이 논문은 CRISPR/Cas9 시스템과 세 가지 표현형 기반 스크리닝 전략을 사용하여 중심체 관련 단백질-E(CENP-E) 녹아웃 세포의 구축을 보고합니다. 당사는 CENP-E 녹아웃 세포주를 활용하여 약물 개발 및 생물학 연구에 유용한 CENP-E 억제제의 특이성과 독성을 검증하기 위한 새로운 접근법을 확립했습니다.
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방법 논문
CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout 세포주 생성
이 논문에서
요약
초록
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 다양한 유기체에서 정밀하고 효율적인 유전자 편집을 위한 강력한 도구로 부상했습니다. Centromere-associated protein-E(CENP-E)는 키네토코어-미세소관 포획, 염색체 정렬 및 스핀들 어셈블리 체크포인트에 필요한 플러스 말단 지향 키네신입니다. CENP-E 단백질의 세포 기능은 잘 연구되어 왔지만, CENP-E 절제는 일반적으로 방추체 어셈블리 체크포인트 활성화, 세포 주기 정지 및 세포 사멸로 이어지기 때문에 기존 프로토콜을 사용하여 CENP-E 단백질의 직접적인 기능을 연구하는 것은 어려웠습니다. 이 연구에서는 인간 HeLa 세포에서 CENP-E 유전자를 완전히 녹아웃하고 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 CENP-E-/- HeLa 세포를 성공적으로 생성했습니다.
세포 콜로니 스크리닝, 염색체 정렬 표현형, CENP-E 단백질의 형광 강도를 포함한 세 가지 최적화된 표현형 기반 스크리닝 전략이 수립되어 CENP-E 녹아웃 세포의 스크리닝 효율성과 실험 성공률을 효과적으로 개선했습니다. 중요하게도, CENP-E 결실은 염색체 부정합, BUB1 유사분열 체크포인트 세린/트레오닌 키나아제 B (BubR1) 단백질의 비정상적인 위치 및 유사분열 결손 귀착됩니다. 또한 CENP-E knockout HeLa 세포 모델을 활용하여 CENP-E 특이적 억제제에 대한 식별 방법을 개발했습니다.
이 연구에서는 CENP-E 억제제의 특이성과 독성을 검증하는 유용한 접근 방식이 확립되었습니다. 또한 이 논문은 세포 분열에서 CENP-E의 메커니즘을 조사하는 강력한 도구가 될 수 있는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 CENP-E 유전자 편집 프로토콜을 제시합니다. 또한 CENP-E 녹아웃 세포주는 항종양 약물 개발, 세포 생물학의 세포 분열 메커니즘 연구 및 임상 적용에 중요한 영향을 미치는 CENP-E 억제제의 발견 및 검증에 기여할 것입니다.
서론
조작된 게놈 편집은 다양한 세포와 유기체에서 유전자의 표적 변형을 매개합니다. 진핵생물에서, 부위 특이적 돌연변이 유발은 표적 DNA의 상동 재조합을 자극하는 서열 특이적 뉴클레아제의 응용에 의해 도입될 수있다 1. 최근 몇 년 동안 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)2,3, 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)4,5 및 귀환 메가뉴클레아제(6,7)를 포함한 여러 게놈 편집 기술이 특정 부위에서 게놈을 절단하도록 설계되었지만 이러한 접근 방식에는 복잡한 단백질 엔지니어링과 중복 실험 절차가 필요합니다. 학문은 유형 II 원핵생물 군집된 규칙적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)/Cas 체계가 특히 다양한 세포 및 종 8,9,10,11에 있는 RNA 인도한, 위치 특정한 DNA 절단을 중재하는 능률적인 유전자 편집 기술이다는 것을 보여주었습니다.
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프로토콜
1. CRISPR/Cas9 유전자 knockout 벡터의 구성
- 인간 CENP-E 유전자의 표적 게놈 DNA 염기서열을 선택합니다(GenBank Accession No. NM_001286734.2) 온라인 CRISPR 설계 도구(http://crispor.tefor.net/)를 사용하여 sgRNA를 설계합니다.
- 단일 게놈 염기서열을 입력하고, "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148"의 게놈을 선택하고, protospacer 인접 모티프 "20 bp-NGG-spCas9"를 선택한다. 특이성 점수50, 예측 효율10 및 최소 off-target에 따라 sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' 및 sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGGCTC-3'을 포함한 두 개의 가이드 서열을 선택합니다.
- 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드(ssODN)를 주문하고 합성합니다. dH2O의 ssODN을 최종 농도 10....
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결과
CENP-E-/- HeLa 세포는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 성공적으로 생성되었습니다(그림 1). 이 방법의 타임라인과 중요한 실험 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 먼저, CENP-E 특이적 sgRNA를 설계 및 합성하고, sgRNA를 pX458 플라스미드에 어닐링 및 접합하고, 플라스미드를 HeLa 세포로 transfection하고, 48시간 동안 배양했습니다. 형질주입된 세포를 해리시키고 연속 희석액을 사용하여 96웰 플레이트에 파종했습니다(그림 1A). 단일 콜로니를 선택하고 세 가지 표현형 기반 전략을 사용하여 스크리닝했습니다. 돌연변이 유형과 CENP-E knockout 세포는 PCR, Sanger 염기서열분석 및 면역형광 분석을 사용하여 검증되었습니다(
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토론
Kinesin-7 CENP-E는 세포 분열 17,19,20 중 염색체 정렬 및 방추체 조립 체크포인트의 핵심 조절자입니다. CENP-E의 유전적 결실은 일반적으로 방추체 조립 체크포인트, 세포주기 정지 및 세포 사멸의 활성화를 초래합니다 27,29,51,52. 따라서 안정적인 CENP-E knockout 세포주의 구축은 CENP-E 생물학에서 해결되지 않은 중요한 문제입니다. 이 연구에서 CENP-E 녹아웃 HeLa 세포는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 성공적으로 생성되었습니다. 이 연구는 CENP-E
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
유익한 토론을 해주신 Fujian Medical University의 세포골격 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다. 기술 지원을 제공해 주신 Fujian Medical University Public Technology Service Center의 Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin, Min-Xia Wu에게 감사드립니다. Fujian Medical University의 기초 의학 실험 교육 센터의 Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(보조금 번호 82001608 및 82101678), 중국 푸젠성 자연과학재단(보조금 번호 2019J05071), 중국 푸젠성 과학기술혁신공동기금(보조금 번호 2021Y9160), 푸젠 의과대학 고급 인재 과학 연구 창업 자금 지원 프로젝트(보조금 번호 XRCZX2017025)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.5 mL 원심분리기 튜브 | Axygen | MCT-150-C | |
| 24웰 플레이트 | Corning | 3524 | |
| 4S 젤레드, 10,000x 수중 | Sangon Biotech (Shanghai) | A616697 | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Corning | 430828 | |
| 6 cm 페트리 디쉬 | 코닝 | ||
| 430166 95% 에탄올 | Sinopharm 화학 시약 | 10009164 | |
| 96웰 플레이트 | Corning | 3599 | |
| 아세트산 | Sinopharm 화학 시약 | 10000218 | H2O에 용해하여 10% 작업 용액을 준비합니다. |
| Agarose | Sangon Biotech(상하이) | A620014 | |
| Alexa Fluor 488 표지 염소 안티 마우스 IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | 용. 1% BSA/PBST에 용해됩니다. 1:500 희석. |
| Alexa Fluor 488 표지 염소 안티 토끼 IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | 면역 형광용. 1% BSA/PBST에 용해됩니다. 1:500 희석. |
| Alexa Fluor 555 표지 당나귀 안티 마우스 IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | 면역형광용. 1% BSA/PBST에 용해됩니다. 1:500 희석. |
| 무수 에탄올 | Sinopharm 화학 시약 | 100092690 | |
| Anti-BubR1 토끼 단클론 항체 | Abcam | ab254326 | 면역 형광용. 1% BSA/PBST에 용해됩니다. 1:100 희석 |
| Anti-CENP-B 마우스 단클론 항체 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | 면역 형광용. 1% BSA/PBST에 용해됩니다. 1:50 희석. |
| 항-CENP-E 토끼 단클론 항체 | Abcam | ab133583 | 면역형광용. 1% BSA/PBST에 용해됩니다. 1:100 희석. |
| 페이드 방지 장착 매체 | Beyotime | P0131 | 형광 신호의 담금질 속도를 늦춥니다. |
| 항 알파; - 튜불린 마우스 단일 클론 항체 | Abcam | ab7291 | 면역 형광. 1% BSA/PBST에 용해됩니다. 1:100 희석. |
| Biotek Epoch 마이크로플레이트 분광 광도계 | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sinopharm 화학 시약 | 69003435 | |
| BpiI(BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
| CellTiter 96 수용액 세포 증식 분석 | Promega | G3580 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Colchicine | Sinopharm 화학 시약 | 61001563 | |
| 컨포칼 스캐닝 현미경 | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Coverslip | CITOTEST | 80344-1220 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| DH5α 유능한 세포 | Sangon Biotech(상하이) | B528413 | |
| DL2000 DNA marker | TaKaRa | 3427A | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Endo-free plasmid mini kit  | Omega | D6950 | |
| Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
| 용담 바이올렛 | Sinopharm 화학 시약 | 71019944 | PBS에 용해하여 0.1% 용담 바이올렛/PBS를 제조합니다. |
| Giemsa 염색 용액 | Sinopharm 화학 시약 | 71020260 | |
| GraphPad Prism 버전 8.0 소프트웨어 | GraphPad | www.graphpad.com | 통계 분석. |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| HeLa 세포주 | ATCC | CCL-2 | |
| 가습 인큐베이터 | Heal Force | HF90/HF240 | |
| Image J 소프트웨어 | , National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | 이미지 처리 및 분석. |
| 반전 현미경 | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
| LB 아가 분말 | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
| Lipo6000 transfection 시약 | Beyotime | C0526 | |
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| Opti-MEM 감소 세럼 매체 | Gibco | 31985070 | |
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| SanPrep 컬럼 DNA 젤 추출 키트 | Sangon Biotech (상하이) | B518131 | |
| SanPrep 칼럼 플라스미드 미니 프렙 kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
| T4 DNA 리가제 | TaKaRa | 2011A | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 | TaKaRa | 2021A | |
| TaKaRa Ex | Taq TaKaRa | RR001A | |
| Triton X-100 | Sinopharm 화학 시약 | 30188928 | PBS에 용해하여 0.25% Triton X-100/PBS를 제조합니다. |
| Tween 20 | Sinopharm 화학 시약 | 30189328 | PBS에 용해시켜 0.1% Tween 20/PBS를 제조합니다. |
참고문헌
- Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
- Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases.<....
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