Summary
Эксперимент, используемый здесь, показывает метод молекулярного докинга в сочетании с анализом клеточного теплового сдвига для прогнозирования и проверки взаимодействия между малыми молекулами и белковыми мишенями.
Abstract
Белки имеют фундаментальное значение для физиологии человека, а их мишени имеют решающее значение в исследованиях и разработке лекарств. Идентификация и валидация важнейших белковых мишеней стали неотъемлемой частью разработки лекарств. Молекулярный докинг — это вычислительный инструмент, широко используемый для исследования связывания белка с лигандом, особенно в контексте взаимодействия лекарств и белков-мишеней. Для экспериментальной проверки связывания и доступа к связыванию лекарственного препарата и его мишени непосредственно используется метод анализа клеточного теплового сдвига (CETSA). Это исследование было направлено на интеграцию молекулярного докинга с CETSA для прогнозирования и проверки взаимодействий между лекарствами и жизненно важными белковыми мишенями. В частности, мы предсказали взаимодействие между ксантатином и белком Keap1, а также способ его связывания с помощью молекулярного докингового анализа с последующей проверкой взаимодействия с помощью анализа CETSA. Наши результаты показали, что ксантатин может устанавливать водородные связи со специфическими аминокислотными остатками белка Keap1 и снижать термостабильность белка Keap1, что указывает на то, что ксантатин может напрямую взаимодействовать с белком Keap1.
Introduction
Белки являются очень важными макромолекулами в живых организмах и обладают разнообразным спектром уникальных функций в клетках, таких как состав мембраны, формирование цитоскелета, активность ферментов, транспорт, клеточная сигнализация и участие как во внутриклеточных, так и во внеклеточныхмеханизмах. Белки проявляют свои биологические функции в основном через специфические взаимодействия с различными молекулами, включая другие белки, нуклеиновые кислоты, низкомолекулярные лиганды и ионы металлов 1,4. Лиганды — это небольшие молекулярные соединения, которые специфически связываются с белками в организме. Взаимодействие между белками и лигандами происходит в определенных участках белка, называемых сайтами связывания, также известными как карманы связывания5. В исследованиях медицинской химии основное внимание уделяется выявлению ключевых белков, которые явно связаны с заболеваниями, которые служат мишенями для лекарств6. Таким образом, получение глубокого понимания сайтов связывания между белками и лигандами имеет первостепенное значение для содействия открытию, разработке и исследованию лекарств 7,8.
Молекулярный докинг является широко используемым вычислительным инструментом для изучения связывания белка с лигандом, который использует трехмерные структуры белков и лигандов для изучения их первичных способов связывания и сродства при образовании стабильных комплексов 9,10,11. Применение технологии молекулярного докинга зародилось в 1970-х годах. Основываясь на принципе спаривания замка и ключа и используя алгоритмы программного обеспечения молекулярного докинга, можно определить взаимодействие между соединениями и молекулярными мишенями, анализируя результаты докинга. Этот подход позволяет предсказывать активные сайты связывания как для соединения, так и для молекулы-мишени. Следовательно, это облегчает идентификацию оптимальной конформации связывания (здесь называемой моделью связывания) для лиганд-рецепторных взаимодействий, что имеет решающее значение для понимания механики этих молекулярных взаимодействий 12,13,14,15. Хотя молекулярный докинг обеспечивает ценные компьютерные предсказания лиганд-рецепторных взаимодействий, важно отметить, что это предварительные результаты. Следовательно, для подтверждения этих взаимодействий необходима дальнейшая экспериментальная проверка.
Анализ клеточного теплового сдвига (CETSA), первоначально предложенный исследовательской группой Pär Nordlund в 2013 году, служит методом проверки взаимодействий белков между лекарствами и мишенями. Этот метод специально проверяет термическую стабильность белков-мишеней, индуцированных связыванием лекарственного средства, обеспечивая практический подход к подтверждению молекулярных взаимодействий 16,17,18. Этот подход основан на фундаментальном принципе, согласно которому связывание лиганда инициирует тепловой сдвиг внутри белков-мишеней, и применимо к широкому спектру биологических образцов, включая клеточные лизаты, интактные живые клетки и ткани19,20. CETSA поддерживает прямое поражение малых молекул в интактных клетках, обнаруживая термодинамическую стабилизацию белков из-за связывания лигандов и связывая наблюдаемый фенотипический ответ с целевым соединением21,22. Среди различных методологий, заимствованных из CETSA, классический подход считается Western Blot-CETSA (WB-CETSA). После подготовки образца с использованием метода CETSA используется вестерн-блоттинг для обнаружения изменений в термической стабильности целевого белка. Это позволяет точно определять лекарственно-белковые взаимодействия в клеточных системах 17,23.
Ксантатин — это биологически активное соединение, выделенное из растения Xanthium L. с такими противовоспалительными свойствами, которое используется в традиционной китайской медицине для лечения таких заболеваний, как синусит носа и артрит. Келх-подобный ECH-ассоциированный белок 1 (Keap1) является компонентом мультисубъединичного белкового комплекса убиквитинлигазы E3 на основе Cullin3 и важным регулятором внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, который влияет на интенсивность и продолжительность воспалительной реакции путем модуляции внутриклеточного окислительно-восстановительного состояния26. В этом исследовании мы впервые использовали молекулярный докинг для изучения взаимодействия между ксантатином (малой молекулой) и белком Keap1 с целью прогнозирования их способа связывания. Впоследствии мы использовали метод CETSA для подтверждения этого взаимодействия, оценив влияние ксантатина на термическую стабильность белка Keap1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Загрузка структур ксантатина и Keap1
- Откройте базу данных PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), введите ксантатин (малую молекулу), затем нажмите «Поиск » и нажмите « Первый результат». Нажмите « Загрузить» и нажмите «Сохранить в 2D-структуре», чтобы сохранить соединение в формате .sdf.
- Загрузите кристаллическую структуру белка.
- Откройте базу данных UniProt (https://www.uniprot.org/), введите Keap1 и нажмите Поиск. Нажмите «Человек » в разделе «Популярные организмы» в левом столбце, а затем нажмите «Первая запись с именем Q14145 » в правом столбце.
- Щелкните Структура под функцией в левом столбце, найдите структуру с идентификатором PDB: 2FLU и нажмите RCSB-PDB. Нажмите «Загрузить файлы» и выберите «Формат PDB», чтобы загрузить кристаллическую структуру белка Keap1.
2. Молекулярный докинг
- Создайте на рабочем столе новую папку с именем molecular docking и сохраните в ней загруженные структуры ксантатина (малой молекулы) и Keap1 (белка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Имя папки и путь к ней должны быть на английском языке. - Откройте программу Maestro, нажмите «Файл», выберите «Изменить рабочий каталог», нажмите «Рабочий стол», дважды щелкните, чтобы выбрать только что созданную папку молекулярного закрепления, и нажмите «Выбрать параметры».
- Обработка малых молекул
- Щелкните Файл и параметры импорта структур, нажмите Рабочий стол, дважды щелкните папку молекулярного стыковки, щелкните xanthatin Structure File, а затем нажмите Открыть, чтобы импортировать файл малых молекул.
- Нажмите Задачи в правом верхнем углу программы и выберите опцию LigPrep. Используйте структуры из рабочей области; остальные параметры являются параметрами по умолчанию и нажмите кнопку Run (Выполнить), чтобы выполнить обработку малых молекул.
- Обработка структуры белка
- Щелкните опции «Файл» и «Импорт структур », выберите «Рабочий стол» и дважды щелкните папку «Молекулярное закрепление ». Щелкните файл Keap1 Protein Structure , а затем нажмите кнопку Открыть , чтобы импортировать файл белковой структуры.
- Нажмите «Задачи» в правом верхнем углу программы и выберите опцию «Мастер приготовления белка». Поставьте галочку напротив опции «Удаление вод выше 5 Å из групп Het» и введите pH 7,4+/-0,0. Нажмите кнопку Предварительная обработка, нажмите кнопку Уточнить, а затем нажмите кнопку Оптимизировать > Удалить воды > Свернуть.
- Нажмите на следующую задачу, когда предыдущая задача будет выполнена. Нажмите Задачи и выберите опцию Карта сайта , используйте настройки по умолчанию для всех параметров и нажмите Выполнить.
- Нажмите File и Import Structures options, нажмите Desktop, дважды щелкните папку молекулярного закрепления и откройте папку с именем sitemap_1. Щелкните первый файл с именем Sitemap_1_out.maegz, а затем нажмите кнопку Открыть.
- Дважды щелкните точку, чтобы выбрать sitemap_1_protein в рабочей области, а затем нажмите Sitemap_1_site_1 , чтобы выбрать ее . Щелкните Задачи и выберите опцию Создание рецепторной сетки .
ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые сайты, предсказанные картой сайта, ранжируются в соответствии с оценкой, причем сайт с самой высокой оценкой находится на первом месте. - Выберите опцию Entry в разделе receptor, остальные параметры не изменились. Нажмите на маленький белый шарик в структуре белка, чтобы создать стыковочный блок размера по умолчанию и изменить имя задания на glide-grid_2FLU. Нажмите кнопку Выполнить.
- Молекулярный докинг
- Щелкните Задачи и выберите параметр Стыковка лигандов. Выберите сетку рецепторов As из файла и нажмите кнопку Обзор. Нажмите «Рабочий стол», дважды щелкните папку молекулярной стыковки, дважды щелкните файл glide-grid_2FLU, щелкните Glide-grid_2FLU.zip файл, а затем нажмите «Открыть».
- Нажмите « Использовать лиганды из файлов» > «Просмотреть > рабочий стол». Дважды щелкните папку молекулярной стыковки, дважды щелкните файл ligprep_1, щелкните файл Ligprep_1-out.maegz и нажмите кнопку Открыть.
- Нажмите Настройки и выберите параметр Точность как XP (дополнительная точность), измените имя задания на glide-dock_XP_2FLU и нажмите Выполнить.
- Просмотр результатов стыковки
- Нажмите File и Import Structures, выберите Desktop и дважды щелкните папку Molecular Docking. Дважды щелкните файл glide-dock_XP_2FLU, файл glide-dock_XP_1_pv.maegz и нажмите кнопку Открыть.
- Дважды щелкните точку, чтобы выбрать лиганд в рабочей области, а затем щелкните, чтобы выбрать sitemap_1_protein. Щелкните Таблица, сдвиньте вправо и просмотрите партитуру в разделе Оценка закрепления.
- Визуализация 2D-результатов
- Дважды щелкните точку, чтобы выбрать лиганд в рабочей области, а затем щелкните, чтобы также выбрать sitemap_1_protein. Щелкните Взаимодействие лиганда > Вид и установите флажок Легенда LID .
- Нажмите «Файл», выберите «Сохранить снимок экрана», введите 6000 по ширине, снимите флажок «Прозрачный фон» и нажмите «ОК». Нажмите «Рабочий стол», назовите файл как 2D-xanthatin-2FLU и сохраните изображение.
- Визуализация 3D-результатов
- Дважды щелкните точку, чтобы выбрать лиганд в рабочей области, а затем щелкните, чтобы также выбрать sitemap_1_protein.
- Нажмите L в меню быстрого выбора, чтобы выбрать малые молекулы, а затем нажмите кнопку Стиль. Нажмите на Вторую строку в стиле, чтобы изменить размер связи с малой молекулой, и нажмите на атомы цвета, чтобы изменить цвет малой молекулы.
- Выделите маленькую молекулу на рисунке, щелкните правой кнопкой мыши, выберите «Развернуть выделение» и выберите 4 Å. Нажмите кнопку Применить надписи в стиле, чтобы отобразить надписи.
- Нажмите на вторую строку в стиле, чтобы изменить размер аминокислотных связей, и нажмите на Атомы цвета , чтобы изменить цвет аминокислоты.
- Нажмите Next > Invert, удерживая клавишу Control, нажмите на первое положение глаз в разделе style, чтобы отобразить только аминокислоты с метками.
- Нажмите « Стиль > ленты», чтобы показать белок в виде стиля ленты, и нажмите «Редактировать ленту » под лентами, чтобы изменить цвет ленты.
- Нажмите на переключатель взаимодействий в правом нижнем углу экрана, нажмите правую кнопку мыши и снимите галочку с контактов/конфликтов.
- Найдите меру в задачах, выберите Расстояние и нажмите на два атома, соединенных желтой пунктирной линией (водородная связь) на экране, чтобы измерить длину водородных связей.
- Нажмите и удерживайте колесико мыши, чтобы повернуть белок, отрегулируйте белок по центру экрана и убедитесь, что каждая аминокислотная метка видна.
- Нажмите «Рабочая область» > «Сохранить изображение как» и нажмите на рабочий стол. Сохраните изображение с разрешением 600dpi по умолчанию, назовите файл 3D-xanthatin-2FLU, выберите тип файла в формате tiff и сохраните изображение.
3. Подготовка образцов для клеточных культур и CETSA
- Клеточная культура
- Добавьте 5 x 106 RAW264,7 клеток/мл в 100-миллиметровую чашку для культивирования и инкубируйте с 6 мл среды DMEM с 10% FBS и 1% антимикотическим раствором антибиотика при 37 °C, влажности 95% и 5%CO2. Приготовьте три блюда и проведите эксперимент, когда клетки достигнут 80% конфлюенции.
- Подготовка образцов CETSA
- Отсадите старую среду, добавьте в каждую посуду 2 мл фосфатного буферного раствора (PBS), подогретого до комнатной температуры, и вымойте 2 раза.
- Добавьте 2 мл PBS в каждую чашку с клетками, перемешайте клетки и соберите клетки в две пробирки для микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Центрифуга при 377 x g в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 2 мл PBS, содержащей 1% смеси ингибиторов протеазы широкого спектра действия. Разделить на отдельные микроцентрифужные пробирки по 1 мл клеточной суспензии в каждой.
- Заморозьте микроцентрифужные пробирки в жидком азоте до белого твердого состояния, затем сразу же разморозьте на водяной бане при температуре 37 °C и повторите 3 раза. Центрифуга при 12 000 x g при 4 °C в течение 10 мин.
- Возьмите две микроцентрифужные пробирки, одну с 100 мкМ ксантатином и другую с равным объемом ДМСО, и добавьте в каждую пробирку 450 мкл центрифугированной надосадочной жидкости, инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин.
- Добавить надосадочную жидкость из двух микроцентрифужных пробирок в 14 ПЦР-пробирок объемом 60 мкл/пробирку и одновременно нагревать пробирки при различных температурах (45 °С, 48 °С, 51 °С, 54 °С, 57 °С, 60 °С и 63 °С) в течение 3 мин с двумя ПЦР-пробирками при каждой температуре для групп ДМСО и ксантатина, соответственно.
- Для ненагреваемой группы берут надосадочную жидкость из каждой из двух микроцентрифужных пробирок и добавляют в 14 пробирок ПЦР, 7 для группы ДМСО и 7 для группы ксантатина, в объеме 60 мкл каждая. Не нагревайте образцы здесь.
- Охладите пробирки при комнатной температуре для нагретой группы. Центрифугируйте все пробирки (нагретые и неподогретые) при 12 000 x g в течение 10 мин при 4 °C и возьмите 48 мкл надосадочной жидкости из каждой пробирки в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 12 μл белкового буфера SDS-PAGE в каждую пробирку, хорошо перемешайте и нагревайте на водяной бане при 100 °C в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные образцы CETSA должны храниться при температуре -80 °C и тестироваться вестерн-блоттингом в течение 1 недели.
4. Вестерн-блот
- Приготовление геля SDS-PAGE
- Промойте одну длинную и одну короткую стеклянную пластину сверхчистой водой. Поместите пластины в паз для зажима, затем на прозрачную доску. Добавьте сверхчистую воду и проверьте герметичность в течение 10 минут.
- Добавьте 8 мл нижнего раствора геля и 8 мл нижнего гелевого буфера в коническую колбу и перемешайте, осторожно встряхивая. Добавьте в раствор геля 160 μл промотора коагулянта и хорошо перемешайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем нижнего слоя клея не должен превышать зеленую линию на зажимном пазе. - Слейте сверхчистую воду с пластин и промокните их насухо фильтровальной бумагой. Добавьте приготовленный нижний раствор геля. Добавьте 2 мл изопропилового спирта и подождите 20 минут для застывания.
- Возьмите 2 мл раствора верхнего геля и 2 мл верхнего гелевого буфера в коническую колбу и перемешайте, осторожно встряхивая колбу.
- Удалите изопропиловый спирт из слоя геля и промокните излишки изопропилового спирта фильтровальной бумагой.
- Добавьте 40 μл промотора коагулянта в смешанный верхний раствор геля, хорошо перемешайте, затем добавьте между длинной и короткой стеклянными пластинами и вставьте гребень 1,5 мм с 15 отверстиями, подождите 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гребень следует вставлять перпендикулярно верхнему слою, чтобы между гребнем и раствором не было пузырьков воздуха.
- Электрофорез
- Добавьте в стакан 1 л сверхчистой воды, добавьте пакетик бегового буферного порошка SDS-PAGE, хорошо перемешайте стеклянным стержнем, добавьте подготовленный гель в установку для электрофореза. Поместите устройство в коробку и вытащите гребень.
- Маркер размораживания и образцы CETSA при комнатной температуре, вихре и спиннинге. Добавьте 2,5 мкл маркера в первую лунку и 20 мкл проб CETSA в каждую из оставшихся лунок в соответствии с заданной последовательностью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы CETSA добавляли последовательно в соответствии с температурной обработкой, описанной на этапе 3.2.6, в диапазоне от 45°С до 63°С; сначала была добавлена группа ДМСО, затем группа ксантатина (рис. 1). - Добавьте оставшийся раствор электрофореза в блок электрофореза, закройте крышку и вставьте электрод, положительный полюс к положительному полюсу, отрицательный полюс к отрицательному полюсу.
- Включите выключатель питания и отрегулируйте переключатель напряжения на 80 В, чтобы начать электрофорез.
- Перенос на мембрану
- Добавьте в стакан 850 мл сверхчистой воды, 100 мл безводного этанола и 50 мл буфера для быстрого переноса и хорошо перемешайте. Подготовьте пенокартон, пластиковые ножи, пинцеты, лотки и устройства для переноса мембраны.
- Разрежьте мембрану PVDF в соответствии с размером геля, отметьте ее и замочите в метаноле на 30 секунд, чтобы активировать ее.
- Налейте раствор для переноса в лоток, установите и откройте зажимы для переноса, положите губку и три слоя фильтровальной бумаги для переноса.
- Остановите электрофорез, а затем откройте крышку бокса для электрофореза. Возьмите устройство для электрофореза, вылейте раствор для электрофореза и снимите пластину. Поместите пластину на пенопластовую доску, аккуратно подденьте ее пластиковым ножом и разрежьте гель, чтобы четко визуализировать белковый маркер и целевые белки.
- Придерживайте пинцетом одну сторону маркера, промойте его в лотке с трансмембранным раствором и положите на фильтровальную бумагу. Окуните активированную мембрану PVDF в раствор для переноса, придерживайте меченую сторону пинцетом и накройте гель лицевой стороной вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркированная сторона мембраны PVDF является лицевой стороной, и обратите внимание на то, что в процессе укладки не образуются пузырьки. - Поместите два слоя фильтровальной бумаги для переноса и один слой губчатой прокладки на мембрану из ПВДФ, накройте и зажмите зажимы для переноса и поместите их в резервуар для переноса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Черный цвет зажима для переноса на черный цвет слота для переноса. - Добавьте оставшийся трансмембранный раствор в трансмембранную кассету, накройте крышкой, положительная на положительную, отрицательную на отрицательную.
- Отрегулируйте ток на 400 мА, время на 30 мин, а затем нажмите Run, чтобы начать передачу мембраны при комнатной температуре.
- Блокировка
- Добавьте 2 л сверхчистой воды в стеклянный флакон, добавьте пакетик порошка TBS, а затем добавьте 2 мл Tween, чтобы получить раствор TBST. Взвесьте порошок БСА, чтобы приготовить 5% раствор БСА с TBST, и добавьте 6 мл раствора БСА в инкубационный бокс.
- Остановите перенос мембраны, а затем откройте зажим для переноса. Зажмите маркерную сторону мембраны PVDF и поместите ее в инкубационный бокс. Поместите инкубационный бокс на шейкер и заблокируйте на 1,5 ч при комнатной температуре.
- Инкубация первичного антитела
- Приготовьте первичное антитело (подробнее см. Таблицу материалов ) с 5% раствором БСА в соотношении 1:1000, утилизируйте раствор БСА в инкубаторной коробке и добавьте 6 мл первичного антитела в инкубационную коробку. Поместите инкубационный ящик в пенопластовую коробку с пакетами со льдом и держите его на шейкере в течение ночи.
- Инкубация вторичных антител
- На следующий день соберите первичное антитело в инкубационную коробку, затем добавьте 6 мл раствора TBST и поместите его в шейкер для мытья на 5 минут.
- Смытый раствор TBST слить и добавить свежий для стирки; Повторите 5 раз и приготовьте вторичное антитело с 5% раствором БСА при температуре 1:5000.
- Слейте раствор TBST и добавьте в инкубационный бокс 6 мл вторичного антитела. Поместите инкубационный ящик на шейкер и инкубируйте в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
- Соберите вторичное антитело (подробнее см. Таблицу материалов ), затем добавьте 6 мл раствора TBST и поместите его в шейкер для мытья на 5 минут. Смытый раствор TBST слить и добавить свежий для стирки; Повторите 5 раз.
- Экспонирование полосок
- Сохраните раствор TBST в конце последней стирки. Возьмите равные объемы хемилюминесцентных реагентов А и В, встряхните и хорошо перемешайте. Защитите раствор от света.
- Откройте систему визуализации геля, нажмите «Образцы», проверьте калибровку, дождитесь завершения калибровки, а затем нажмите « Маркер», проверьте калибровку.
- Возьмите пинцетом маркерную сторону полоски и полностью погрузите в раствор хемилюминесцентного реагента. Зажмите одну сторону маркера, чтобы поместить полоску вниз в тепловизор, закройте крышку тепловизора, нажмите «Экспозиция» и установите время экспозиции на 1 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Застройщик должен полностью покрыть полосу, а застройка должна находиться в темной среде. - Нажмите кнопку Сохранить, присвойте изображению имя и сохраните его как файл .tif. Проанализируйте оптическую плотность западного блота. Серые значения каждой температуры в группе ДМСО сравнивались со значениями грея 45 °C, а серые значения каждой температуры в группе ксантатина сравнивались со значениями серого ксантатина при 45 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Молекулярный докинг-анализ предсказал взаимодействие между ксантатином и белком Keap1. На рисунке 2 показано образование водородных связей между ксантатином и аминокислотными остатками Gly-367 и Val-606 белка Keap1 с длиной водородной связи 2,17 Å для Gly-367 и 2,13 Å для Val-606. Кроме того, расчетный показатель докинга -5,69 ккал/моль означает хорошее сродство связывания между ксантатином и белком Keap1.
Метод CETSA показал, что связывание ксантатина смещает термическую стабильность белка Keap1, подтверждая взаимодействие между ксантатином и белком21 Keap1. На рисунке 3 показано, что ксантатин значительно смещает термическую стабильность белка Keap1 в диапазоне температур от 48 °C до 57 °C по сравнению с группой ДМСО. Чтобы обеспечить равномерную нагрузку образца, во-первых, плотность инокуляции клеток, в которой мы проводили эксперименты, была постоянной; во-вторых, образцы клеток из группы ДМСО и группы ксантатина хорошо перемешивали в чашках для клеточных культур, а затем равномерно распределяли по двум микроцентрифужным пробиркам, что обеспечивало постоянное количество образцов клеток, и объем надосадочной жидкости, добавляемой в каждую ПЦР-пробирку, составлял 60 мкл, и, наконец, объем каждого образца, загруженного в вестерн-блот, составлял 20 мкл, что обеспечивало равную нагрузку для нагретых образцов. Деградация белка в образцах при температуре около 51 °C в основном связана с изменениями в структуре белка и ускоренными химическими реакциями, вызванными высокими температурами. Приведенные выше результаты демонстрируют, что ксантатин может напрямую связываться с белком Keap1.
Рисунок 1: Порядок загрузки вестерн-блота. Температура в порядке слева направо: 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C и 63 °C. Первая полоса была добавлена маркером; для каждой температуры использовались две дорожки; первая полоса была группой ДМСО, а вторая полоса — группой ксантатина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Взаимодействие между ксантатином и белком Keap1 (PDB: 2FLU). (A) 2D-представление связывания ксантатина с Keap1. (B) 3D-визуализация ксантатина и белка Keap1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние ксантатина на термическую стабильность белка Keap1. (A) Влияние ксантатина на термическую стабильность Keap1 было обнаружено CETSA. (B) Оптические плотности Keap1 нормализовали до значений, полученных при 45 °C. Данные представлены в виде среднего ± SD. Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа (однофакторный ANOVA). n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Идентификация мишеней болезней и открытие и разработка лекарств тесно взаимосвязаны27. Точно нацеливаясь на конкретные мишени, можно разработать лекарственные препараты-кандидаты для более эффективного лечения конкретных заболеваний, одновременно минимизируя побочные эффекты, связанные с лекарственными препаратами. Наиболее часто используемыми мишенями являются белковые мишени30. Однако идентификация специальных белковых мишеней представляет собой огромную проблему из-за большого разнообразия белков в клетках30,31. В этой статье мы применили подход, который сочетает молекулярный докинг с CETSA для идентификации и проверки белковых мишеней. Результаты выявили прямое взаимодействие между ксантатином и белком Keap1. Интеграция компьютерных технологий и биологических экспериментов также может быть использована при исследовании других лекарств и белковых мишеней, чтобы установить наличие прямого взаимодействия между лекарственным препаратом и мишенью. Этот подход, сочетающий прогнозирование с проверкой, эффективно сокращает как затраты времени, так и экономические затраты. Кроме того, экспериментальные приборы и материалы легко достать, а процесс эксплуатации не сложен. Наконец, образцы CETSA легко подготавливаются и тестируются методом вестерн-блоттинга, что обеспечивает воспроизводимость образцов.
По нашему опыту, есть несколько критических аспектов, которые требуют особого внимания во время экспериментальных процедур. Во-первых, важно выбрать кристаллическую структуру белка, разрешенную рентгеноструктурным анализом, при выборе структуры белка перед молекулярным докингом. Во-вторых, плотность клеток и время замораживания/размораживания являются решающими факторами в экспериментах CETSA. Клетки в логарифмической фазе роста следует отбирать для экспериментов CETSA, так как их состояние роста стабильно и оказывает минимальное влияние на результаты экспериментов. Во время повторного замораживания и размораживания клеток следует хорошо контролировать время с помощью жидкого азота, используемого для замораживания, до получения белой твердой формы с последующим немедленным размораживанием при комнатной температуре перед последующими циклами замораживания. Наконец, эксперименты с вестерн-блоттингом должны быть завершены сразу после подготовки образцов CETSA для предотвращения деградации белка.
Молекулярный докинг и CETSA являются хорошо зарекомендовавшими себя методами, которые играют решающую роль в области разработки лекарств. Молекулярный докинг играет важную роль в предсказании взаимодействий на молекулярном уровне между соединениями и их мишенями, предлагая ценную информацию о потенциальных способах связывания10,11. CETSA, напротив, фокусируется на оценке влияния лекарств на термостабильность белка и служит инструментом для валидации лекарственно-белковых взаимодействий17. Хотя CETSA является относительно простым методом верификации, он также является низкопроизводительным способом с использованием вестерн-блоттинга для изучения теплового сдвига лекарственно-белкового комплекса, и он не должен быть единственным методом, на который следует полагаться. Кроме того, этапы CETSA сложны, и любые ошибки в шагах во время операции могут оказать большое влияние на результаты. Кроме того, метод CETSA не может определить специфический сайт связывания и способ связывания соединения с белковой мишенью и не может указать, является ли связывание ковалентным или нековалентным 17,18,23. Помимо анализа теплового сдвига, для изучения лиганд-белковых взаимодействий также могут быть использованы другие виды энергетического анализа, такие как pH-зависимое осаждение белка (pHDPP). Кроме того, термическое протеомное профилирование является энергетическим методом выявления лиганд-белковых взаимодействий, позволяющим проводить высокопроизводительный, крупномасштабный анализ белково-лекарственных взаимодействий путем сочетания протеомики с CETSA33.
Кроме того, локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR) может обеспечить дальнейший качественный и количественный анализ34,35. Он не только определяет существование взаимодействий между лекарственным препаратом и его мишенью, но также измеряет параметры сродства и кинетические параметры этих межмолекулярных взаимодействий, предлагая более полное понимание.
Помимо анализа теплового сдвига, pH-зависимое осаждение белка (pHDPP) также может быть использовано для изучения лиганд-белковых взаимодействий32. Молекулярный докинг — это физико-механический метод моделирования для прогнозирования взаимодействий между малыми молекулами и биомолекулами. Этот метод направлен на достижение связывания путем оптимизации конформации и ориентации малых молекул для получения наилучшей комплементарности между ними и биомолекулами. Target prediction использует методы искусственного интеллекта для предсказания сайтов связывания между малыми молекулами и биомолекулами. Эти два подхода имеют ключевые различия в применении методов и точности прогнозирования. Применение метода: молекулярный докинг в основном используется для разработки и оптимизации лекарств, обеспечивая теоретическую основу для открытия новых лекарств. Прогнозирование мишеней с помощью более совершенного искусственного интеллекта чаще применяется для высокопроизводительного скрининга и быстрого обнаружения соединений свинца для повышения эффективности поиска лекарств. Точность прогнозирования: Поскольку молекулярный докинг основан на физическом моделировании, точность его предсказания выше, но вычислительные затраты также относительно высоки. Хотя прогнозирование цели требует меньших вычислительных затрат, точность прогнозирования зависит от обилия обучающих данных и выбора модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82004031) и Сычуаньской научно-технической программой (2022NSFSC1303). Выражаем огромную благодарность Цзяи Сунь из Инновационного института китайской медицины и фармации Университета традиционной китайской медицины Чэнду за помощь в проведении вестерн-блоттинга.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A.
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
