Dissociação de células únicas de caenorhabditis elegans: Um método para isolar células vivas

Overview

Este vídeo descreve um método para dissociar vermes inteiros em uma suspensão unicelular adequada para FACS ou imunoprecipitação de células intactas.

Protocol

Este protocolo é um trecho da Alemanha et al, Isolamento de Populações específicas de neurônios da Lombriga Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparação e coleta de vermes envelhecidos para isolamento celular

NOTA: Explicado abaixo está o isolamento de neurônios colinérgicos do repositório transgênico unc-17::GFP strain (OH13083) obtido do repositório de cepa do Centro genético de Caenorhabditis (CGC) da Universidade de Minnesota. É imprescindível manter condições estéreis para evitar contaminação de fungos ou bactérias.

1. Prepare e sincronize os vermes através do método de branqueamento descrito por T. Stiernagle. Para experimentos de envelhecimento, vermes de placas em placas de médio crescimento de nematoides (GNM) contendo solução de água de 25 μM de fluorodeoxyuridina (FuDR) para reduzir a produção de ovos e prender a eclosão de ovos. Inspecione as placas de ágar regularmente para evitar contaminação ou eclosão de ovos, pois isso causará resultados não confiáveis.
   NOTA: Para células unc-17::GFP, tipicamente três placas de NGM de 100 mm x 15 mm são usadas para isolar uma quantidade suficiente de células de interesse.
2. Colete vermes e prepare buffers para isolamento celular.
   1. Colete vermes em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes da placa com 1,5 mL de tampão M9 (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7.0) e centrífuga por 5 min a 1.600 x g. Descarte os vermes supernacantes e lave com 1 mL de tampão M9. Repita a centrifugação e lave por um total de cinco vezes para remover o máximo de contaminação de E. coli possível.
      NOTA: A adição de antibióticos (50 μg/mL), como a ampicillina, nesta etapa pode ajudar a reduzir a contaminação bacteriana.
   2. Para duas amostras, prepare 2 mL de sulfato-dithiothiothreitol de sódio (SDS-DTT) tampão de lise: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0) e 3% (w/v) sacarose.
   3. Prepare 15 mL de tampão de isolamento (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) e armazene-o no gelo.
      NOTA: Tanto o tampão de lise SDS-DTT quanto o tampão de isolamento devem ser feitos frescos antes de cada experimento.
3. Interrupção da cutícula e isolamento de célula única
   1. Animais centrífugas coletados na etapa 1.2.1 por 5 min a 1.600 x g. Remova todos os supernacantes e suspenda worms em 1 mL de mídia M9 e transfira para tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
   2. Vermes de pelota com centrifugação a 1.600 x g por 5 min.
   3. Adicione 200 μL de tampão de lise SDS-DTT aos vermes e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Os vermes devem parecer "piscados" ao longo do corpo se vistos sob um microscópio leve.
      NOTA: A exposição prolongada ao tampão de lise SDS-DTT pode resultar na morte de vermes, que podem ser monitorados observando vermes. Vermes mortos se alongarão e não se enrolarão.
   4. Adicione 800 μL de tampão de isolamento gelado e misture por um tubo suavemente piscando.
   5. Vermes de pelotas por 1 min a 13.000 x g a 4 °C, removam o supernasciente e lave com 1 mL de tampão de isolamento.
   6. Repita o passo 1.3.5 para um total de cinco vezes, removendo cuidadosamente o buffer de isolamento cada vez.
   7. Adicione 100 μL de mistura de protease de Streptomyces griseus (15 mg/mL)(Tabela de Materiais)dissolvido em tampão isolado à pelota e incubar por 10-15 min no RT.
      NOTA: Tal como acontece com o tampão de lise SDS-DTT, a digestão estendida da protease pode resultar em decote excessivo de proteínas ao longo da membrana plasmática, impedindo o isolamento da superfície exposta GFP através de contas magnéticas.
   8. Durante a incubação com a mistura protease, aplique interrupção mecânica por tubos para cima e para baixo contra a parte inferior do tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL com uma ponta de micropipette de 200 μL por ~60-70 vezes. Mantenha a ponta da pipeta contra a parede do tubo de microcentrifutura com pressão constante para desassociar adequadamente as células.
   9. Para determinar o estágio da digestão, remova um pequeno volume (~1−5 μL) da mistura de digestão, solte-o em um slide de vidro e inspecione-o usando um microscópio de cultura tecidual. Após 5-7 minutos de incubação, fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e um chorume de células será facilmente visível.
   10. Halt reaction with 900 μL of cold Leibovitz's L-15 medium complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e penicilina-estreptomicina (concentração final em 50 U/mL penicilina e 50 μg/mL streptomicina).
   11. Pelotas isola fragmentos e células por centrifugação por 5 min a 10.000 x g a 4 °C. Lave as células pelleted com 1 mL de mídia l-15-suplementada fria mais duas vezes para garantir que o excesso de detritos e cutículas seja removido.
   12. Células de pelotização resuspend em 1 mL de mídia L-15-suplementada e deixar no gelo por 30 minutos. Leve a camada superior, aproximadamente 700-800 μL, para um tubo de microcentrifuge. Esta camada contém células sem detritos celulares e será usada no isolamento subsequente de células de interesse.
   13. Seguindo as instruções do fabricante, use um contador celular automatizado ou hemótmetro para medir a densidade celular de 10-25 μL de células isoladas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010