Dissociazione a singola cellula di Caenorhabditis elegans: Un metodo per isolare le cellule vive

Overview

Questo video descrive un metodo per dissociare interi vermi in una sospensione a singola cellula adatta per FACS o immunoprecipitazione di cellule intatte.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Germany et al, Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.

1. Preparazione e raccolta di vermi invecchiati per l'isolamento cellulare

NOTA: Di seguito è spiegato l'isolamento dei neuroni colinergici dal ceppo transgenico unc-17::GFP (OH13083) ottenuto dal deposito di ceppo Caenorhabditis Genetics Center (CGC) presso l'Università del Minnesota. È imperativo mantenere condizioni sterili per prevenire la contaminazione da funghi o batteri.

1. Preparare e sincronizzare i vermi tramite il metodo di sbiancamento descritto da T. Stiernagle. Per gli esperimenti di invecchiamento, i vermi piastra su piastre di mezzo di crescita del nematode (NGM) contenenti soluzione d'acqua da 25 μM di fluorodeossiuridina (FuDR) per ridurre la produzione di uova e arrestare la schiusa delle uova. Ispezionare regolarmente le piastre di agar per prevenire la contaminazione o la schiusa delle uova in quanto ciò causerà risultati inaffidabili.
   NOTA: Per le celle UNC-17::GFP, in genere vengono utilizzate tre piastre NGM da 100 mm x 15 mm per isolare una quantità sufficiente di cellule di interesse.
2. Raccogliere worm e preparare buffer per l'isolamento delle celle.
   1. Raccogliere i vermi in un tubo conico da 15 ml. Lavare i vermi dalla piastra con 1,5 mL di tampone M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) e centrifuga per 5 min a 1.600 x g. Scartare i vermi supernatanti e lavare con 1 mL di tampone M9. Ripetere la centrifugazione e lavare per un totale di cinque volte per rimuovere quanta più contaminazione da E. coli possibile.
      NOTA: L'aggiunta di antibiotici (50 μg/mL), come l'ampicillina, in questo passaggio può aiutare a ridurre la contaminazione batterica.
   2. Per due campioni, preparare 2 mL di sodio dodecil solfato-ditiothiothreitol (SDS-DTT) tampone di lisi: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) e 3% (w/v) saccarosio.
   3. Preparare 15 mL di tampone di isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) e conservarlo sul ghiaccio.
      NOTA: Sia il buffer di lisi SDS-DTT che il buffer di isolamento devono essere resi freschi prima di ogni esperimento.
3. Interruzione della cuticola e isolamento a cella singola
   1. Animali centrifugati raccolti nella fase 1.2.1 per 5 min a 1.600 x g. Rimuovere tutti i supernatanti e sospendere i vermi in 1 ml di supporti M9 e trasferirli in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
   2. Vermi pellet con centrifugazione a 1.600 x g per 5 min.
   3. Aggiungere 200 μL di tampone di lisi SDS-DTT ai vermi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). I vermi dovrebbero sembrare "winkled" lungo il corpo se visti al microscopio luminoso.
      NOTA: L'esposizione prolungata al tampone di llisi SDS-DTT può causare la morte di vermi, che possono essere monitorati osservando i vermi. I vermi morti si allineeranno e non si arricciano.
   4. Aggiungere 800 μL di tampone di isolamento ghiacciato e mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo.
   5. Vermi pellet per 1 min a 13.000 x g a 4 °C, rimuovere il supernatante e lavare con 1 mL di tampone di isolamento.
   6. Ripetere il passaggio 1.3.5 per un totale di cinque volte, rimuovendo con attenzione il buffer di isolamento ogni volta.
   7. Aggiungere 100 μL di miscela di proteasi da Streptomyces griseus (15 mg/mL)(Tabella dei materiali)sciolto in tampone di isolamento al pellet e incubare per 10−15 min a RT.
      NOTA: Come per il tampone di llisi SDS-DTT, la digestione prolungata della proteasi può provocare un'eccessiva scissione di proteine lungo la membrana plasmatica, impedendo l'isolamento della FPG esposta in superficie tramite perline magnetiche.
   8. Durante l'incubazione con miscela di proteasi, applicare interruzioni meccaniche tubazionando campioni su e giù contro il fondo del tubo di microcentrifugo da 1,5 ml con una punta di micropipetta da 200 μL per ~ 60−70 volte. Tenere la punta della pipetta contro la parete del tubo di microcentrifugo con pressione costante per dissociare correttamente le cellule.
   9. Per determinare lo stadio della digestione, rimuovere un piccolo volume (~1−5 μL) della miscela di digestione, lasciarlo cadere su uno scivolo di vetro e ispezionarlo usando un microscopio di coltura tissutale. Dopo 5−7 minuti di incubazione, i frammenti di verme dovrebbero avere cuticola visibilmente ridotta e un liquame di cellule sarà facilmente visibile.
   10. Reazione di arresto con 900 μL di mezzo L-15 di Leibovitz freddo disponibile in commercio integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e streptomicina penicillina (concentrazione finale a 50 U/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina).
   11. Frammenti isolati di pellet e cellule per centrifugazione per 5 min a 10.000 x g a 4 °C. Lavare le celle a pellet con 1 mL di mezzi freddi integrati con L-15 due volte in più per assicurarsi che i detriti e le cuticola in eccesso vengano rimossi.
   12. Rimospend celle a pellet in 1 mL di mezzi integrati con L-15 e lasciare sul ghiaccio per 30 minuti. Portare lo strato superiore, circa 700−800 μL, in un tubo di microcentrifugo. Questo strato contiene cellule senza detriti cellulari e verrà utilizzato nel successivo isolamento delle cellule di interesse.
   13. Seguendo le istruzioni del produttore, utilizzare un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro per misurare la densità cellulare di 10−25 μL di cellule isolate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010