Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65476
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

Abstract

CRISPR (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar) / Cas9 sistemi, çeşitli organizmalarda hassas ve verimli gen düzenleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Sentromer ile ilişkili protein-E (CENP-E), kinetokor-mikrotübül yakalama, kromozom hizalaması ve mil montaj kontrol noktası için gerekli olan artı uca yönelik bir kinesindir. CENP-E proteinlerinin hücresel fonksiyonları iyi çalışılmış olmasına rağmen, CENP-E proteinlerinin doğrudan fonksiyonlarını geleneksel protokoller kullanarak incelemek zor olmuştur çünkü CENP-E ablasyonu genellikle iğ montaj kontrol noktası aktivasyonuna, hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne yol açar. Bu çalışmada, insan HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık ve CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E-/- HeLa hücrelerini başarıyla ürettik.

Hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere, CENP-E nakavt hücrelerinin tarama verimliliğini ve deneysel başarı oranını etkili bir şekilde artıran üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Önemli olarak, CENP-E delesyonu, kromozomun yanlış hizalanmasına, BUB1 mitotik kontrol noktası serin / treonin kinaz B (BubR1) proteinlerinin anormal konumuna ve mitotik kusurlara neden olur. Ayrıca, CENP-E'ye özgü inhibitörler için bir tanımlama yöntemi geliştirmek için CENP-E nakavt HeLa hücre modelini kullandık.

Bu çalışmada, CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yararlı bir yaklaşım oluşturulmuştur. Ayrıca, bu makale, hücre bölünmesinde CENP-E mekanizmalarını araştırmak için güçlü bir araç olabilecek CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E gen düzenleme protokollerini sunmaktadır. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hattı, antitümör ilaç geliştirme, hücre biyolojisinde hücre bölünme mekanizmaları çalışmaları ve klinik uygulamalar için önemli etkileri olan CENP-E inhibitörlerinin keşfine ve doğrulanmasına katkıda bulunacaktır.

Introduction

Tasarlanmış genom düzenleme, çeşitli hücrelerde ve organizmalarda genlerin hedeflenen modifikasyonlarına aracılık eder. Ökaryotlarda, bölgeye özgü mutajenez, hedef DNA1'in homolog rekombinasyonunu uyaran diziye özgü nükleazların uygulanmasıyla tanıtılabilir. Son yıllarda, çinko parmak nükleazları (ZFN'ler)2,3, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler)4,5 ve güdümlü meganükleazlar 6,7 dahil olmak üzere çeşitli genom düzenleme teknolojileri, genomları belirli bölgelerde parçalamak için tasarlanmıştır, ancak bu yaklaşımlar karmaşık protein mühendisliği ve gereksiz deneysel prosedürler gerektirir. Çalışmalar, tip II prokaryotik kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas sisteminin, çok çeşitli hücrelerde ve türlerdeRNA kılavuzlu, bölgeye özgü DNA bölünmesine spesifik olarak aracılık eden verimli bir gen düzenleme teknolojisi olduğunu göstermiştir 8,9,10,11. CRISPR/Cas9 gen nakavt teknolojisi, temel biyoloji, biyoteknoloji ve tıp alanlarında devrim yarattı12.

Bakteriler ve çoğu arke, virüsleri ve plazmitleri tanımlamak ve yok etmek için CRISPR ve Cas proteinlerini kullanan RNA tabanlı bir adaptif bağışıklık sistemi geliştirmiştir13. Streptokok pyogenes Cas9 (SpCas9) endonükleaz, CRISPR RNA'ları (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) içeren sentetik bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sağlayarak diziye özgü, çift sarmallı kırılmalara (DSB'ler) verimli bir şekilde aracılık edebilen RuvC benzeri Holliday bağlantı resolvazı (RuvC) ve His-Asn-His (HNH) alanını içerir14,15,16. DSB'ler, memeli hücrelerinde insersiyonlar, delesyonlar veya yara izi olmayan tek nükleotid ikameleri dahil olmak üzere çoklu mutasyonları ortaya çıkaran indel oluşturan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu ile onarılabilir 1,8. Hem hataya eğilimli NHEJ hem de yüksek kaliteli HDR yolu, çerçeve kayması mutasyonlarına ve erken durdurma kodonlarına neden olabilen eklemeler veya silmeler yoluyla gen nakavtına aracılık etmek için kullanılabilir10.

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi sırasında kinetokor-mikrotübül bağlanması ve kromozom hizalaması için gereklidir 17,18,19. CENP-E'nin antikor mikroenjeksiyonu20,21, siRNA tükenmesi22,23, kimyasal inhibisyon 24,25,26 ve genetik delesyon 27,28,29, kromozom yanlış hizalanmasına, iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonuna ve mitotik defektlere yol açar, bu da anöploidi ve kromozomal instabilite ile sonuçlanır19,30. Farelerde, CENP-E delesyonu, gelişimin çok erken aşamalarında anormal gelişim ve embriyonik ölümcüllük ile sonuçlanır 27,29,31. CENP-E'nin genetik silinmesi genellikle kromozomun yanlış hizalanmasına ve hücre ölümüne yol açar 26,27,29, bu da CENP-E proteinlerinin işlevlerini ve mekanizmalarını incelemede bir engeldir.

Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CENP-E proteinlerinin nispeten kısa sürede hızlı bir şekilde parçalanmasını sağlayan bir Auxin ile indüklenebilir CRISPR / Cas9 gen düzenleme yöntemi32 kullanarak koşullu bir CENP-E nakavt hücre hattı oluşturmuştur33. Bununla birlikte, bugüne kadar, CENP-E biyolojisinde çözülmemiş bir teknik zorluk olan kararlı CENP-E nakavt hücre hatları kurulmamıştır. CENP-E'nin tamamen silinmesinin doğrudan sonuçları karmaşık ve öngörülemez olabileceğinden, genetik sağlamlık34, genetik kompanzasyon yanıtları 35,36,37 ve karmaşık hücre içi ortamlar göz önüne alındığında, kromozom hizalama mekanizmalarının araştırılması için CENP-E nakavt hücre hatlarının oluşturulması önemlidir.

CENP-E inhibitörlerinin keşfi ve uygulamaları kanser tedavisi için önemlidir. Bugüne kadar, GSK923295 ve türevleri24,25, PF-277138,39, imidazo [1,2-a] piridin iskele türevleri40,41, bileşik-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 ve benzo [d] pirolo [2,1-b] tiazol türevleri47 dahil olmak üzere yedi tip CENP-E inhibitörü bulunmuş ve sentezlenmiştir. Bu inhibitörler arasında GSK923295, CENP-E'nin motor alanına bağlanan ve CENP-E mikrotübül ile uyarılan ATPaz aktivitesini 3.2 ila 0.2 nM24,25'lik bir Ki ile inhibe eden allosterik ± etkili bir CENP-E inhibitörüdür. Bununla birlikte, GSK923295'nin kültürlenmiş kanser hücreleri üzerindeki inhibitör etkileri ile karşılaştırıldığında, klinik kanser hastalarında GSK923295 terapötik etkileri ideal değildir48,49, bu da CENP-E için GSK923295 özgüllüğü konusunda endişeleri artırmıştır. Ayrıca, diğer CENP-E inhibitörlerinin CENP-E proteinleri üzerindeki özgüllüğü ve yan etkileri, kanser araştırmalarında kilit konulardır.

Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık. CENP-E gen düzenlemesinin tarama verimliliğini ve başarı oranını artırmak için hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere optimize edilmiş üç fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hatları, CENP-E için aday bileşiklerin özgüllüğünü test etmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. CRISPR/Cas9 gen nakavt vektörlerinin oluşturulması

  1. İnsan CENP-E genindeki hedef genomik DNA dizisini seçin (GenBank Erişim No. NM_001286734.2) ve çevrimiçi bir CRISPR tasarım aracı (http://crispor.tefor.net/) kullanarak sgRNA'yı tasarlayın.
  2. Tek bir genomik dizi girin, "Homo sapiens-insan-UCSC Aralık 2013 (hg38 analiz seti) + tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler): dbSNP148" genomunu seçin ve "20 bp-NGG-spCas9" protospacer bitişik motifini seçin. Özgüllük skorları50, tahmin edilen verimlilik10 ve minimum hedef dışı değerlere göre sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' ve sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGCTC-3' dahil olmak üzere iki kılavuz dizisi seçin.
  3. Tek sarmallı DNA oligonükleotidlerini (ssODN'ler) sıralayın ve sentezleyin. ssODN'leri ddH2O'da100 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne sgRNA oligolarını fosforile etmek ve tavlamak için 1 μL ileri oligo, 1 μL ters oligo, 0.5 μL T4 polinükleotid kinaz, 1 μL T4 polinükleotid kinaz tamponu ve 6.5 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve tüpü 37 °C'de 30 dakika, 95 °C'de 5 dakika inkübe edin; daha sonra 5 °C dk-1'de 25 °C'ye kadar rampa yapın.
  4. Bbs kısıtlama enzimini kullanarak pX458 plazmitiniEquation 1 sindirin. 1 μg pX458 plazmid, 2 μL 10x tampon G, 1 μL BbsEquation 1 ekleyin ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne RNaz içermeyen ddH2O'yu 20 μL'ye ekleyin. Tüpü 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Ardından, üreticinin protokollerine göre kolon DNA jel ekstraksiyon kitini kullanarak doğrusal plazmidi saflaştırın.
  5. sgRNA oligolarını pX458 plazmidine bağlayın (pSpCas9(BB)-2A-yeşil floresan protein (GFP) plazmidi, Addgene ID. 48138). 1 μL tavlanmış oligonükleotid, 25 ng lineer plazmit, 1 μL 10x T4 DNA ligasyon tamponu, 0.5 μL T4 DNA ligaz (350 U/μL) ekleyin ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde ddH2Oile 10 μL'ye kadar yapın. Ligasyon çözeltisini 16 °C'de 2 saat inkübe edin.
  6. Oluşturulan plazmitin 10 μL'sini yetkin DH5α hücreleri ile buz üzerinde 30 dakika, 42 °C'de 45 saniye ısı şoku ile inkübe edin ve hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 500 μL Luria-Bertani (LB) ortamı ekleyin ve hücreleri ampisilin (100 μg / mL) içeren bir LB plakasına tohumlayın. 37 ° C'de 16 saat inkübe edin ve dirençli klonları eleyin.
  7. Sterilize edilmiş bir pipet ucu ile 5-10 tek koloni seçin ve bunları ampisilinli (100 μg/mL) 1 mL LB ortam kültürüne aktarın. Kültürü 37 °C'de inkübe edin ve 180 rpm'de 12-16 saat çalkalayın.
  8. Üreticinin protokollerine göre bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmit DNA'yı izole edin. U6-Fwd primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' kullanarak U6 promotör bölgesinden Sanger dizilimi ile her koloninin plazmit DNA'sını doğrulayın.
  9. Üreticinin protokollerine göre endo-içermeyen plazmid DNA kitini kullanarak plazmitleri ekstrakte edin ve saflaştırın.

2. CENP-E nakavt HeLa hücrelerinin transfeksiyonu, izolasyonu ve taranması

  1. Dulbecco Modifiye Eagle's Medium'daki (DMEM) kültür HeLa hücreleri, %5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiştir.
  2. HeLa hücrelerini %0.25 tripsin/etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) kullanarak 37 °C'de 2-3 dakika inkübe edin, hücreleri nazikçe pipetleyerek ayırın ve ardından hücreleri hücre geçişi için 1:4 seyreltme oranında yeni plakalara tohumlayın.
  3. Hücreleri 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve transfeksiyondan önce% 60-70 birleşmeye kadar kültürleyin. pX458-sgRNA plazmitlerini, üreticinin protokollerine göre referans verilen reaktifleri kullanarak HeLa hücrelerine aktarın (Malzeme Tablosuna bakın).
    1. Tüp A'da 1 μg doğrulanmış pX458-sgRNA plazmidi ve 50 μL indirgenmiş serum ortamını nazikçe karıştırın. Daha sonra, 2 μL transfeksiyon reaktifi ve 50 μL indirgenmiş serum ortamını B tüpünde nazikçe karıştırın.
    2. Hem tüp A'yı hem de tüp B'yi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Karışımı 12 oyuklu bir plakaya ekleyin, hücreleri 6 saat inkübe edin ve ortamı taze bir DMEM ortamı ile değiştirin.
  4. Transfeksiyon verimliliği için bir floresan mikroskobu kullanarak 24 saat veya 48 saat sonra HeLa hücrelerini inceleyin. 48 saat boyunca transfeksiyondan sonra, transfekte edilen HeLa hücrelerini 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin / EDTA kullanarak tamamen ayırın, bir Neubauer odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve hücreleri, seri seyreltme yöntemlerine göre her transfekte edilen popülasyon için üç ayrı 96 oyuklu plakaya yerleştirin10.
  5. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatöre geri koyun ve ardından 1-2 hafta daha kültürleyin. Kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin. CENP-E nakavtının fenotipe dayalı taraması ve doğrulanması için, hücreleri 5-7 gün boyunca 24 oyuklu veya 12 oyuklu plakalarda ayırın ve genişletin.
  6. 10x ve 20x objektif lenslerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak daha küçük hücre kolonisi çaplarına sahip mutant hücreleri tarayın.
    NOT: CENP-E mutasyonları genellikle hücre kolonilerindeki bölünen hücrelerin sayısında önemli bir artışa neden olur, bu da CENP-E mutant hücrelerinin taranması için anahtar göstergelerden biri olabilir.
  7. Üreticinin protokollerine göre sütun hayvan genomik DNA ekstraksiyon kitini kullanarak DNA ekstraksiyonu için hücreleri hasat edin. PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0.25 μL Taq polimeraz, 5 μL 10x tampon (Mg2+ plus), 4 μL dNTP karışımları, 500 ng DNA şablonu, 1 μL ileri oligo, 1 μL ters oligo ve ddH2O'yu 50 μL'ye ayarlayın. Gen amplifikasyonu için aşağıdaki PCR program ayarlarını kullanın: 98 °C, 10 sn; 33 döngü için 98 °C, 10 sn, 55 °C, 30 sn, 72 °C, 60 sn; 72 °C, 10 dakika ve ardından 4 °C'de tutun.
    NOT: Hedef lokusun klonlanması için spesifik primerler aşağıdaki gibi listelenmiştir: CENP-E hedef F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E hedefi R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E hedefi F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E hedefi R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Hedef DNA'yı üreticinin protokollerine göre pMD18-T vektörüne bağlayın. Bağlanmış plazmiti yetkin DH5α hücrelerine ve klonların seçimi için kültüre aktarın.
  9. CENP-E nakavt türlerini belirlemek için Sanger sıralaması gerçekleştirin. Üreticinin protokollerine göre bir plazmit ekstraksiyon kiti kullanarak plazmit DNA'yı izole edin. M13 ileri ve geri primerlerini kullanarak her koloninin plazmit DNA'sının Sanger dizilimini gerçekleştirin. M13F astar, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R astar, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Yabani tip ve CENP-E mutant HeLa hücrelerini, sırasıyla 24 oyuklu bir plakada 12 mm'lik cam lameller üzerine tohumlayın. DMEM ortamının tamamını çıkarın ve hücreleri% 4 paraformaldehit / fosfat tamponlu salin (PBS) fiksatif çözeltisinde oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.
  11. Çekirdekleri oda sıcaklığında 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ile 5 dakika boyayın. Plan Fluor 40x/ Numerical Aperture (NA) 0.75 objektif ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak kromozom hizalama fenotipine dayalı olarak CENP-E mutant hücrelerini tarayın ve doğrulayın.
  12. CENP-E proteinlerinin immünofloresan boyama ve analizini (bkz. bölüm 3) kullanarak CENP-E nakavt hücrelerini tarayın ve doğrulayın.

3. İmmünofloresan boyama ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi

  1. Hücreleri %4 paraformaldehit/PBS fiksatif solüsyonu ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin ve 2 x 5 dakika 1x PBS'ye daldırın.
    NOT: Metafaz hücre ayrılmasını önlemek için hücrelerin sağlıklı durumda olduğundan ve hücrelerin nazikçe toplanıp sabitlendiğinden emin olun.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında %0.25 Triton X-100/PBS ile 10 dakika geçirgen hale getirin ve 2 x 5 dakika boyunca 1x PBS'ye daldırın.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 BSA/PBST (PBS'de %0.1 Tween 20) ile bloke edin. Primer antikorları %1 BSA/PBST ile seyreltin ve numuneleri 4 °C'de 12 saat inkübe edin.
  4. Birincil antikor çözeltilerini atın, hücreleri 3 x 5 dakika 1x PBS ile durulayın ve hücreleri seyreltilmiş ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  5. İkincil antikorları atın ve hücreleri 1x PBS'de 3 x 5 dakika durulayın.
  6. Çekirdekleri DAPI ile oda sıcaklığında 5 dakika boyayın. Kızakları montaj ortamıyla monte edin. Slaytları oje ile kapatın.
  7. 63x/NA 1.40 objektif ile donatılmış bir taramalı konfokal mikroskop kullanarak floresan görüntülerini gözlemleyin ve kaydedin.

4. Kromozom hazırlama ve karyotip analizi

  1. Yabani tip ve CENP-E-/- HeLa hücrelerini, 24 saat boyunca% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tam DMEM ortamında kültürleyin ve daha sonra, vahşi tip ve CENP-E-/- HeLa hücrelerini 5 saat boyunca 300 nM kolşisin ile inkübe edin.
  2. Hücreleri %0.25 tripsin/EDTA ile 37 °C'de 3 dakika inkübe edin ve hücreleri 1.5 mL santrifüj tüplerinde toplayın.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanları atın, 1.2 mL 0.075 mol / L KCl çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  4. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanları atın, ön fiksasyon için 0.2 mL fiksatif çözelti (metanol: buzlu asetik asit = 3: 1) ekleyin ve 1 dakika boyunca hafifçe karıştırın.
  5. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin, peletleri toplayın, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.5 mL fiksatif çözelti ekleyin ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanları atın, 0.6 mL fiksatif çözelti ekleyin ve bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Buz kaydıraklarının üzerine 35-40 cm yükseklikten 3-5 damla hücre süspansiyonu ekleyin.
    NOT: Hücre süspansiyonlarını kızaklara bırakmak için yüksekliği 35-40 cm'de tutun; Aksi takdirde, kromozomlar çok dağınık olabilir veya birbirinden ayrılmayabilir.
  7. Slaytları hemen bir alkol lambası ile kurulayın, numuneleri %10 Giemsa boyama solüsyonu ile 7 dakika boyayın, slaytları 2 dakika akan su ile durulayın ve Plan Fluor 40x/NA 0.75 objektif ile donatılmış bir ışık mikroskobu kullanarak numuneleri gözlemleyin.

5. Hücre kolonisi oluşum testi

  1. Hücre süspansiyonlarını 6 oyuklu plakalarda 1.000-2.000 hücre/kuyu hücre yoğunluğunda hazırlayın. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın.
  2. 6 oyuklu plakaları bir CO2 inkübatörüne yerleştirin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 2-3 hafta inkübe edin. Kültür ortamını her 5 günde bir değiştirin. 10x ve 20x objektif lenslerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görüntüleri kaydedin. Koloniler göründüğünde hücreleri hasat edin (bir klon içindeki yüzlerce hücre).
  3. GSK923295 etkilerini incelemek için, hücreleri 6 oyuklu plakalarda 24 saat boyunca kültürleyin ve 10, 25, 50, 100 ve 200 nM'lik son konsantrasyonlarda 2 mL GSK923295 ekleyin.
    NOT: Yeni klonlar oluşturabilecek ve transfekte edilmiş hücrelerin taranmasını etkileyebilecek hücre dökülmesini önlemek için kültür kabını klon oluşumunun erken aşamasında hareket ettirmeyin.
  4. Kültür ortamını atın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 PFA ile sabitleyin. Kolonileri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.1 kristal viyole boyama solüsyonu ile boyayın. Numuneleri 1x PBS ile üç kez durulayın. ImageJ yazılımını kullanarak hücre kolonilerinin görüntülerini kaydedin ve her koloninin çaplarını ölçün. Düz çizgi seçim aracını seçin, Analiz Et'e tıklayın, Ölç'ü seçin ve uzunluğu kaydedin.
  5. Kolonileri 1 mL% 10 asetik asit çözeltisi ile 5 dakika durulayın. 200 μL'lik süpernatan çözeltileri 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve A600 nm'de bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak absorbans değerlerini ölçün.

6. Hücre canlılığı testi

  1. Hücreleri 24 oyuklu plakalara tohumlayın ve hücreleri 48 saat ila% 80-90 yoğunlukta kültürleyin.
  2. Hücreleri 100 μL% 0.25 tripsin / EDTA ile 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
  3. 400 μL PBS'yi bir pipet tabancası ile hücrelerle karıştırın. 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu plakaya aktarın.
  4. Her bir oyuğa 317 μg/mL nihai konsantrasyona sahip 20 μL MTS çözeltisi ekleyin ve üreticinin protokollerine göre hafifçe karıştırın. Numuneleri bir CO2 inkübatöründe 1-3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak her bir kuyucuğun absorbans değerlerini A490 nm'lik absorbans zirvesinde kaydedin. Hücre kalıntısı ve spesifik olmayan absorbansın katkıda bulunduğu arka planı çıkarmak için A630 nm'lik bir referans dalga boyu kullanın (Hücre canlılığı = A490nm- A630 nm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CENP-E-/- HeLa hücreleri, CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak başarıyla üretildi (Şekil 1). Bu yöntemin zaman çizelgesi ve kritik deneysel adımları Şekil 1'de gösterilmektedir. İlk olarak, CENP-E'ye özgü sgRNA'ları tasarladık ve sentezledik, sgRNA'ları tavladık ve pX458 plazmidine bağladık, plazmiti HeLa hücrelerine transfekte ettik ve 48 saat boyunca kültürledik. Transfekte edilen hücreler ayrıştırıldı ve seri dilüsyonlar kullanılarak 96 oyuklu bir plakaya tohumlandı (Şekil 1A). Tek koloniler seçildi ve üç fenotip tabanlı strateji kullanılarak tarandı. Mutasyon tipleri ve CENP-E nakavt hücreleri, PCR, Sanger dizileme ve immünofloresan testleri kullanılarak doğrulandı (Şekil 1A). CENP-E geninin ekzon 1 ve ekzon 13'ü, kromozom 4'te hedefleme bölgeleri olarak seçildi (Şekil 1B). CRISPR / Cas9 sistemi, NHEJ yollarını tetikleyen ve gen düzenleme-küçük ekleme, silme ve ikame ile sonuçlanan RuvC ve HNH endonükleaz alanlarını kullanarak protospacer bitişik motif (PAM) dizilerine proksimalde DSB'leri indükleyebilir (Şekil 1C). Bu hataya açık onarım mekanizmaları nedeniyle, dört gen nakavt HeLa hücre popülasyonu elde ettik. pX458-sgRNA'nın transfeksiyon etkinliği, bir immünofloresan testi kullanılarak tespit edildi (Şekil 1D). Ayrıca kontrol, hedef 1 ve hedef 2 HeLa hücrelerinin genomik DNA'sını çıkardık (Şekil 1E), hedef lokusun DNA'sını çoğalttık ve DNA dizilimi ve mutasyon tiplerinin doğrulanması için bunları pMD18-T'ye bağladık (Şekil 1F). Özetle, yaklaşık 100 klon tarandı ve + 1 bp'nin eklenmesi (Klon 1 ve Klon 2'de konum 28), -7 bp'nin silinmesi (Klon 3'te konum 1102-1108) ve -1 bp'nin silinmesi (Klon 4'te konum 1102 bp) (CENP-E kodlama dizisi, GenBank Katılım No. NM_001286734.2) (Şekil 1G,H). Bu mutasyonların her ikisi de çerçeve kayması mutasyonları ve erken duruşlarla sonuçlandı, bu da Klon 1/2'de CENP-E geninin tamamen silinmesine ve Klon 3/4 HeLa hücrelerinde iki CENP-E mutantına neden oldu.

CENP-E nakavt deneylerinin verimliliğini ve deneysel başarısını artırmak için üç fenotip tabanlı ekran stratejisi geliştirilmiştir. Bunlar, faz kontrast mikroskobu kullanılarak hücre kolonisi taramasına (Şekil 2A), DAPI boyama kullanılarak kromozom hizalamasına (Şekil 2B) ve immünofloresan testi kullanılarak CENP-E proteinlerinin floresan yoğunluklarına (Şekil 2C) dayanıyordu. CRISPR/Cas9 sisteminin kritik adımları, kılavuz RNA klonlama, pX458-sgRNA'nın hücre hatlarına transfeksiyonu, 48 saat inkübasyon, 96 oyuklu bir plakaya hücre seyreltmesi, hücre hasadı, tarama ve üç fenotip tabanlı strateji kullanılarak doğrulamayı içeriyordu (Şekil 2D). Kontrol ve CENP-E-/-  gruplarının immünofloresan boyamaları, CENP-E proteinlerinin floresan yoğunluklarının CENP-E-/- Klon 1 hücrelerinde tamamen nakavt olduğunu ve CENP-E mutant Klon 3 hücrelerinde önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 2E), bu da CENP-E'nin CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtının etkinliğini daha da göstermektedir HeLa hücrelerinde gen. Kromozom dizilimi bozukluğu olan metafaz hücrelerinin oranları kontrol grubunda %0.30 ± %0.21'den Klon 1 HeLa hücrelerinde %4.15 ± %0.57'ye ve Klon 3 HeLa hücrelerinde %5.85 ± %0.80'e yükselmiştir (Şekil 2F). Bu arada, metafaz hücrelerinin oranları kontrolde %3.49 ± %0.47'den %5.86'± %0.57 CENP-E-/- Klon 1 hücrelerine ve CENP-E mutant Klon 3 hücrelerinde %6.70 ± %0.77'ye yükselmiştir (Şekil 2G). Ek olarak, CENP-E delesyonu sonrası Klon 1 ve Klon 3 gruplarında interfaz hücrelerinin oranı kontrol grubuna göre biraz artmıştır (Şekil 2H). CENP-E delesyonundan sonra hem profaz, hem anafaz hem de telofaz hücrelerinin oranları biraz azalırken, CENP-E delesyonundan sonra metafaz hücrelerinin oranları artmıştır (Şekil 2I). CENP-E delesyonunun fenotiplerini daha fazla araştırmak için, iğ montaj kontrol noktasının önemli bir proteini olan BubR1'in immünofloresan boyamasını gerçekleştirdik ve BubR1'in lokalizasyonunun anormal olduğunu ve BubR1'in kinetokor birikiminin CENP-E yokluğunda önemli ölçüde etkilendiğini bulduk (Şekil 2J-L).

CENP-E nakavt HeLa hücrelerinin hücre büyümesini ve proliferasyon kapasitesini daha iyi anlamak için, Klon 1, Klon 2, Klon 3 ve Klon 4 hücreleri dahil olmak üzere dört CENP-E-/- HeLa hücresi için koloni oluşum testleri ve kristal viyole boyama yapıldı (Şekil 3A,B). CENP-E delesyonu, her klonda klon oluşum yeteneğinin azalmasına, koloni çapının küçülmesine ve hücre sayısının azalmasına neden olur (Şekil 3A-D), bu da CENP-E'nin klon oluşumu ve hücre çoğalması için gerekli olduğunu düşündürür. Ayrıca, 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sülfofenil)-2H-tetrazolium, iç tuz (MTS) yöntemini kullandık ve hücre canlılığı deneyleri yaptık ve kontrol grubunda 1.05 ± 0.00 ile karşılaştırıldığında, CENP-E-/- HeLa hücrelerinde hücre canlılık değerlerinin 0.01 ± 0.01 ve 0.79 ± 0.00'a düştüğünü bulduk (Şekil 3E). CENP-E'nin kromozom stabilitesindeki rollerini daha fazla araştırmak için kromozom hazırlama, Giemsa boyama ve karyotip analizi yaptık ve vahşi tip HeLa hücrelerinde kromozom sayılarında 67.09 ± 0.50'den CENP-E-/- HeLa hücrelerinde 56.08 ± 0.6 - 61.68 ± 0.83'e bir azalma bulduk (Şekil 3F, G). Birlikte, bu sonuçlar CENP-E delesyonunun hücre proliferasyonunu, koloni oluşumunu ve hücre canlılığını önemli ölçüde inhibe ettiğini göstermektedir, bu da CENP-E'nin hücre büyümesi, proliferasyonu ve kromozomal stabilite için gerekli olduğunu göstermektedir.

Bu çalışmada, CENP-E nakavt hücre hattı, CENP-E'ye özgü inhibitörlerin tanımlanması ve doğrulanması için değerli bir araç olarak geliştirilmiştir. CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yararlı bir yaklaşım oluşturulmuştur (Şekil 4). Örnek olarak GSK923295 24,25'i kullanarak, vahşi tip HeLa hücrelerini ve CENP-E-/- Klon 1 HeLa hücre hatlarını bir dizi GSK923295 konsantrasyonu ile tedavi ettik ve koloni oluşum testlerini ve immünofloresan testlerini kullanarak CENP-E inhibitörlerinin bu iki HeLa hücresi üzerindeki etkilerini daha fazla araştırdık (Şekil 4). 6 oyuklu plakalarda aşılanan tek hücreler, koloni oluşum testlerine tabi tutuldu. Hücreler farklı konsantrasyonlarda GSK923295 ile muamele edildi ve 2-3 hafta kültürlendi ve daha sonra daha fazla analiz için hasat edildi (Şekil 4A-D). Kristal viyole boyamadan sonra, vahşi tip HeLa hücrelerinin ve CENP-E-/- hücrelerinin koloni çapları ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Yabani tip HeLa hücrelerinde, artan GSK923295 konsantrasyonlarının tedavisinden sonra koloni oluşumu önemli ölçüde azalmıştır. Ek olarak, vahşi tip HeLa hücrelerinde CENP-E inhibisyonundan sonra kolonilerin çapları küçüldü (Şekil 4B-D). Özellikle, CENP-E nakavt Klon 1 HeLa hücreleri, farklı GSK923295 konsantrasyonlarının varlığında klon çaplarında önemli bir azalma göstermedi, bu da GSK923295'nin önemli bir hedef dışı etkisi olmayan ve 10 nM ila 10 μM konsantrasyon aralığında belirgin toksik yan etkisi olmayan spesifik bir inhibitör olduğunu düşündürmektedir.

Daha sonra, vahşi tip HeLa hücrelerinde ve CENP-E-/- hücrelerinde kromozomal hizalama fenotipi, immünofloresan testi kullanılarak incelendi (Şekil 4E). Kantitatif analiz, 50 nM, 100 nM, 400 nM, 2 μM ve 10 μM GSK923295 tedavisinden sonra metafaz hücrelerinin oranının önemli ölçüde arttığını göstermiştir (Şekil 4E, F). Ek olarak, vahşi tip HeLa hücrelerinde yanlış hizalanmış kromozomlardaki önemli artışla karşılaştırıldığında, CENP-E-/- Klon 1 HeLa hücreleri, farklı GSK923295 konsantrasyonlarından etkilenmedi. Birlikte ele alındığında, bu CENP-E-/- Klon 1 hücre hattı, CENP-E delesyonu ve adaptasyonu, genetik fazlalık 34 ve potansiyel genetik telafi etkileri nedeniyle CENP-E inhibitörlerine yanıt vermeyen spesifik bir GSK923295 dirençli hücre hattı türüdür35,36,37. Bu bulgular, CENP-E-/- Klon 1 HeLa hücresinin, CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü, toksisitesini ve yan etkilerini doğrulamak için güçlü ve kullanışlı bir araç olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak CENP-E-/- HeLa hücrelerinin yapımı. (A) CRISPR/Cas9 vektör yapımı, transfeksiyon, hücre klonu oluşumu ve seçimi ve fonksiyonel doğrulamalar için protokol zaman çizelgesi. sgRNA tasarımı, pX458-sgRNA plazmidinin yapımı ve mutant hücrelerin taranması dahil olmak üzere CENP-E-/- hücre hatlarının inşası için zaman çizelgesi. (B) sgRNA'nın doğrusallaştırılmış pX458 vektörüne klonlanmasının şematik bir modeli. Kromozom 4'teki CENP-E geninin ekzon 1 ve ekzon 13'ü hedef bölge olarak seçildi. (C) Gen düzenleme için CRISPR/Cas9 sisteminin mekanizmaları. DSB'yi takiben homolog olmayan uç birleştirme, ekleme, silme ve ikame dahil olmak üzere üç rastgele mutasyon üretir. (D) pX458-sgRNA1 (Hedef 1) ve pX458-sgRNA2 (Hedef 2) ile transfekte edilen HeLa hücrelerinin temsili floresan görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. (E) Kontrol, hedef 1 ve hedef 2'de genomik DNA'nın temsili agaroz jel elektroforezi. (F-H) Kontrol, Klon 1 ve Klon 3 gruplarındaki hedef bölgelerin Sanger sıralama sonuçları. PCR amplifikasyonu, izole edilmiş Klon 1 ve Klon 3 hücrelerinde hedef lokus için spesifik ileri ve geri primerler kullanılarak gerçekleştirildi. DNA fragmanları pMD18-T vektörlerine klonlandı ve klon oluşumu ve Sanger dizilemesi için DH5α E. coli'ye transfekte edildi. Temsili sıralama sonuçları gösterilir. Klon 1 HeLa hücrelerinde, 28 bp'de + 1 bp'lik bir ekleme vardı. Klon 2 HeLa hücrelerinde, 28 bp'de + 1 bp'lik bir ekleme de vardı. Klon 3'te, 1.102-1.108 bp'de -7 bp'lik bir silme oldu. Klon 4'te, 1.102 bp'de -1 bp'lik bir silme vardı. Bu iki mutasyonun her ikisi de bir çerçeve kayması mutasyonu ve CENP-E proteinlerinde erken bir durma ile sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CRISPR/Cas9 aracılı CENP-E nakavt HeLa hücre hatlarının yapımı ve fenotip tabanlı tarama stratejisi. (A) Tarama stratejisi hücre kolonilerine dayanmaktadır. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, CENP-E nakavt hücreleri, bölünen hücrelerde önemli bir artış gösterdi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Tarama stratejisi kromozom hizalamasına dayanmaktadır. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, CENP-E nakavt hücreleri, kromozom yanlış hizalamasında bir artış gösterdi. CENP-E delesyonundan sonra birkaç kromozom iğ kutbunun proksimalinde yer aldı. DAPI, mavi. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Tarama stratejisi, CENP-E proteinlerinin floresan yoğunluklarına dayanmaktadır. CENP-E, yeşil. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) CRISPR/Cas9 sisteminin yapısı. CENP-E'ye özgü sgRNA, pX458 plazmidine bağlandı ve doğrulama için dizilendi. pX458-sgRNA plazmidi, bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak HeLa hücrelerine transfekte edildi ve 48 saat boyunca kültürlendi. Hücreler %0.25 tripsin/EDTA kullanılarak parçalandı, 96 oyuklu plakaya ekildi ve hücre kolonilerinin oluşumu için kültürlendi. (E) Kontrol ve CENP-E-/- gruplarında CENP-E ve α-tubulinin temsili immünofloresan görüntüleri. DAPI, mavi; CENP-E, yeşil; α-tübülin, kırmızı. Ölçek çubuğu = 10 μm. (F) Kontrol grubu ve CENP-E-/- gruplarında kromozomları yanlış hizalanmış metafaz hücrelerinin oranları. Kontrol, %0.30 ± %0.21, n = 9; Klon 1, 4.15 ± %0.57, n = 9; Klon 3, 5.85 ± %0.80, n = 9. (G) Kontrol ve CENP-E-/-  gruplarındaki metafaz hücrelerinin oranları. Kontrol, %3.49 ± %0.47, n = 9; Klon 1, 5.86 ± %0.57, n = 9; Klon 2, 6.70 ± %0.77, n = 9. (H) Kontrol ve CENP-E-/- gruplarındaki interfaz hücrelerinin oranları. Kontrol, %70.08 ± %2.71, n = 7; Klon 1, 86.77 ± %0.91, n = 7; Klon 3, 87.67 ± %0.91, n = 7. (I) Profaz, metafaz, anafaz ve telofaz hücrelerinin oranları dahil olmak üzere kontrol ve CENP-E-/- gruplarının mitotik indeks analizi. (J) Kontrol ve CENP-E-/- gruplarında BubR1 ve CENP-B'nin temsili immünofloresan görüntüleri. DAPI, mavi; BubR1, yeşil; CENP-B, kırmızı. Ölçek çubuğu = 10 μm. (K) Kontrol ve CENP-E-/- gruplarında BubR1 ve CENP-B'nin çizgi tarama analizi. X ekseni göreli mesafeyi gösterir. Y ekseni floresan yoğunluğunu gösterir. (L) Kontrol ve CENP-E-/- gruplarında BubR1'in bağıl floresan yoğunlukları (sitoplazmada BubR1'in kinetokorları/floresan yoğunluklarında BubR1'in floresan yoğunlukları). Kontrol, 1.44 ± 0.10, n = 16; Klon 1, 0.98 ± 0.07, n = 18. Tüm grafikler için ortalama ± SEM gösterildi. Şekil 2F-I'de, ANOVA Dunnett'in çoklu karşılaştırma testleri. ns, p > 0.05; **, p < 0.01; , p < 0.001; , p < 0.0001. Şekil 2L'de, eşleştirilmemiş Student'ın t-testi. , p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Hücre kolonisi oluşumu, hücre canlılığı testi ve karyotip analizi dahil olmak üzere CENP-E nakavt HeLa hücrelerinin hücre büyüme deneyleri.(A) Kontrol ve CENP-E-/-  gruplarındaki hücre kolonisinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Kontrol ve CENP-E-/-  gruplarında hücre kolonisinin temsili kristal viyole boyanması. Ölçek çubuğu = 1 cm. (C) Vahşi tip (Kontrol) ve CENP-E-/- gruplarında klon başına hücre sayısı. Yabani tip, 81.97 ± 4.09, n = 32; Klon 1, 31.52 ± 2.51, n = 33; Klon 2, 13.97 ± 1.31, n = 33. Klon 3, 48.48 ± 3.01, n = 33; Klon 4, 33.39 ± 1.87, n = 33. (D) Hücre kolonisinin nispi hücre canlılığı, A600 nm'de kristal viyole absorbansı ile ölçüldü. Vahşi tip, 0.42 ± 0.00, n = 6; Klon 1, 0.12 ± 0.00, n = 6; Klon 2, 0.13 ± 0.00, n = 6. Klon 3, 0.18 ± 0.00, n = 6; Klon 4, 0.12 ± 0.00, n = 6. (E) MTS ve hücre canlılığı tahlili kullanılarak vahşi tip ve CENP-E-/- gruplarının hücre canlılığı. Yabani tip, 1.05 ± 0.00, n = 8; Klon 1, 0.77 ± 0.01, n = 8; Klon 2, 0.67 ± 0.01, n = 7. Klon 3, 0.79 ± 0.00, n = 7; Klon 4, 0.66 ± 0.01, n = 7. (F) Yabani tip ve CENP-E-/-  gruplarında hücre başına düşen kromozom sayıları. Yabani tip, 67.09 ± 0.50, n = 66; Klon 1, 61.68 ± 0.83, n = 105; Klon 2, 56.08 ± 0.6, n = 106. Klon 3, 61.28 ± 0.63, n = 90; Klon 4, 64.18 ± 0.83, n = 61. (G) Kontrol grubunda ve CENP-E-/- grubunda yayılan kromozomun temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. Tüm grafikler için, ANOVA Dunnett'in çoklu karşılaştırma testleri. Hata çubukları, ortalama ± SEM. **, p < 0.01; , p < 0.001; , p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için CENP-E nakavt HeLa hücrelerinin kullanılması. (A) Farklı konsantrasyonlarda GSK923295 işleminden sonra kontrol ve CENP-E-/- gruplarının temsili kristal viyole boyanması. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Farklı GSK923295 konsantrasyonları ile tedaviden sonra kontrol ve CENP-E-/-  gruplarındaki hücre kolonisinin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Farklı konsantrasyonlarda GSK923295 işleminden sonra kontrol grubundaki hücre kolonilerinin çapları. Kontrol, 28.68 ± 0.85 μm, n = 149; 10 nM, 25.40 ± 0.86 μm, n = 223; 25 nM, 26.07 ± 0.68 μm, n = 255; 50 nM, 26.41 ± 0.60 μm, n = 180; 100 nM, 16.02 ± 0.32 μm, n = 185; 200 nM, 15.61 ± 0.29 μm, n = 185. (D) Farklı konsantrasyonlarda GSK923295 muamelesinden sonra CENP-E-/- gruplarındaki hücre kolonilerinin çapları. Klon 1, 17.64 ± 0.40 μm, n = 230; 10 nM, 17.98 ± 0.39 μm, n = 230; 25 nM, 15.03 ± 0.26 μm, n = 230; 50 nM, 16.14 ± 0.32 μm, n = 230; 100 nM, 21.13 ± 0.42 μm, n = 230; 200 nM, 19.00 ± 0.40 cm, n = 230. (E) Farklı konsantrasyonlarda GSK923295, DAPI, mavi ile tedaviden sonra kontrol ve CENP-E-/- gruplarında α-tubulinin temsili immünofloresan görüntüleri. α-tubulin, yeşil. Ölçek çubuğu = 10 μm. (F) Farklı GSK923295 konsantrasyonları ile tedaviden sonra kontrol ve CENP-E-/- grubundaki metafaz hücrelerinin oranları. (G) Farklı GSK923295 konsantrasyonları ile tedaviden sonra kontrol ve CENP-E-/- gruplarında yanlış hizalama kromozomlarına sahip metafaz hücrelerinin oranları. Tüm grafikler için, ANOVA Dunnett'in çoklu karşılaştırma testleri. Hata çubukları, ortalama ± SEM. ns, p > 0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; , p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi 17,19,20 sırasında kromozom hizalamasında ve iğ montaj kontrol noktasında önemli bir düzenleyicidir. CENP-E'nin genetik silinmesi genellikle iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonu, hücre döngüsü durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır 27,29,51,52. Bu nedenle, kararlı CENP-E nakavt hücre hatlarının inşası, CENP-E biyolojisinde çözülmemiş önemli bir konudur. Bu çalışmada, CENP-E nakavt HeLa hücreleri, CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak başarıyla oluşturulmuştur. Bu çalışma, CENP-E nakavt hücrelerinin verimliliğini ve başarı oranını önemli ölçüde artıran, hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları olmak üzere üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturmuştur.

Bu çalışmada birkaç önemli adım var. İlk olarak, hedef dışı etkileri en aza indirmek için optimize edilmiş sgRNA tasarlamak çok önemlidir. İkincisi, CRISPR plazmitlerinin lipid bazlı reaktifler, elektroporasyon veya lentivirüs transfeksiyonu yoluyla kültürlenmiş hücrelere transfeksiyonu, transfeksiyon verimliliğini ve gen nakavt hücre oranlarını iyileştirebilir. Ayrıca floresanla aktive olan hücre ayıklama 53,54,55 ve puromisin seçkisi 56,57 uygulamaları tarama hızını artıracak ve deney süresini kısaltacaktır. Üçüncüsü, gen nakavt fenotiplerinin doğrulanması PCR, western blot, immünofloresan testleri ve genomik DNA dizilimi ile yerine getirilebilir. Dördüncüsü, CENP-E nakavt fenotiplerinin fonksiyonel analizi, hücre proliferasyon testleri, immünofloresan, hücre döngüsü analizleri ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli testler kullanılarak incelenebilir.

ZFN'ler ve TALEN'ler gibi geleneksel genom düzenleme teknolojileriyle karşılaştırıldığında, CRISPR / Cas9 sistemi basitlik, yüksek verimlilik, özelleştirme kolaylığı, çok yönlülük ve multipleks yeteneği10 dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sergiler. Ayrıca, CRISPR/Cas9 sistemi, yüksek verimli tarama ve büyük ölçekli mühendislik projeleri için ölçeklendirilebilir58,59. CRISPR/Cas9 sistemi ayrıca, fonksiyonel olarak yedekli genlerin, etkileşen genlerin ve poligenik genetik hastalıkların çalışmalarını hızlandıran, birden fazla gende60 tek adımlı mutasyonları mümkün kılan verimli bir gen düzenleme teknolojisi olarak uyarlanmıştır. Ek olarak, CRISPR / Cas9 sistemi verimliliği ve çok yönlülüğü açısından geliştirilebilir8. Alternatif bir majör DNA onarım yolu olan yüksek kaliteli HDR yolu, gelecekte bölünen hücrelerde hedef lokusta hassas gen düzenlemesine aracılık etmek için kullanılabilir10. Ayrıca, çoklu sgRNA'nın birlikte transfeksiyonu, hücrelerde CENP-E'nin büyük ölçüde silinmesine ve tamamen devre dışı bırakılmasına neden olabilir, bu da CENP-E nakavt hücrelerinin stabilitesini ve güvenilirliğini artırır.

CRISPR / Cas9 sisteminin önemli bir sınırlaması, SpCas9'un bazen genomdaki istenmeyen bölgeleri hedef alan ve hedef dışı etkilere yol açan hedef dışı mutajeneze eğilimli olmasıdır. Bu, geliştirilmiş kılavuz RNA tasarımı, hedef dışı tahmin algoritmaları ve tüm genom dizilimi10,59 ile en aza indirilebilir. Hedef dışı etkileri azaltmak için alternatif Cas12a veya Cas13 proteinlerinin53 kullanımı, baz düzenleyicilerin61 kullanımı ve Cas9 proteinlerinin ve kılavuz RNA12'nin verilmesi dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. İkinci sınırlama, yaygın olarak kullanılan Streptococcus pyogenes Cas9'un (SpCas9), genomlarda SpCas9'un hedef bölgelerinin seçimini sınırlayan, hedef lokusların tanınması için gerekli bir 5'-NGG PAM gerektirmesidir. Rahat veya çeşitli PAM'leri tanıyan tasarlanmış SpCas9 varyantlarının geliştirilmesi, CRISPR/Cas9 genom mühendisliği araç kutusundaki Cas9'un hedef aralığınıartırabilir 62,63,64. Ek olarak, bazı durumlarda, CRISPR / Cas9 sistemi mozaikçiliğe yol açar ve hücre popülasyonlarında farklı düzenlemelere neden olur65. Bazı hayvanlar, Cas9 proteinlerine karşı bir bağışıklık tepkisini uyarabilir, bu da belirli türlerdeki uygulamalarını sınırlar 12,66. Bu sınırlamalara rağmen, CRISPR / Cas9 sistemi, genom düzenleme ve temel bilim, biyoteknoloji, gen terapisi ve tıpta gen fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir gen düzenleme teknolojisi olmaya devam etmektedir.

CENP-E ve inhibitörlerinin etkileşim modları ve moleküler mekanizmaları, hücre biyolojisi ve kanser araştırmalarında önemli araştırma alanlarıdır. Bölgeye yönelik mutajenez ve moleküler biyoloji çalışmaları, GSK923295'in Ile182 ve Thr183 ve CENP-E proteinleri ile etkileşime girdiğini, α2 ve α3 sarmalları arasında ve yakın döngü 525 arasında sıkıştığını ortaya koymuştur. Bu çalışmada, CENP-E nakavt HeLa hücre hattı, CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünün ve toksisitesinin doğrulanması için değerli bir araç olarak kurulmuştur. Bugüne kadar, çoğu CENP-E inhibitörünün bağlanma yerleri ve mekanizmaları iyi anlaşılmamıştır. Moleküler kütle spektrometrisi görüntüleme67, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi68, optik cımbız69, moleküler yapı modifikasyonları, X-ışını kristalografisi70 ve kriyo-elektron mikroskobu71,72 kombinasyonları, CENP-E inhibisyonunun etkileşim bölgelerinin ve mekanizmalarının aydınlatılmasına katkıda bulunacaktır. Gelecekte, CENP-E'nin belirli bölgelerde homolojiye yönelik onarım aracılı hedef modifikasyonu, CENP-E'ye özgü inhibitörlerin spesifik bağlanma bölgelerini ve mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olacak CENP-E gen düzenleme hücrelerini üretebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Fujian Tıp Üniversitesi'ndeki Hücre İskeleti Laboratuvarı'nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi'nden Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin ve Min-Xia Wu'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi'nden Si-Yi Zheng, Ying Lin ve Qi Ke'ye destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 82001608 ve 82101678), Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (hibe numarası 2019J05071), Bilim ve Teknoloji İnovasyonu için Ortak Fonlar, Fujian Eyaleti, Çin (hibe numarası 2021Y9160) ve Fujian Tıp Üniversitesi üst düzey yetenekler bilimsel araştırma başlangıç fonu projesi (hibe numarası XRCZX2017025).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

Biyoloji Sayı 196 CENP-E Nakavt Sentromerle İlişkili Protein-E Kinesin Kinetokor-mikrotübül Yakalama Kromozom Hizalaması İğ Montaj Kontrol Noktası HeLa Hücreleri Fenotip Tabanlı Tarama Kromozom Yanlış Hizalaması BUB1 Mitotik Kontrol Noktası Serin/treonin Kinaz B (BubR1) Mitotik Defektler
CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E <em><sup>CENP-E-/-</sup></em> Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang,… More

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J. L., Zhou, Y., He, J. J., Wu, S., Wei, Y. L., She, Z. Y. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter