذه إلى فحص مستعمرة الخلايا باستخدام مجهر تباين الطور (الشكل 2A) ، وعلى محاذاة الكروموسوم باستخدام تلطيخ DAPI (الشكل 2B) ، وعلى شدة مضان بروتينات CENP-E باستخدام مقايسة التألق المناعي (الشكل 2C). تضمنت الخطوات الحاسمة لنظام CRISPR / Cas9 استنساخ الحمض النووي الريبي التوجيهي ، ونقل pX458-sgRNA إلى خطوط الخلايا ، والحضانة لمدة 48 ساعة ، وتخفيف الخلايا إلى صفيحة 96 بئرا ، وحصاد الخلايا ، والفحص ، والتحقق من الصحة باستخدام ثلاث استراتيجيات قائمة على النمط الظاهري (الشكل 2D). أظهر تلطيخ التألق المناعي للمجموعات الضابطة و CENP-E-/- أن شدة التألق لبروتينات CENP-E قد تم التخلص منها تماما في خلايا CENP-E-/- Clone 1 وانخفضت بشكل ملحوظ في خلايا استنساخ 3 الطافرة CENP-E (الشكل 2E) ، مما يوضح أيضا فعالية الضربة القاضية الجينية بوساطة CRISPR / Cas9 ل CENP-E الجينات في خلايا هيلا. زادت نسب خلايا الطور الاستوائي مع اختلال الكروموسوم من 0.30 ± 0.21٪ في المجموعة الضابطة إلى 4.15 ± 0.57٪ في خلايا Clone 1 HeLa وإلى 5.85 ± 0.80٪ في خلايا Clone 3 HeLa (الشكل 2F). وفي الوقت نفسه ، زادت نسب خلايا الطور الاستوائي من 3.49 ± 0.47٪ في المجموعة الضابطة إلى 5.86 ± 0.57٪ خلايا CENP-E-/- Clone 1 وإلى 6.70 ± 0.77٪ في خلايا استنساخ 3 الطافرة CENP-E (الشكل 2G). بالإضافة إلى ذلك ، زادت نسبة خلايا الطور البيني بشكل طفيف في مجموعات Clone 1 و Clone 3 بعد حذف CENP-E مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 2H). انخفضت معدلات كل من خلايا الطور الأولي والطور الانفصالي والطور النهائي بشكل طفيف بعد حذف CENP-E ، في حين زادت معدلات خلايا الطور الاستوائي بعد حذف CENP-E (الشكل 2I). لمزيد من التحقيق في الأنماط الظاهرية لحذف CENP-E ، أجرينا تلطيخا مناعيا ل BubR1 ، وهو بروتين رئيسي لنقطة تفتيش تجميع المغزل ، ووجدنا أن توطين BubR1 كان غير طبيعي وأن تراكم الحركية ل BubR1 تأثر بشكل كبير في غياب CENP-E (الشكل 2J-L).

لفهم نمو الخلايا وقدرتها على الانتشار بشكل أفضل لخلايا HELA بالضربة القاضية CENP-E ، تم إجراء فحوصات تكوين المستعمرة وتلطيخ الكريستال البنفسجي لأربع خلايا CENP-E-/- HeLa ، بما في ذلك Clone 1 و Clone 2 و Clone 3 و Clone 4 cells (الشكل 3A ، B). يؤدي حذف CENP-E إلى انخفاض قدرة تكوين الاستنساخ ، وقطر مستعمرة أصغر ، وانخفاض عدد الخلايا في كل نسخة (الشكل 3A-D) ، مما يشير إلى أن CENP-E ضروري لتكوين الاستنساخ وتكاثر الخلايا. علاوة على ذلك ، استخدمنا 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -5- (3-كربوكسي ميثوكسي فينيل) -2- (4-سلفوفينيل) -2H-tetrazolium ، طريقة الملح الداخلي (MTS) وأجرينا فحوصات صلاحية الخلية ، ووجدنا أنه بالمقارنة مع 1.05 ± 0.00 في المجموعة الضابطة ، انخفضت قيم صلاحية الخلية إلى 0.66 ± 0.01 و 0.79 ± 0.00 في خلايا CENP-E-/- HeLa (الشكل 3E). لمزيد من التحقيق في أدوار CENP-E في استقرار الكروموسوم ، أجرينا تحضير الكروموسوم ، وتلطيخ Giemsa ، وتحليل النمط النووي ، ووجدنا انخفاضا في أعداد الكروموسومات من 67.09 ± 0.50 في خلايا HeLa من النوع البري إلى 56.08 ± 0.6 - 61.68 ± 0.83 في خلايا CENP-E- / - HeLa (الشكل 3F ، G). تشير هذه النتائج معا إلى أن حذف CENP-E يمنع بشكل كبير تكاثر الخلايا وتكوين المستعمرات وصلاحية الخلية ، مما يشير إلى أن CENP-E ضروري لنمو الخلايا وتكاثرها واستقرار الكروموسومات.

في هذه الدراسة ، تم تطوير خط خلية CENP-E بالضربة القاضية كأداة قيمة لتحديد مثبطات CENP-E الخاصة والتحقق من صحتها. تم وضع نهج مفيد للتحقق من خصوصية وسمية مثبطات CENP-E (الشكل 4). باستخدامGSK923295 24،25 كمثال ، قمنا بمعالجة خلايا HeLa من النوع البري وخطوط خلايا CENP-E-/- Clone 1 HeLa بسلسلة من تركيزات GSK923295 واستكشفنا كذلك آثار مثبطات CENP-E على هاتين الخليتين HeLa باستخدام مقايسات تكوين المستعمرة ومقايسات التألق المناعي (الشكل 4). خضعت الخلايا المفردة الملقحة في ألواح 6 آبار لفحوصات تكوين المستعمرة. تمت معالجة الخلايا بتركيزات مختلفة من GSK923295 وزراعتها لمدة 2-3 أسابيع ثم تم حصادها لمزيد من التحليل (الشكل 4A-D). بعد تلطيخ الكريستال البنفسجي ، تم قياس أقطار مستعمرة خلايا HeLa من النوع البري وخلايا CENP-E-/- باستخدام برنامج ImageJ. في خلايا هيلا من النوع البري ، انخفض تكوين المستعمرة بشكل ملحوظ بعد معالجة التركيزات المتزايدة من GSK923295. بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت أقطار المستعمرات أصغر بعد تثبيط CENP-E في خلايا HeLa من النوع البري (الشكل 4B-D). والجدير بالذكر أن خلايا CENP-E Knockout Clone 1 HeLa لم تظهر أي انخفاض كبير في أقطار الاستنساخ في وجود تركيزات مختلفة من GSK923295 ، مما يشير إلى أن GSK923295 مثبط محدد ليس له آثار كبيرة خارج الهدف ولا توجد آثار جانبية سامة واضحة في نطاق تركيز من 10 نانومتر إلى 10 ميكرومتر.

بعد ذلك ، تم فحص النمط الظاهري لمحاذاة الكروموسومات في خلايا HeLa من النوع البري وخلايا CENP-E-/- باستخدام مقايسة التألق المناعي (الشكل 4E). أظهر التحليل الكمي أن نسبة خلايا الطور الطوري زادت بشكل ملحوظ بعد معالجة 50 نانومتر و 100 نانومتر و 400 نانومتر و 2 ميكرومتر و 10 ميكرومتر GSK923295 (الشكل 4E ، F). بالإضافة إلى ذلك ، مقارنة بالزيادة الكبيرة في الكروموسومات المنحرفة في خلايا HeLa من النوع البري ، لم تتأثر خلايا CENP-E-/- Clone 1 HeLa بتركيزات مختلفة من GSK923295. مجتمعة ، خط خلية CENP-E-/- Clone 1 هو نوع معين من خط الخلايا المقاوم GSK923295 ، والذي لا يستجيب لمثبطات CENP-E بسبب حذف CENP-E والتكيف معه ، والتكرار الجيني34 ، وتأثيرات التعويض الجيني المحتملة35،36،37. توضح هذه النتائج أن خلية CENP-E-/- Clone 1 HeLa هي أداة قوية ومفيدة للتحقق من خصوصية مثبطات CENP-E وسميتها وآثارها الجانبية.

Figure 1
الشكل 1: بناء خلايا CENP-E-/- HeLa باستخدام نظام CRISPR/Cas9. (أ) الجدول الزمني للبروتوكول لبناء ناقلات كريسبر / كاس 9 ، والنقل ، وتشكيل استنساخ الخلية واختيارها ، وعمليات التحقق الوظيفية. الجدول الزمني لبناء خطوط خلايا CENP-E-/- ، بما في ذلك تصميم sgRNA ، وبناء بلازميد pX458-sgRNA ، وفحص الخلايا الطافرة. (ب) نموذج تخطيطي لاستنساخ sgRNA في متجه pX458 الخطي. تم اختيار Exon 1 و exon 13 من جين CENP-E في الكروموسوم 4 كمواقع مستهدفة. (ج) آليات نظام كريسبر/كاس 9 لتحرير الجينات. يولد DSB متبوعا بالانضمام النهائي غير المتماثل ثلاث طفرات عشوائية ، بما في ذلك الإدراج والحذف والاستبدال. (د) صور مضان تمثيلية لخلايا هيلا المنقولة باستخدام pX458-sgRNA1 (الهدف 1) و pX458-sgRNA2 (الهدف 2). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (ه) الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز التمثيلي للحمض النووي الجينومي في المجموعة الضابطة والهدف 1 والهدف 2. (ف-ح) نتائج تسلسل سانجر للمناطق المستهدفة في مجموعات التحكم و Clone 1 و Clone 3. تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الأمامية والخلفية المحددة للموضع المستهدف في خلايا Clone 1 و Clone 3 المعزولة. تم استنساخ شظايا الحمض النووي في ناقلات pMD18-T ونقلها إلى DH5α E. coli لتشكيل الاستنساخ وتسلسل سانجر. يتم عرض نتائج التسلسل التمثيلي. في خلايا Clone 1 HeLa ، كان هناك إدخال + 1 bp عند 28 bp. في خلايا Clone 2 HeLa ، كان هناك أيضا إدخال + 1 bp عند 28 bp. في Clone 3 ، كان هناك حذف -7 نقطة أساس عند 1,102-1,108 نقطة أساس. في Clone 4 ، كان هناك حذف -1 bp عند 1,102 bp. تؤدي هاتان الطفرتان إلى طفرة في إزاحة الإطار وتوقف سابق لأوانه في بروتينات CENP-E. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: استراتيجية الفحص القائمة على البناء والنمط الظاهري لخطوط خلايا HeLa الضربة القاضية بوساطة CRISPR / Cas9. (أ) تعتمد استراتيجية الفحص على مستعمرات الخلايا. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، أظهرت خلايا CENP-E بالضربة القاضية زيادة كبيرة في الخلايا المنقسمة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) تعتمد استراتيجية الفحص على محاذاة الكروموسومات. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، أظهرت خلايا CENP-E بالضربة القاضية زيادة في اختلال الكروموسوم. تم تحديد العديد من الكروموسومات بالقرب من قطب المغزل بعد حذف CENP-E. دابي ، الأزرق. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ج) تعتمد استراتيجية الفرز على شدة مضان بروتينات CENP-E. CENP-E ، أخضر. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (د) بناء نظام كريسبر / كاس 9. تم ربط sgRNA الخاص ب CENP-E في بلازميد pX458 وتسلسله للتحقق من صحته. تم نقل بلازميد pX458-sgRNA إلى خلايا HeLa باستخدام كاشف نقل وزرعه لمدة 48 ساعة. تم تحليل الخلايا باستخدام 0.25٪ من التربسين / EDTA ، وزرعها في صفيحة 96 بئرا ، واستزراعها لتشكيل مستعمرات الخلايا. (ه) صور التألق المناعي التمثيلية ل CENP-E و α-tubulin في المجموعة الضابطة و CENP-E-/-. دابي ، أزرق ؛ CENP-E ، أخضر ؛ α-توبولين ، أحمر. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (F) نسب خلايا الطور الاستوائي ذات الكروموسومات غير المحاذاة في المجموعة الضابطة ومجموعات CENP-E-/-. التحكم ، 0.30 ± 0.21٪ ، ن = 9 ؛ استنساخ 1 ، 4.15 ± 0.57٪ ، ن = 9 ؛ استنساخ 3 ، 5.85 ± 0.80٪ ، ن = 9. (ز) نسب خلايا الطور الاستوائي في المجموعة الضابطة ومجموعات CENP-E-/- . التحكم ، 3.49 ± 0.47٪ ، ن = 9 ؛ استنساخ 1 ، 5.86 ± 0.57٪ ، ن = 9 ؛ استنساخ 2 ، 6.70 ± 0.77٪ ، ن = 9. (ح) نسب الخلايا البينية الطور في مجموعتي التحكم و CENP-E-/-. السيطرة ، 70.08 ± 2.71٪ ، ن = 7 ؛ استنساخ 1 ، 86.77 ± 0.91٪ ، ن = 7 ؛ استنساخ 3 ، 87.67 ± 0.91٪ ، ن = 7. (I) تحليل مؤشر الانقسام لمجموعات التحكم و CENP-E-/- ، بما في ذلك نسب خلايا الطور الأولي والطور الاستوائي والطور الانفصالي والطور النهائي. (ي) صور التألق المناعي التمثيلية ل BubR1 و CENP-B في المجموعة الضابطة و CENP-E-/-. دابي ، أزرق ؛ BubR1 ، أخضر ؛ CENP-B ، أحمر. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (K) تحليل المسح الخطي ل BubR1 و CENP-B في مجموعات التحكم و CENP-E-/-. يشير المحور X إلى المسافة النسبية. يشير المحور Y إلى شدة التألق. (L) شدة التألق النسبية ل BubR1 (شدة مضان BubR1 عند شدة الحركية / التألق ل BubR1 في السيتوبلازم) في مجموعات التحكم و CENP-E-/-. التحكم ، 1.44 ± 0.10 ، ن = 16 ؛ استنساخ 1 ، 0.98 ± 0.07 ، ن = 18. بالنسبة لجميع الرسوم البيانية ، تم عرض متوسط ± SEM. في الشكل 2F-I ، اختبارات المقارنات المتعددة ل ANOVA Dunnett. NS ، ص > 0.05 ؛ ** ، ص < 0.01 ؛ ، ص < 0.001 ؛ ، ص < 0.0001. في الشكل 2L ، اختبار t للطالب غير المقترن. ، ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مقايسات نمو الخلايا لخلايا هيلا بالضربة القاضية CENP-E ، بما في ذلك تكوين مستعمرة الخلية ، ومقايسة صلاحية الخلية ، وتحليل النمط النووي. (أ) صور تمثيلية لمستعمرة الخلية في المجموعة الضابطة ومجموعات CENP-E-/- . شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B) تلطيخ الكريستال البنفسجي التمثيلي لمستعمرة الخلايا في مجموعات التحكم و CENP-E-/- . شريط المقياس = 1 سم. (C) عدد الخلايا لكل نسخة في مجموعات النوع البري (التحكم) و CENP-E-/- . النوع البري ، 81.97 ± 4.09 ، ن = 32 ؛ استنساخ 1 ، 31.52 ± 2.51 ، ن = 33 ؛ استنساخ 2 ، 13.97 ± 1.31 ، ن = 33. استنساخ 3 ، 48.48 ± 3.01 ، ن = 33 ؛ استنساخ 4 ، 33.39 ± 1.87 ، ن = 33. (د) تم قياس الصلاحية النسبية للخلية في مستعمرة الخلية عن طريق امتصاص الكريستال البنفسجي عند A600 nm. النوع البري ، 0.42 ± 0.00 ، ن = 6 ؛ استنساخ 1 ، 0.12 ± 0.00 ، ن = 6 ؛ استنساخ 2 ، 0.13 ± 0.00 ، ن = 6. استنساخ 3 ، 0.18 ± 0.00 ، ن = 6 ؛ استنساخ 4 ، 0.12 ± 0.00 ، ن = 6. (ه) صلاحية الخلية للمجموعات البرية ومجموعات CENP-E-/- باستخدام MTS ومقايسة صلاحية الخلية. النوع البري ، 1.05 ± 0.00 ، ن = 8 ؛ استنساخ 1 ، 0.77 ± 0.01 ، ن = 8 ؛ استنساخ 2 ، 0.67 ± 0.01 ، ن = 7. استنساخ 3 ، 0.79 ± 0.00 ، ن = 7 ؛ استنساخ 4 ، 0.66 ± 0.01 ، ن = 7. (F) أعداد الكروموسومات لكل خلية في النوع البري ومجموعات CENP-E-/- . النوع البري ، 67.09 ± 0.50 ، ن = 66 ؛ استنساخ 1 ، 61.68 ± 0.83 ، ن = 105 ؛ استنساخ 2 ، 56.08 ± 0.6 ، ن = 106. استنساخ 3 ، 61.28 ± 0.63 ، ن = 90 ؛ استنساخ 4 ، 64.18 ± 0.83 ، ن = 61. (ز) صور تمثيلية للكروموسوم المنتشر في المجموعة الضابطة ومجموعة CENP-E-/-. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. لجميع الرسوم البيانية ، اختبارات المقارنات المتعددة ل ANOVA Dunnett. أشرطة الخطأ ، تعني ± SEM. ** ، p < 0.01 ؛ ، ص < 0.001 ؛ ، ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: استخدام خلايا HELA بالضربة القاضية CENP-E للتحقق من خصوصية وسمية مثبطات CENP-E. (أ) تلطيخ الكريستال البنفسجي التمثيلي لمجموعات التحكم و CENP-E-/- بعد معالجة تركيزات مختلفة من GSK923295. شريط المقياس = 1 سم. (B) صور تمثيلية لمستعمرة الخلية في المجموعة الضابطة ومجموعات CENP-E-/- بعد العلاج بتركيزات مختلفة من GSK923295. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) أقطار مستعمرات الخلايا في المجموعة الضابطة بعد معالجة تركيزات مختلفة من GSK923295. التحكم ، 28.68 ± 0.85 ميكرومتر ، ن = 149 ؛ 10 نانومتر ، 25.40 ± 0.86 ميكرومتر ، ن = 223 ؛ 25 نانومتر ، 26.07 ± 0.68 ميكرومتر ، ن = 255 ؛ 50 نانومتر ، 26.41 ± 0.60 ميكرومتر ، ن = 180 ؛ 100 نانومتر ، 16.02 ± 0.32 ميكرومتر ، ن = 185 ؛ 200 نانومتر ، 15.61 ± 0.29 ميكرومتر ، ن = 185. د: أقطار مستعمرات الخلايا في مجموعات CENP-E-/- بعد معالجة تركيزات مختلفة من GSK923295. استنساخ 1 ، 17.64 ± 0.40 ميكرومتر ، ن = 230 ؛ 10 نانومتر ، 17.98 ± 0.39 ميكرومتر ، ن = 230 ؛ 25 نانومتر ، 15.03 ± 0.26 ميكرومتر ، ن = 230 ؛ 50 نانومتر ، 16.14 ± 0.32 ميكرومتر ، ن = 230 ؛ 100 نانومتر ، 21.13 ± 0.42 ميكرومتر ، ن = 230 ؛ 200 نانومتر ، 19.00 ± 0.40 سم ، ن = 230. (ه) صور تألق مناعي تمثيلية ل α-tubulin في المجموعة الضابطة و CENP-E-/- بعد المعالجة بتركيزات مختلفة من GSK923295 و DAPI والأزرق. α-توبولين ، أخضر. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (F) نسب خلايا الطور الاستوائي في المجموعة الضابطة و CENP-E-/- بعد المعالجة بتركيزات مختلفة من GSK923295. (G) نسب خلايا الطور الاستوائي ذات الكروموسومات غير المحاذاة في المجموعة الضابطة ومجموعات CENP-E-/- بعد العلاج بتركيزات مختلفة من GSK923295. لجميع الرسوم البيانية ، اختبارات المقارنات المتعددة ل ANOVA Dunnett. أشرطة الخطأ ، تعني ± SEM. ns ، p > 0.05 ؛ * ، ص < 0.05 ؛ ** ، ص < 0.01 ؛ ، ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kinesin-7 CENP-E هو منظم رئيسي في محاذاة الكروموسوم ونقطة تفتيش تجميع المغزل أثناء انقسام الخلايا17،19،20. عادة ما يؤدي الحذف الجيني ل CENP-E إلى تنشيط نقطة تفتيش تجميع المغزل ، وإيقاف دورة الخلية ، وموت الخلايا27،29،51،52. وبالتالي ، فإن بناء خطوط خلايا CENP-E المستقرة هو قضية مهمة لم يتم حلها في بيولوجيا CENP-E. في هذه الدراسة ، تم إنشاء خلايا HELA بالضربة القاضية CENP-E بنجاح باستخدام نظام CRISPR / Cas9. أنشأت هذه الدراسة ثلاث استراتيجيات فحص محسنة قائمة على النمط الظاهري - فحص مستعمرة الخلايا ، والأنماط الظاهرية لمحاذاة الكروموسومات ، وكثافة الفلورسنت لبروتينات CENP-E - مما يحسن بشكل كبير من كفاءة ومعدل نجاح خلايا CENP-E بالضربة القاضية.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذه الدراسة. أولا ، يعد تصميم sgRNA المحسن أمرا ضروريا لتقليل التأثيرات غير المستهدفة. ثانيا، يمكن أن يؤدي نقل بلازميدات كريسبر إلى الخلايا المستزرعة من خلال الكواشف القائمة على الدهون، أو التثقيب الكهربائي، أو نقل فيروس العدس إلى تحسين كفاءة النقل ونسب الخلايا القاضية للجينات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تطبيقات فرز الخلايا المنشطة بالفلورة53،54،55 واختيار البوروميسين56،57 من شأنها تسريع سرعة الشاشة وتقصير الفترة التجريبية. ثالثا ، يمكن التحقق من صحة الأنماط الظاهرية للضربة القاضية الجينية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ، واللطخة الغربية ، ومقايسات التألق المناعي ، وتسلسل الحمض النووي الجينومي. رابعا ، يمكن دراسة التحليل الوظيفي للأنماط الظاهرية بالضربة القاضية CENP-E باستخدام مجموعة متنوعة من المقايسات ، بما في ذلك مقايسات تكاثر الخلايا ، والتألق المناعي ، وتحليلات دورة الخلية ، والتصوير عالي الدقة.

بالمقارنة مع تقنيات تحرير الجينوم التقليدية ، مثل ZFNs و TALENs ، يظهر نظام CRISPR / Cas9 العديد من المزايا ، بما في ذلك البساطة والكفاءة العالية وسهولة التخصيص والتنوع وقدرةتعدد الإرسال 10. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع نطاق نظام CRISPR / Cas9 للفحص عالي الإنتاجية والمشاريع الهندسية واسعة النطاق58,59. كما تم تكييف نظام كريسبر / كاس 9 كتقنية فعالة لتحرير الجينات تتيح حدوث طفرات من خطوة واحدة في جينات متعددة60 ، مما يسرع دراسات الجينات الزائدة وظيفيا والجينات المتفاعلة والأمراض الوراثية متعددة الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحسين نظام CRISPR / Cas9 في كفاءته وتعدد استخداماته8. يمكن استخدام مسار HDR عالي الدقة ، وهو مسار رئيسي بديل لإصلاح الحمض النووي ، للتوسط في التحرير الدقيق للجينات في الموقع المستهدف في الخلايا المنقسمة في المستقبل10. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي النقل المشترك ل sgRNA المتعدد إلى حذف كبير وخروج كامل من CENP-E في الخلايا ، مما يحسن استقرار وموثوقية خلايا CENP-E بالضربة القاضية.

يتمثل أحد القيود الرئيسية لنظام CRISPR / Cas9 في أن SpCas9 عرضة للطفرات خارج الهدف ، والتي تستهدف أحيانا المواقع غير المقصودة في الجينوم وتؤدي إلى تأثيرات خارج الهدف. يمكن تقليل ذلك عن طريق تحسين تصميم دليل الحمض النووي الريبي ، وخوارزميات التنبؤ خارج الهدف ، وتسلسل الجينوم الكامل10,59. تم تطوير العديد من الأساليب ، بما في ذلك استخدام بروتينات Cas12a أو Cas13 البديلة53 ، واستخدام المحررين الأساسيين61 ، وتوصيل بروتينات Cas9 وتوجيه الحمض النووي الريبي12 ، لتقليل التأثيرات خارج الهدف. القيد الثاني هو أن العقدية المقيحة Cas9 (SpCas9) المستخدمة على نطاق واسع تتطلب 5'-NGG PAM المطلوبة للتعرف على المواقع المستهدفة ، مما يحد من اختيار المواقع المستهدفة ل SpCas9 في الجينومات. يمكن أن يؤدي تطوير متغيرات SpCas9 المصممة هندسيا والتي تتعرف على PAMs المريحة أو المتنوعة إلى زيادة النطاق المستهدف ل Cas9 في صندوق أدوات هندسة الجينوم CRISPR / Cas962،63،64. بالإضافة إلى ذلك ، في العديد من الحالات ، يؤدي نظام CRISPR / Cas9 إلى الفسيفساء وينتج عنه تعديلات مختلفة في مجموعات الخلايا65. قد تحفز بعض استجابة مناعية لبروتينات Cas9 ، مما يحد من تطبيقاتها في أنواع معينة12,66. على الرغم من هذه القيود ، يظل نظام CRISPR / Cas9 تقنية قوية لتحرير الجينات لتحرير الجينوم ودراسة وظائف الجينات في العلوم الأساسية والتكنولوجيا الحيوية والعلاج الجيني والطب.

تعد أنماط التفاعل والآليات الجزيئية ل CENP-E ومثبطاته مجالات بحثية مهمة في بيولوجيا الخلية وأبحاث السرطان. كشفت دراسات الطفرات الموجهة للموقع والبيولوجيا الجزيئية أن GSK923295 يتفاعل مع Ile182 و Thr183 ومع بروتينات CENP-E ، حيث يقع بين الحلزونات α2 و α3 وبالقرب من الحلقة 525. في هذه الدراسة ، تم إنشاء خط خلايا HeLa بالضربة القاضية CENP-E كأداة قيمة للتحقق من خصوصية وسمية مثبطات CENP-E. حتى الآن ، فإن مواقع وآليات الربط لمعظم مثبطات CENP-E ليست مفهومة جيدا. إن الجمع بين تصوير مطياف الكتلة الجزيئية67 ، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي68 ، والملاقط البصرية69 ، وتعديلات التركيب الجزيئي ، وعلم البلورات بالأشعة السينية70 ، والمجهر الإلكترونيبالتبريد 71،72 من شأنه أن يساهم في توضيح مواقع التفاعل وآليات تثبيط CENP-E. في المستقبل ، يمكن أن يؤدي التعديل المستهدف بوساطة الإصلاح الموجه بالتماثل ل CENP-E في مواقع محددة إلى توليد خلايا تحرير الجينات CENP-E ، مما سيساعد على الكشف عن مواقع وآليات الارتباط المحددة لمثبطات CENP-E.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

نشكر جميع أعضاء مختبر الهيكل الخلوي في جامعة فوجيان الطبية على المناقشات المفيدة. نشكر جون جين لين ، وتشي هونغ هوانغ ، ولينغ لين ، ولي لي بانغ ، ولين يينغ تشو ، وشي لين ، ومين شيا وو في مركز خدمات التكنولوجيا العامة ، جامعة فوجيان الطبية على مساعدتهم الفنية. نشكر Si-Yi Zheng و Ying Lin و Qi Ke في مركز التدريس التجريبي للعلوم الطبية الأساسية في جامعة فوجيان الطبية على دعمهم. تم دعم هذه الدراسة من خلال المنح التالية: المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 82001608 و 82101678) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (رقم المنحة 2019J05071) ، والصناديق المشتركة لابتكار العلوم والتكنولوجيا ، مقاطعة فوجيان ، الصين (رقم المنحة 2021Y9160) ، ومشروع تمويل بدء البحث العلمي للمواهب عالية المستوى بجامعة فوجيان الطبية (رقم المنحة XRCZX2017025).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

علم الأحياء ، العدد 196 ، ضربة قاضية CENP-E ، بروتين E المرتبط بالسنترومير ، Kinesin ، التقاط الأنابيب الدقيقة الحركية ، محاذاة الكروموسوم ، نقطة تفتيش تجميع المغزل ، خلايا HeLa ، الفحص القائم على النمط الظاهري ، اختلال الكروموسوم ، نقطة تفتيش الانقسام BUB1 سيرين / ثريونين كيناز B (BubR1) ، العيوب الانقسامية
توليد خطوط خلايا خروج المغلوب المرتبطة بالسنترومير <em>Protein-E CENP-E<sup>-/-</sup></em> باستخدام نظام كريسبر / كاس 9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang,… More

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J. L., Zhou, Y., He, J. J., Wu, S., Wei, Y. L., She, Z. Y. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter