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Biology

Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65476
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Abstract

O sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 emergiu como uma ferramenta poderosa para edição precisa e eficiente de genes em uma variedade de organismos. A proteína-E associada ao centrômero (CENC-E) é uma cinesina direcionada a mais necessária para a captura de microtúbulos cinetócoros, alinhamento cromossômico e ponto de verificação de montagem do fuso. Embora as funções celulares das proteínas CENP-E tenham sido bem estudadas, tem sido difícil estudar as funções diretas das proteínas CENP-E usando protocolos tradicionais, porque a ablação CENP-E geralmente leva à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular. Neste estudo, nós nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa humanas e geramos com sucesso as células CENP-E-/- HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9.

Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, que efetivamente melhoram a eficiência de triagem e a taxa de sucesso experimental das células knockout do CENP-E . É importante ressaltar que a deleção CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas serina/treonina quinase B (BubR1) do ponto de verificação mitótico BUB1 e defeitos mitóticos. Além disso, utilizamos o modelo de células HeLa nocaute do CENP-E para desenvolver um método de identificação de inibidores específicos do CENP-E.

Neste estudo, uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E foi estabelecida. Além disso, este trabalho apresenta os protocolos de edição gênica do CENP-E utilizando o sistema CRISPR/Cas9, que pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos do CENP-E na divisão celular. Além disso, a linhagem celular knockout do CENP-E contribuiria para a descoberta e validação dos inibidores do CENP-E, que têm implicações importantes para o desenvolvimento de drogas antitumorais, estudos de mecanismos de divisão celular em biologia celular e aplicações clínicas.

Introduction

A edição do genoma projetado medeia as modificações direcionadas de genes em uma variedade de células e organismos. Em eucariotos, a mutagênese sítio-específica pode ser introduzida pela aplicação de nucleases seqüenciais-específicas que estimulam a recombinação homóloga do DNA-alvo1. Nos últimos anos, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs)2,3, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs)4,5 e meganucleaseshoming6,7, foram projetadas para clivar genomas em locais específicos, mas essas abordagens requerem engenharia proteica complexa e procedimentos experimentais redundantes. Estudos têm demonstrado que o sistema CRISPR/Cas (CRISPR) é uma eficiente tecnologia de edição gênica, que medeia especificamente a clivagem de DNA sítio-específica guiada por RNA em uma ampla variedade de células e espécies8,9,10,11. A tecnologia de nocaute genético CRISPR/Cas9 revolucionou os campos da biologia básica, biotecnologia e medicina12.

As bactérias e a maioria das arqueias desenvolveram um sistema imune adaptativo baseado em RNA que usa as proteínas CRISPR e Cas para identificar e destruir vírus e plasmídeos13. Streptococcus pyogenes A endonuclease Cas9 (SpCas9) contém a resolvease da junção de Holliday semelhante a RuvC (RuvC) e o domínio His-Asn-His (HNH), que pode mediar eficientemente quebras de fita dupla (DSBs) específicas de sequência, fornecendo um RNA guia único sintético (sgRNA) contendo RNAs CRISPR (crRNA) e crRNA transativador (tracrRNA)14,15,16. Os DSBs podem ser reparados através da via de junção final não homóloga (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR), que introduz múltiplas mutações, incluindo inserções, deleções ou substituições de nucleotídeos únicos sem cicatriz, em células de mamíferos 1,8. Tanto o NHEJ propenso a erros quanto a via HDR de alta fidelidade podem ser usados para mediar o knockout gênico por meio de inserções ou deleções, o que pode causar mutações frameshift e códons de parada prematura10.

A cinesina-7 CENP-E é necessária para a fixação do cinetocore-microtúbulo e alinhamento cromossômico durante a divisão celular 17,18,19. A microinjeção de anticorpos20,21, a depleção de siRNA22,23, a inibição química 24,25,26 e a deleção genética 27,28,29 do CENP-E levam ao desalinhamento cromossômico, à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso e a defeitos mitóticos, o que resulta em aneuploidias e instabilidade cromossômica19,30. Em camundongos, a deleção CENP-E resulta em desenvolvimento anormal e letalidade embrionária nos estágios mais precoces do desenvolvimento 27,29,31. A deleção genética do CENP-E geralmente leva ao desalinhamento cromossômico e morte celular 26,27,29, o que é um obstáculo no estudo das funções e mecanismos das proteínas do CENP-E.

Um estudo recente estabeleceu uma linhagem celular knockout condicional CENP-E usando um método de edição genética CRISPR/Cas9 induzível por auxina-32, que permite a rápida degradação das proteínas CENP-E em um tempo relativamente curto33. No entanto, até o momento, linhagens celulares knockout estáveis do CENP-E não foram estabelecidas, o que é um desafio técnico não resolvido na biologia do CENP-E. Considerando a robustez genética34, as respostas de compensação genética 35,36,37 e ambientes intracelulares complexos, uma vez que as consequências diretas da deleção completa do CENP-E podem ser complexas e imprevisíveis, é importante estabelecer linhagens celulares knockout do CENP-E para a investigação de mecanismos de alinhamento cromossômico, ponto de verificação de montagem do fuso e vias de sinalização a jusante.

A descoberta e a aplicação dos inibidores do CENP-E são importantes para o tratamento do câncer. Até o momento, sete tipos de inibidores do CENP-E foram encontrados e sintetizados, incluindo GSK923295 e seus derivados24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]piridínico40,41, composto A42,43, sintalina44,45, UA6278446 e derivados benzo[d]pirrolo[2,1-b]tiazol47. Dentre esses inibidores, o GSK923295 é um inibidor alostérico e eficiente do CENP-E que se liga ao domínio motor do CENP-E e inibe a atividade da ATPase estimulada por microtúbulos do CENP-E com Ki de 3,2 ± 0,2 nM24,25. No entanto, comparados com os efeitos inibitórios da GSK923295 em células cancerosas cultivadas, os efeitos terapêuticos da GSK923295 em pacientes clínicos com câncernão são ideais48,49, o que também levantou preocupações sobre a especificidade da GSK923295 para o CENP-E. Além disso, a especificidade e os efeitos colaterais de outros inibidores do CENP-E sobre as proteínas do CENP-E são questões fundamentais na pesquisa do câncer.

Neste estudo, nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9. Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, para melhorar a eficiência de triagem e a taxa de sucesso da edição do gene CENP-E. Além disso, linhagens celulares knockout do CENP-E podem ser usadas para testar a especificidade de compostos candidatos para o CENP-E.

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Protocol

1. Construção dos vetores knockout do gene CRISPR/Cas9

  1. Selecione a sequência de DNA genômico alvo no gene CENP-E humano (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e projetar o sgRNA usando uma ferramenta de projeto CRISPR on-line (http://crispor.tefor.net/).
  2. Insira uma única sequência genômica, selecione o genoma de "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análise hg38) + polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs): dbSNP148", e selecione o motivo adjacente do protoespaçador "20 bp-NGG-spCas9". Escolha duas sequências guia, incluindo sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' e sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', de acordo com os escores de especificidade50, a eficiência prevista10 e os off-targets mínimos.
  3. Ordenar e sintetizar os oligonucleotídeos de DNA de fita simples (ssODNs). Diluir os ssODNs em ddH2O até uma concentração final de 100 μM. Para fosforilar e recozer os oligos de sgRNA, adicionar 1 μL de oligo anterior, 1 μL de oligo reverso, 0,5 μL de polinucleotídeo quinase T4, 1 μL de tampão polinucleotídeo quinase T4 e 6,5 μL de água livre de RNase em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) e incubar o tubo a 37 °C por 30 min, 95 °C por 5 min; em seguida, reduza para 25 °C a 5 °C min-1.
  4. Digerir o plasmídeo pX458 usando a enzima de restrição BbsEquation 1 . Adicionar 1 μg do plasmídeo pX458, 2 μL de tampão 10x G, 1 μL de BbsEquation 1 e adicionar ddH2O livre de RNase a 20 μL em um tubo centrífugo de 1,5 mL. Incubar o tubo a 37 °C durante 2 h. Em seguida, purificar o plasmídeo linear usando o kit de extração em gel de DNA em coluna de acordo com os protocolos do fabricante.
  5. Ligate os oligos de sgRNA no plasmídeo pX458 (plasmídeo pSpCas9(BB)-2A-green fluorescent protein (GFP), Addgene ID. 48138). Adicionar 1 μL dos oligonucleotídeos recozidos, 25 ng do plasmídeo linear, 1 μL de tampão de ligação de DNA 10x T4, 0,5 μL de DNA ligase T4 (350 U/μL) e perfazer até 10 μL com ddH2O em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Incubar a solução de ligadura a 16 °C durante 2 horas.
  6. Incubar 10 μL do plasmídeo construído com as células DH5α competentes no gelo por 30 min, choque térmico a 42 °C por 45 s e colocá-los imediatamente no gelo por 5 min. Adicionar 500 μL de meio Luria-Bertani (LB) e semear as células em uma placa LB contendo ampicilina (100 μg/mL). Incubar a 37 °C por 16 h e triar os clones resistentes.
  7. Selecionar 5-10 colônias únicas com ponta de pipeta esterilizada e transferi-las para uma cultura de 1 mL de meio LB com ampicilina (100 μg/mL). Incubar a cultura a 37 °C e agitá-la a 180 rpm por 12-16 h.
  8. Isolar o DNA plasmidial usando um kit de extração de plasmídios de acordo com os protocolos do fabricante. Validar o DNA plasmidial de cada colônia por sequenciamento de Sanger do sítio promotor U6 usando o primer U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Extrair e purificar os plasmídeos usando o kit de DNA plasmidial endo-livre de acordo com os protocolos do fabricante.

2. Transfecção, isolamento e triagem das células HeLa nocaute do CENP-E

  1. Cultura de células HeLa em meio de Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina em estufa umidificada a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Incubar as células HeLa usando tripsina a 0,25%/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 °C por 2-3 min, dissociar as células por pipetagem suave e, em seguida, semear as células em novas placas na proporção de diluição de 1:4 para passagem celular.
  3. Semeando as células em uma placa de 12 poços e cultivando até 60-70% de confluência antes da transfecção. Transfectar os plasmídeos pX458-sgRNA em células HeLa usando os reagentes referenciados de acordo com os protocolos do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Misturar suavemente 1 μg de plasmídeo pX458-sgRNA validado e 50 μL de meio de soro reduzido no tubo A. Em seguida, misture suavemente 2 μL do reagente de transfecção e 50 μL de meio de soro reduzido no tubo B. Incube os tubos A e B separadamente à temperatura ambiente por 5 min.
    2. Misture suavemente o tubo A e o tubo B e incube à temperatura ambiente durante 5 minutos. Adicione a mistura a uma placa de 12 poços, incube as células por 6 h e substitua o meio por um meio DMEM fresco.
  4. Examinar células HeLa após 24 h ou 48 h usando um microscópio de fluorescência para eficiência da transfecção. Após a transfecção por 48 h, dissociar completamente as células HeLa transfectadas usando tripsina/EDTA a 0,25% a 37 °C por 3-5 min, contar o número de células usando uma câmara de Neubauer ou um contador de células automatizado e plaquear as células em três placas separadas de 96 poços para cada população transfectada de acordo com métodos de diluição seriados10.
  5. Retorne as células para uma incubadora umidificada e depois cultive-as por mais 1-2 semanas. Troque o meio de cultura uma vez a cada 3 dias. Para a triagem baseada no fenótipo e validação do knockout do CENP-E , dissociar e expandir as células em placas de 24 ou 12 poços por 5-7 dias.
  6. Triagem das células mutantes com menores diâmetros de colônia celular usando um microscópio invertido equipado com objetivas de 10x e 20x.
    NOTA: As mutações do CENP-E geralmente resultam em um aumento significativo no número de células em divisão nas colônias celulares, o que pode ser um dos indicadores-chave para a triagem das células mutantes do CENP-E .
  7. Colheita das células para extração de DNA utilizando o kit de extração de DNA genômico animal em coluna de acordo com os protocolos do fabricante. Definir as reações de PCR da seguinte forma: 0,25 μL de Taq polimerase, 5 μL de tampão 10x (Mg2+ plus), 4 μL de misturas de dNTP, 500 ng de molde de DNA, 1 μL de oligo para frente, 1 μL de oligo reverso e ajustar ddH2O para 50 μL. Use as seguintes configurações de programa de PCR para amplificação de genes: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s durante 33 ciclos; 72 °C, 10 min, e depois segure a 4 °C.
    NOTA: Os primers específicos para clonagem do locus alvo estão listados da seguinte forma: CENP-E alvo F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E alvo R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTCTC-3'; CENP-E alvo F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E alvo R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Ligate o DNA alvo no vetor pMD18-T de acordo com os protocolos do fabricante. Transfectar o plasmídeo ligado em células DH5α competentes e cultura para seleção de clones.
  9. Execute o sequenciamento de Sanger para determinar os tipos de nocaute CENP-E . Isolar o DNA plasmidial usando um kit de extração de plasmídios de acordo com os protocolos do fabricante. Realizar o sequenciamento de Sanger do DNA plasmidial de cada colônia utilizando os primers M13 forward e reverse. Primer M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; Primer M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Semear as células HeLa mutantes do tipo selvagem e do CENP-E em lamínulas de vidro de 12 mm em uma placa de 24 poços, respectivamente. Remover o meio DMEM completo e fixar as células em solução fixadora de paraformaldeído/solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4% à temperatura ambiente por 10 min.
  11. Manchar os núcleos com a solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) à temperatura ambiente durante 5 min. Selecionar e validar as células mutantes do CENP-E com base no fenótipo de alinhamento cromossômico usando um microscópio de fluorescência equipado com uma objetiva Plan Fluor 40x/ Abertura Numérica (NA) 0,75.
  12. Selecionar e validar as células knockout CENP-E utilizando a coloração e análise por imunofluorescência (ver secção 3) das proteínas CENP-E.

3. Coloração por imunofluorescência e microscopia confocal de alta resolução

  1. Fixar as células com solução fixadora de paraformaldeído/PBS a 4% à temperatura ambiente durante 10 min e imergir durante 2 x 5 min em 1x PBS.
    NOTA: Certifique-se de que as células estão em condições saudáveis e as células são coletadas e fixadas suavemente para evitar o descolamento celular metafásico.
  2. Permeabilizar as células com Triton X-100/PBS a 0,25% à temperatura ambiente por 10 min e mergulhá-las em 1x PBS por 2 x 5 min.
  3. Bloquear as células com BSA/PBST a 1% (0,1% Tween 20 em PBS) à temperatura ambiente durante 1 h. Diluir os anticorpos primários com BSA/PBST a 1% e incubar as amostras a 4 °C durante 12 horas.
  4. Eliminar as soluções de anticorpos primários, lavar as células 3 x 5 min com 1x PBS e incubar as células com anticorpos secundários diluídos à temperatura ambiente durante 2 h.
  5. Descarte os anticorpos secundários e lave as células em 1x PBS por 3 x 5 min.
  6. Manchar os núcleos com DAPI à temperatura ambiente por 5 min. Monte as corrediças com o meio de montagem. Sele as lâminas com esmalte.
  7. Observar e registrar as imagens de fluorescência utilizando um microscópio confocal de varredura equipado com objetiva 63x/NA 1,40.

4. Preparação cromossômica e análise cariotípica

  1. Cultivar células selvagens e CENP-E-/- HeLa em meio DMEM completo suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina por 24 h e, em seguida, incubar as células selvagens e CENP-E-/- HeLa com colchicina 300 nM por 5 h.
  2. Incubar as células com tripsina/EDTA a 0,25% a 37 °C por 3 min e coletar as células em tubos de centrífuga de 1,5 mL.
  3. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente, descartar os sobrenadantes, adicionar 1,2 mL de solução de KCl 0,075 mol/L e incubar a 37 °C por 20 min.
  4. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente, descartar os sobrenadantes, adicionar 0,2 mL da solução fixadora (metanol: ácido acético glacial = 3:1) para prefixação e misturar suavemente por 1 min.
  5. Centrifugar as células a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente, coletar os pellets, adicionar 1,5 mL da solução fixadora à temperatura ambiente por 10 min e, em seguida, centrifugar a 1.000 × g por 5 min à temperatura ambiente.
  6. Descarte os sobrenadantes, adicione 0,6 mL das soluções fixadoras e prepare uma suspensão celular. Adicione 3-5 gotas das suspensões celulares de uma altura de 35-40 cm nas lâminas de gelo.
    NOTA: Mantenha a altura para liberar as suspensões celulares nas lâminas em 35-40 cm; caso contrário, os cromossomos podem estar muito dispersos ou não separados uns dos outros.
  7. Secar imediatamente as lâminas com lâmpada de álcool, corar as amostras com solução corante de Giemsa a 10% por 7 min, enxaguar as lâminas com água corrente por 2 min e observar as amostras com microscópio de luz equipado com objetiva Plan Fluor 40x/NA 0,75.

5. Ensaio de formação de colônias celulares

  1. Preparar as suspensões celulares nas placas de 6 poços a uma densidade celular de 1.000-2.000 células/poço. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente as células.
  2. Coloque as placas de 6 poços em uma incubadora de CO2 e incube por 2-3 semanas a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio de cultura uma vez a cada 5 dias. Gravar as imagens utilizando microscópio invertido equipado com objetivas de 10x e 20x. Colher as células quando as colônias são visíveis (centenas de células dentro de um clone).
  3. Para estudar os efeitos da GSK923295, cultivar as células nas placas de 6 poços por 24 h e adicionar 2 mL de GSK923295 nas concentrações finais de 10, 25, 50, 100 e 200 nM.
    NOTA: Não mova a placa de cultura no estágio inicial da formação do clone para evitar a eliminação de células, que podem formar novos clones e afetar a triagem das células transfectadas.
  4. Descarte o meio de cultura e fixe as células com PFA 1% em temperatura ambiente por 10 min. Manchar as colônias com solução corante violeta de cristal a 0,1% à temperatura ambiente por 15 min. Enxaguar as amostras com 1x PBS três vezes. Registre as imagens das colônias celulares e quantifique os diâmetros de cada colônia usando o software ImageJ. Escolha a ferramenta Seleção de linha reta , clique em Analisar, escolha Medir e registre o comprimento.
  5. Enxaguar as colônias com 1 mL de solução de ácido acético a 10% por 5 min. Transferir 200 μL das soluções sobrenadantes em uma placa de 96 poços e medir os valores de absorbância usando um espectrofotômetro de microplacas a A600 nm.

6. Ensaio de viabilidade celular

  1. Semeando as células nas placas de 24 poços e cultivando-as por 48 h a 80-90% de densidade.
  2. Incubar as células com 100 μL de tripsina/EDTA a 0,25% a 37 °C por 3 min.
  3. Misture 400 μL de PBS com as células com uma pistola de pipeta. Transfira 100 μL das suspensões celulares para a placa de 96 poços.
  4. Adicionar 20 μL de solução de MTS em cada poço com uma concentração final de 317 μg/mL e misturar suavemente de acordo com os protocolos do fabricante. Incubar as amostras a 37 °C durante 1-3 h numa incubadora de CO2 .
  5. Registar os valores de absorbância de cada poço no pico de absorbância de A490 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas. Use um comprimento de onda de referência de A630 nm para subtrair o fundo contribuído por detritos celulares e absorbância inespecífica (Viabilidade celular = A490nm- A630 nm).

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Representative Results

As células CENP-E-/- HeLa foram geradas com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). A linha do tempo e as etapas experimentais críticas desse método são mostradas na Figura 1. Primeiro, projetamos e sintetizamos os sgRNAs específicos do CENP-E, recoteamos e ligamos os sgRNAs no plasmídeo pX458, transfectamos o plasmídeo em células HeLa e os cultivamos por 48 h. As células transfectadas foram dissociadas e semeadas em placa de 96 poços com diluições seriadas (Figura 1A). Colônias únicas foram selecionadas e triadas usando três estratégias baseadas em fenótipos. Os tipos de mutação e as células knockout do CENP-E foram validados por PCR, sequenciamento de Sanger e ensaios de imunofluorescência (Figura 1A). O éxon 1 e o éxon 13 do gene CENP-E foram selecionados no cromossomo 4 como sítios alvo (Figura 1B). O sistema CRISPR/Cas9 pode induzir DSBs proximais às sequências de motivos adjacentes (PAM) do protoespaçador usando os domínios de endonucleases RuvC e HNH, que desencadeiam as vias NHEJ e resultam em pequena inserção, deleção e substituição de genes (Figura 1C). Devido a esses mecanismos de reparo propensos a erros, obtivemos quatro populações de células HeLa nocaute gênico. A eficiência da transfecção do pX458-sgRNA foi detectada por ensaio de imunofluorescência (Figura 1D). Também extraímos o DNA genômico das células HeLa controle, alvo 1 e alvo 2 (Figura 1E), amplificamos o DNA do locus alvo e ligamos em pMD18-T para sequenciamento de DNA e validação dos tipos de mutação (Figura 1F). Em resumo, aproximadamente 100 clones foram triados e quatro células HeLa knockout estáveis do CENP-E foram geradas com sucesso, incluindo a inserção de + 1 pb (posição 28 no Clone 1 e Clone 2), a deleção de -7 pb (posição 1102-1108 no Clone 3) e uma deleção de -1 pb (posição 1102 pb no Clone 4) (sequência codificadora CENP-E, Adesão ao GenBank nº. NM_001286734.2) (Figura 1G,H). Essas mutações resultaram em mutações frameshift e paradas prematuras, que resultaram na deleção completa do gene CENP-E no clone 1/2 e dois mutantes do CENP-E nas células HeLa do clone 3/4.

Para melhorar a eficiência e o sucesso experimental dos experimentos knockout do CENP-E, três estratégias de triagem baseadas em fenótipos foram desenvolvidas. Estes foram baseados na triagem de colônias celulares por microscopia de contraste de fase (Figura 2A), no alinhamento cromossômico pela coloração DAPI (Figura 2B) e nas intensidades de fluorescência das proteínas do CENP-E pelo ensaio de imunofluorescência (Figura 2C). As etapas críticas do sistema CRISPR/Cas9 incluíram clonagem de RNA-guia, transfecção de pX458-sgRNA em linhagens celulares, incubação por 48 h, diluição celular em placa de 96 poços, colheita celular, triagem e validação usando três estratégias baseadas em fenótipo (Figura 2D). A coloração por imunofluorescência dos grupos controle e CENP-E-/-mostrou  que as intensidades de fluorescência das proteínas CENP-E foram completamente nocauteadas nas células CENP-E-/- Clone 1 e diminuíram significativamente nas células mutantes do clone 3 do CENP-E (Figura 2E), o que demonstra ainda mais a eficácia do knockout gênico mediado por CRISPR/Cas9 do CENP-E em células HeLa. A proporção de células metafásicas com desalinhamento cromossômico aumentou de 0,30 ± 0,21% no grupo controle para 4,15 ± 0,57% nas células HeLa do Clone 1 e para 5,85 ± 0,80% nas células HeLa do Clone 3 (Figura 2F). Enquanto isso, as proporções de células metafásicas aumentaram de 3,49 ± 0,47% no controle para 5,86 ± 0,57% células CENP-E-/- Clone 1 e para 6,70 ± 0,77% em células mutantes CENP-E Clone 3 (Figura 2G). Além disso, a proporção de células interfásicas aumentou ligeiramente nos grupos Clone 1 e Clone 3 após a deleção CENP-E em comparação com o grupo controle (Figura 2H). As taxas de células prófases, anáfases e telófases diminuíram ligeiramente após a deleção do CENP-E, enquanto as taxas de células metafásicas aumentaram após a deleção do CENP-E (Figura 2I). Para investigar melhor os fenótipos da deleção CENP-E, realizamos a coloração por imunofluorescência de BubR1, uma proteína-chave do ponto de verificação de montagem do fuso, e descobrimos que a localização de BubR1 foi anormal e o acúmulo de cinetócoro de BubR1 foi significativamente influenciado na ausência de CENP-E (Figura 2J-L).

Para melhor compreensão do crescimento celular e da capacidade de proliferação das células HeLa knockout do CENP-E, ensaios de formação de colônias e coloração violeta de cristal foram realizados para quatro células CENP-E-/- HeLa, incluindo células Clone 1, Clone 2, Clone 3 e Clone 4 (Figura 3A,B). A deleção do CENP-E resulta em uma capacidade de formação de clones reduzida, menor diâmetro de colônia e diminuição do número de células em cada clone (Figura 3A-D), o que sugere que o CENP-E é essencial para a formação e proliferação celular de clones. Além disso, utilizamos o método do 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio, sal interno (MTS) e realizamos ensaios de viabilidade celular, e verificamos que, em comparação com 1,05 ± 0,00 no grupo controle, os valores de viabilidade celular diminuíram para 0,66 ± 0,01 e 0,79 ± 0,00 nas células CENP-E-/- HeLa (Figura 3E). Para investigar melhor o papel do CENP-E na estabilidade cromossômica, realizamos a preparação cromossômica, a coloração de Giemsa e a análise cariotípica, e encontramos uma diminuição no número de cromossomos de 67,09 ± 0,50 nas células HeLa selvagens para 56,08 ± 0,6 - 61,68 ± 0,83 nas células HeLa do CENP-E-/- (Figura 3F,G). Em conjunto, esses resultados indicam que a deleção do CENP-E inibe significativamente a proliferação celular, a formação de colônias e a viabilidade celular, o que sugere que o CENP-E é essencial para o crescimento, proliferação e estabilidade cromossômica celular.

Neste estudo, a linhagem celular knockout do CENP-E foi desenvolvida como uma ferramenta valiosa para a identificação e validação de inibidores específicos do CENP-E. Uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores da CENP-E foi estabelecida (Figura 4). Usando GSK92329524,25 como exemplo, tratamos células HeLa selvagens e linhagens celulares HeLa CENP-E-/- Clone 1 com uma série de concentrações de GSK923295 e exploramos os efeitos dos inibidores do CENP-E nessas duas células HeLa usando os ensaios de formação de colônias e os ensaios de imunofluorescência (Figura 4). As células isoladas inoculadas nas placas de 6 poços foram submetidas a ensaios de formação de colônias. As células foram tratadas com diferentes concentrações de GSK923295 e cultivadas por 2-3 semanas e, em seguida, colhidas para análise posterior (Figura 4A-D). Após a coloração violeta de cristal, os diâmetros das colônias das células selvagens HeLa e CENP-E-/- foram medidos usando o software ImageJ. Em células HeLa selvagens, a formação de colônias diminuiu significativamente após o tratamento das concentrações crescentes de GSK923295. Além disso, os diâmetros das colônias tornaram-se menores após a inibição do CENP-E nas células HeLa selvagens (Figura 4B-D). Notavelmente, as células HeLa do clone 1 nocaute do CENP-E não mostraram diminuição significativa nos diâmetros dos clones na presença de diferentes concentrações de GSK923295, o que sugere que GSK923295 é um inibidor específico sem efeitos significativos fora do alvo e sem efeitos colaterais tóxicos óbvios na faixa de concentração de 10 nM a 10 μM.

Posteriormente, o fenótipo de alinhamento cromossômico nas células selvagens HeLa e nas células CENP-E-/- foi examinado usando o ensaio de imunofluorescência (Figura 4E). A análise quantitativa mostrou que a proporção de células metafásicas aumentou significativamente após o tratamento de 50 nM, 100 nM, 400 nM, 2 μM e 10 μM GSK923295 (Figura 4E,F). Além disso, em comparação com o aumento significativo de cromossomos desalinhados em células HeLa selvagens, as células HeLa do CENP-E-/- Clone 1 não foram afetadas por diferentes concentrações de GSK923295. Em conjunto, esta linhagem celular CENP-E-/- Clone 1 é um tipo específico de linhagem celular resistente à GSK923295, que não responde aos inibidores do CENP-E devido à deleção e adaptação do CENP-E, redundância genética34 e potenciais efeitos de compensação genética 35,36,37. Esses achados demonstram que a célula HeLa do clone 1 do CENP-E-/- é uma ferramenta poderosa e útil para validar a especificidade, toxicidade e efeitos colaterais dos inibidores do CENP-E.

Figure 1
Figura 1: Construção das células CENP-E-/- HeLa utilizando o sistema CRISPR/Cas9. (A) Cronograma do protocolo para construção, transfecção, formação e seleção de clones celulares CRISPR/Cas9 e validações funcionais. Linha do tempo para a construção das linhagens celulares CENP-E-/-, incluindo o projeto de sgRNA, a construção do plasmídeo pX458-sgRNA e a triagem de células mutantes. (B) Modelo esquemático da clonagem de sgRNA no vetor linearizado pX458. O éxon 1 e o éxon 13 do gene CENP-E no cromossomo 4 foram selecionados como sítios alvo. (C) Mecanismos do sistema CRISPR/Cas9 para edição gênica. O DSB seguido de junção final não homóloga gera três mutações aleatórias, incluindo inserção, deleção e substituição. (D) Imagens representativas de fluorescência de células HeLa transfectadas com o pX458-sgRNA1 (Alvo 1) e pX458-sgRNA2 (Alvo 2). Barras de escala = 50 μm. (E) Eletroforese em gel de agarose representativa do DNA genômico no controle, alvo 1 e alvo 2. (F-H) Resultados do sequenciamento de Sanger das regiões-alvo nos grupos controle, Clone 1 e Clone 3. A amplificação por PCR foi realizada utilizando os primers forward e reverse específicos para o locus alvo em células isoladas do Clone 1 e Clone 3. Os fragmentos de DNA foram clonados em vetores pMD18-T e transfectados em E. coli DH5α para formação de clones e sequenciamento de Sanger. Resultados representativos do sequenciamento são mostrados. Nas células HeLa do clone 1, houve inserção de + 1 pb a 28 pb. Nas células HeLa do clone 2, também houve inserção de + 1 pb a 28 pb. No clone 3, houve uma deleção de -7 pb em 1.102-1.108 pb. No Clone 4, houve uma deleção de -1 pb a 1.102 pb. Essas duas mutações resultam em uma mutação frameshift e uma parada prematura nas proteínas CENP-E. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Construção e estratégia de triagem baseada em fenótipo de linhagens celulares HeLa knockout CENP-E mediadas por CRISPR/Cas9. (A) A estratégia de triagem é baseada em colônias celulares. Em comparação com o grupo controle, as células knockout do CENP-E mostraram um aumento significativo na divisão celular. Barra de escala = 50 μm. (B) A estratégia de triagem é baseada no alinhamento cromossômico. Em comparação com o grupo controle, as células knockout do CENP-E mostraram um aumento no desalinhamento cromossômico. Vários cromossomos foram localizados proximais ao polo fusiforme após a deleção do CENP-E. DAPI, azul. Barra de escala = 10 μm. (C) A estratégia de triagem é baseada nas intensidades de fluorescência das proteínas CENP-E. CENP-E, verde. Barra de escala = 10 μm. (D) A construção do sistema CRISPR/Cas9. O sgRNA específico do CENP-E foi ligado ao plasmídeo pX458 e sequenciado para validação. O plasmídeo pX458-sgRNA foi transfectado em células HeLa usando um reagente de transfecção e cultivado por 48 h. As células foram lisadas com tripsina/EDTA a 0,25%, semeadas em placa de 96 poços e cultivadas para a formação de colônias celulares. (E) Imagens representativas de imunofluorescência do CENP-E e da α-tubulina nos grupos controle e CENP-E-/-. DAPI, azul; CENP-E, verde; α-tubulina, vermelha. Barra de escala = 10 μm. (F) As proporções de células metafásicas com cromossomos desalinhadas nos grupos controle e CENP-E-/-. Controle, 0,30 ± 0,21%, n = 9; Clone 1, 4,15 ± 0,57%, n = 9; Clone 3, 5,85 ± 0,80%, n = 9. (G) As proporções de células metafásicas nos grupos controle e CENP-E-/- . Controle, 3,49 ± 0,47%, n = 9; Clone 1, 5,86 ± 0,57%, n = 9; Clone 2, 6,70 ± 0,77%, n = 9. (H) As proporções de células interfásicas nos grupos controle e CENP-E-/-. Controle, 70,08 ± 2,71%, n = 7; Clone 1, 86,77 ± 0,91%, n = 7; Clone 3, 87,67 ± 0,91%, n = 7. (I) Análise do índice mitótico dos grupos controle e CENP-E-/-, incluindo as razões das células prófase, metáfase, anáfase e telófase. (J) Imagens representativas de imunofluorescência de BubR1 e CENP-B nos grupos controle e CENP-E-/-. DAPI, azul; BubR1, verde; CENP-B, vermelho. Barra de escala = 10 μm. (K) Análise por varredura linear de BubR1 e CENP-B nos grupos controle e CENP-E-/-. O eixo X indica a distância relativa. O eixo Y indica a intensidade da fluorescência. (L) Intensidades relativas de fluorescência de BubR1 (intensidades de fluorescência de BubR1 nos cinetócoros/intensidades de fluorescência de BubR1 no citoplasma) nos grupos controle e CENP-E-/-. Controle, 1,44 ± 0,10, n = 16; Clone 1, 0,98 ± 0,07, n = 18. Para todos os gráficos, a média ± EPM foi mostrada. Na Figura 2F-I, ANOVA testes de comparações múltiplas de Dunnett. ns, p > 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001. Na Figura 2L, o teste t de Student não pareado. , p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Ensaios de crescimento celular de células HeLa knockout do CENP-E , incluindo formação de colônias celulares, ensaio de viabilidade celular e análise cariotípica. (A) Imagens representativas da colônia celular nos grupos controle e CENP-E-/- . Barra de escala = 50 μm. (B) Coloração violeta de cristal representativa da colônia celular nos grupos controle e CENP-E-/- . Barra de escala = 1 cm. (C) O número de células por clone nos grupos wild-type (Control) e CENP-E-/- . Selvagem, 81,97 ± 4,09, n = 32; Clone 1, 31,52 ± 2,51, n = 33; Clone 2, 13,97 ± 1,31, n = 33. Clone 3, 48,48 ± 3,01, n = 33; Clone 4, 33,39 ± 1,87, n = 33. (D) A viabilidade celular relativa da colônia celular foi medida pela absorbância violeta de cristal a600 nm. Selvagem, 0,42 ± 0,00, n = 6; Clone 1, 0,12 ± 0,00, n = 6; Clone 2, 0,13 ± 0,00, n = 6. Clone 3, 0,18 ± 0,00, n = 6; Clone 4, 0,12 ± 0,00, n = 6. (E) A viabilidade celular dos grupos selvagem e CENP-E-/- usando o ensaio de MTS e viabilidade celular. Selvagem, 1,05 ± 0,00, n = 8; Clone 1, 0,77 ± 0,01, n = 8; Clone 2, 0,67 ± 0,01, n = 7. Clone 3, 0,79 ± 0,00, n = 7; Clone 4, 0,66 ± 0,01, n = 7. (F) Os números cromossômicos por célula nos grupos selvagem e CENP-E-/- . Selvagem, 67,09 ± 0,50, n = 66; Clone 1, 61,68 ± 0,83, n = 105; Clone 2, 56,08 ± 0,6, n = 106. Clone 3, 61,28 ± 0,63, n = 90; Clone 4, 64,18 ± 0,83, n = 61. (G) Imagens representativas da dispersão cromossômica no grupo controle e no grupo CENP-E-/-. Barra de escala = 10 μm. Para todos os gráficos, ANOVA de Dunnett testes de comparações múltiplas. Barras de erro, média ± MEV.**, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Utilização de células HeLa nocaute do CENP-E para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E. (A) Coloração violeta de cristal representativa dos grupos controle e CENP-E-/- após o tratamento de diferentes concentrações de GSK923295. Barra de escala = 1 cm. (B) Imagens representativas da colônia celular nos grupos controle e CENP-E-/- após tratamento com diferentes concentrações de GSK923295. Barra de escala = 50 μm. (C) Os diâmetros das colônias celulares no grupo controle após o tratamento de diferentes concentrações de GSK923295. Controle, 28,68 ± 0,85 μm, n = 149; 10 nM, 25,40 ± 0,86 μm, n = 223; 25 nM, 26,07 ± 0,68 μm, n = 255; 50 nM, 26,41 ± 0,60 μm, n = 180; 100 nM, 16,02 ± 0,32 μm, n = 185; 200 nM, 15,61 ± 0,29 μm, n = 185. (D) Os diâmetros das colônias celulares nos grupos CENP-E-/- após o tratamento de diferentes concentrações de GSK923295. Clone 1, 17,64 ± 0,40 μm, n = 230; 10 nM, 17,98 ± 0,39 μm, n = 230; 25 nM, 15,03 ± 0,26 μm, n = 230; 50 nM, 16,14 ± 0,32 μm, n = 230; 100 nM, 21,13 ± 0,42 μm, n = 230; 200 nM, 19,00 ± 0,40 cm, n = 230. (E) Imagens representativas de imunofluorescência da α-tubulina nos grupos controle e CENP-E-/- após tratamento com diferentes concentrações de GSK923295, DAPI, azul. α-tubulina, verde. Barra de escala = 10 μm. (F) As proporções de células metafásicas no grupo controle e CENP-E-/- após tratamento com diferentes concentrações de GSK923295. (G) As proporções de células metafásicas com cromossomos desalinhadas nos grupos controle e CENP-E-/- após tratamento com diferentes concentrações de GSK923295. Para todos os gráficos, ANOVA de Dunnett testes de comparações múltiplas. Barras de erro, média ± EPM.ns, p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A cinesina-7 CENP-E é um regulador chave no alinhamento cromossômico e no ponto de verificação da montagem do fuso durante a divisão celular 17,19,20. A deleção genética do CENP-E geralmente resulta na ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular 27,29,51,52. Assim, a construção de linhagens celulares estáveis do CENP-E é uma importante questão não resolvida na biologia do CENP-E. Neste estudo, as células HeLa knockout do CENP-E foram geradas com sucesso usando o sistema CRISPR/Cas9. Este estudo estabeleceu três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos - triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E - que melhoram significativamente a eficiência e a taxa de sucesso das células knockout do CENP-E.

Há várias etapas cruciais neste estudo. Primeiro, projetar sgRNA otimizado é essencial para minimizar os efeitos fora do alvo. Em segundo lugar, a transfecção dos plasmídeos CRISPR em células cultivadas através de reagentes à base de lipídios, eletroporação ou transfecção de lentivírus pode melhorar a eficiência da transfecção e as razões de células nocaute gênico. Além disso, as aplicações de triagem celular ativada por fluorescência 53,54,55 e seleção de puromicina 56,57 acelerariam a velocidade da tela e encurtariam o período experimental. Terceiro, a validação dos fenótipos de nocaute gênico pode ser realizada por PCR, western blot, ensaios de imunofluorescência e sequenciamento de DNA genômico. Quarto, a análise funcional dos fenótipos de knockout do CENP-E pode ser estudada usando uma variedade de ensaios, incluindo ensaios de proliferação celular, imunofluorescência, análises de ciclo celular e imagens de alta resolução.

Em comparação com as tecnologias tradicionais de edição do genoma, como ZFNs e TALENs, o sistema CRISPR/Cas9 apresenta várias vantagens, incluindo simplicidade, alta eficiência, facilidade de personalização, versatilidade e capacidade multiplex10. Além disso, o sistema CRISPR/Cas9 pode ser ampliado para triagem de alto rendimento e projetos de engenharia de grande escala 58,59. O sistema CRISPR/Cas9 também foi adaptado como uma eficiente tecnologia de edição de genes que permite mutações de uma etapa em múltiplos genes60, o que acelera os estudos de genes funcionalmente redundantes, genes interagindo e doenças genéticas poligênicas. Além disso, o sistema CRISPR/Cas9 pode ser melhorado em sua eficiência e versatilidade8. A via HDR de alta fidelidade, uma importante via alternativa de reparo de DNA, pode ser usada para mediar a edição precisa de genes no locus alvo em células em divisão no futuro10. Além disso, a co-transfecção de múltiplos sgRNA pode resultar na grande deleção e knockout completo do CENP-E nas células, o que melhora a estabilidade e a confiabilidade das células knockout do CENP-E.

Uma limitação chave do sistema CRISPR/Cas9 é que SpCas9 é propensa a mutagênese fora do alvo, que ocasionalmente tem como alvo os locais não intencionais no genoma e leva a efeitos fora do alvo. Isso pode ser minimizado por um melhor design de RNA-guia, algoritmos de previsão fora do alvo e sequenciamento do genoma completo10,59. Várias abordagens, incluindo o uso de proteínas alternativas Cas12a ou Cas1353, o uso de editores de base61 e a entrega de proteínas Cas9 e RNA guia12, foram desenvolvidas para reduzir os efeitos fora do alvo. A segunda limitação é que o Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) amplamente utilizado requer um requisito de 5'-NGG PAM para o reconhecimento dos loci alvo, o que limita a seleção dos sítios alvo de SpCas9 em genomas. O desenvolvimento de variantes projetadas de SpCas9 que reconheçam os PAMs relaxados ou diversos poderia aumentar a faixa alvo de Cas9 na caixa de ferramentas de engenharia do genoma CRISPR/Cas9 62,63,64. Além disso, em vários casos, o sistema CRISPR/Cas9 leva ao mosaicismo e resulta em diferentes edições em populações celulares65. Alguns animais podem estimular uma resposta imune às proteínas Cas9, o que limita sua aplicação em determinadas espécies12,66. Apesar dessas limitações, o sistema CRISPR/Cas9 continua sendo uma poderosa tecnologia de edição de genes para edição do genoma e estudo das funções gênicas na ciência básica, biotecnologia, terapia gênica e medicina.

Os modos de interação e os mecanismos moleculares do CENP-E e seus inibidores são importantes campos de pesquisa em biologia celular e pesquisa em câncer. Estudos de mutagênese sítio-dirigida e biologia molecular revelaram que GSK923295 interage com Ile182 e Thr183 e com as proteínas CENP-E, sendo sanduíche entre as hélices α2 e α3 e próxima alça 525. Neste estudo, a linhagem celular HeLa nocaute CENP-E foi estabelecida como uma ferramenta valiosa para a validação da especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E. Até o momento, os sítios e mecanismos de ligação da maioria dos inibidores da CENP-E não são bem compreendidos. As combinações de espectrometria de massas moleculares67, espectroscopia de ressonância magnética nuclear68, pinça óptica69, modificações na estrutura molecular, cristalografia de raios X70 e microscopia crioeletrônica71,72 contribuiriam para a elucidação dos sítios de interação e mecanismos de inibição do CENP-E. No futuro, a modificação do alvo do CENP-E mediada por reparo dirigido por homologia em locais específicos pode gerar as células de edição gênica do CENP-E, o que ajudaria a revelar os sítios e mecanismos específicos de ligação dos inibidores específicos do CENP-E.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu no Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University por sua assistência técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke do Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seu apoio. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608 e 82101678), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bolsa 2019J05071), os Fundos Conjuntos para a Inovação da Ciência e Tecnologia, a Província de Fujian, China (número de bolsa 2021Y9160) e o projeto de financiamento de iniciação científica de talentos de alto nível da Universidade de Medicina de Fujian (número de bolsa XRCZX2017025).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

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References

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Biologia Edição 196 Nocaute CENP-E Proteína E Associada ao Centrômero Cinesina Captura de Cinetócoro-Microtúbulos Alinhamento Cromossômico Ponto de Verificação de Montagem do Feixo Células HeLa Triagem Baseada em Fenótipo Desalinhamento Cromossômico Ponto de Verificação Mitótica BUB1 Serina/treonina Quinase B (BubR1) Defeitos Mitóticos
Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E <em><sup>CENP-E-/-</sup></em> utilizando o Sistema CRISPR/Cas9
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Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang,… More

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J. L., Zhou, Y., He, J. J., Wu, S., Wei, Y. L., She, Z. Y. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).

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