卡诺哈布迪炎的单细胞分离：分离活细胞的方法

Overview

此视频描述了将整个蠕虫分离成适合 FACS 或完整细胞免疫沉淀的单细胞悬架的方法。

Protocol

本议定书摘自德国等人，隔离特定神经元种群从圆虫卡诺哈布迪炎电子人，J.Vis.Exp.（2019年）。

1. 为细胞隔离准备和收集老年蠕虫

注：下面解释的是从明尼苏达大学卡诺哈布迪炎遗传学中心（CGC）菌株储存库获得的转基因unc-17：GFP菌株（OH13083）中分离的胆碱神经元。必须保持无菌条件，以防止真菌或细菌的污染。

1. 通过 T. Stiernagle 描述的漂白方法准备和同步蠕虫。对于老化实验，板虫到线虫生长介质（NGM）板包含25μM水溶液氟多氧尿素（FuDR），以减少鸡蛋生产和阻止卵子孵化。定期检查阿加板块，以防止污染或鸡蛋孵化，因为这将导致不可靠的结果。
   注： 对于 unc-17：：GFP 细胞，通常使用三个 100 mm x 15 mm NGM 板来隔离足够数量的兴趣细胞。
2. 收集蠕虫，为细胞隔离准备缓冲器。
   1. 在 15 mL 圆锥管中收集蠕虫。用 1.5 mL 的 M9 缓冲区（1 mM MgSO_4、85mM NaCl、42 mM Na₂HPO4+7H₂O、22 mM KH₂PO、pH 7.0）和离心机从板中清洗蠕虫，在 1，600 x g处洗涤 5 分钟。丢弃超自然物，用 1 mL 的 M9 缓冲器清洗蠕虫。重复离心和洗涤共五次，以消除尽可能多的 大肠杆菌 污染。
      注： 在此步骤中添加抗生素（50μg/mL），如安培素，有助于减少细菌污染。
   2. 对于两个样品，准备 2 mL 的硫酸钠二硫酸二硫酸钠 （SDS-DTT） 裂解缓冲器：200 mM DTT、0.25% （w/v） SDS、20m HEPES （pH 8.0） 和 3% （w/v） 蔗糖。
   3. 准备 15 mL 的隔离缓冲 （118 mM NaCl， 48 mM KCl， 2 mM 卡Cl₂， 2 mM MgCl₂， 25 mM HEPES [pH 7.3]）， 并将其存储在冰上。
      注： SDS-DTT 裂解缓冲器和隔离缓冲器必须在每个实验之前进行新鲜。
3. 内质层中断和单细胞分离
   1. 离心动物收集在第1.2.1步5分钟在1，600 x g。在 M9 介质的 1 mL 中去除所有超母体并暂停蠕虫，并转移到 1.5 mL 微中心管中。
   2. 离心的颗粒蠕虫在 1，600 x g 下 5 分钟。
   3. 在蠕虫中加入 200 μL 的 SDS-DTT 裂解缓冲器，在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。如果在光显微镜下观察，蠕虫应该沿着身体"眨眼"。
      注： 长时间接触 SDS-DTT 裂解缓冲器可能导致蠕虫死亡，可以通过观察蠕虫进行监测。死亡的蠕虫会拉长，不会卷曲。
   4. 加入 800 μL 的冰冷隔离缓冲器，轻轻轻拂管子混合。
   5. 颗粒蠕虫在 13，000 x g 在 4 °C 下 1 分钟，去除超自然物，用 1 mL 的隔离缓冲器清洗。
   6. 重复步骤 1.3.5 总共五次，每次都小心地删除隔离缓冲区。
   7. 加入100微升蛋白酶混合物，从 链球菌 （15毫克/mL）（材料表）溶解在隔离缓冲器到颗粒中，并在RT孵育10−15分钟。
      注： 与 SDS - DTT 裂解缓冲器一样，延长蛋白酶消化可能导致血浆膜沿线蛋白质过度，防止通过磁珠隔离表面暴露的 GFP 。
   8. 在与蛋白酶混合物一起孵化过程中，通过上下管道将样品吹到 1.5 mL 微中羽管底部，用 200 μL 微皮尖进行机械干扰，时间为 60 − 70 倍。将移液器尖端靠在微中心管壁上，不断施加压力，使细胞正确分离。
   9. 要确定消化阶段，请取出消化混合物的少量（约 1−5 μL），将其放在玻璃滑梯上，然后使用组织培养显微镜对其进行检查。经过5−7分钟的孵育，蠕虫碎片应明显减少皮质层，细胞的泥浆将很容易看到。
   10. 停止反应与 900 μL 的市售冷莱博维茨的 L-15 介质补充 10% 胎儿牛血清 （FBS） 和青霉素链霉素 （最终浓度为 50 U/mL 青霉素和 50μg/mL 链霉素）.
   11. 通过离心分离碎片和细胞5分钟，在4°C的10，000 x g。 再用1毫升的冷L-15补充介质清洗被喷出的细胞两次，以确保去除多余的碎屑和皮质层。
   12. 在 1 mL L 的 L-15 补充介质中补充盆栽细胞，在冰上离开 30 分钟。将顶层（约 700 −800 μL）取到微中流管中。此层包含无细胞碎片的细胞，并将用于随后对感兴趣的细胞进行隔离。
   13. 按照制造商的说明，使用自动细胞计数器或血细胞计测量分离细胞的细胞密度为 10−25 μL。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010