Summary
Eksperimentet som brukes her viser en metode for molekylær dokking kombinert med cellulær termisk skiftanalyse for å forutsi og validere samspillet mellom små molekyler og proteinmål.
Abstract
Proteiner er grunnleggende for menneskelig fysiologi, med sine mål som er avgjørende i forskning og stoffutvikling. Identifisering og validering av viktige proteinmål har blitt integrert i stoffutvikling. Molekylær docking er et beregningsverktøy som er mye brukt for å undersøke proteinligandbinding, spesielt i sammenheng med legemiddel- og proteinmålinteraksjoner. For eksperimentell verifisering av bindingen og for å få tilgang til bindingen av legemidlet og dets mål direkte, brukes metoden for cellulær termisk skiftanalyse (CETSA). Denne studien hadde som mål å integrere molekylær dokking med CETSA for å forutsi og validere interaksjoner mellom medisiner og vitale proteinmål. Spesielt forutslo vi samspillet mellom xanthatin og Keap1-protein, så vel som dets bindingsmodus gjennom molekylær dokkinganalyse, etterfulgt av verifisering av interaksjonen ved hjelp av CETSA-analysen. Våre resultater viste at xanthatin kunne etablere hydrogenbindinger med spesifikke aminosyrerester av Keap1-protein og redusere termostabiliteten til Keap1-proteinet, noe som indikerer at xanthatin kunne interagere direkte med Keap1-protein.
Introduction
Proteiner er svært viktige makromolekyler i levende organismer og har et mangfoldig utvalg av unike funksjoner i celler, som membransammensetning, cytoskjelettdannelse, enzymaktivitet, transport, cellesignalering og involvering i både intracellulære og ekstracellulære mekanismer 1,2,3. Proteiner manifesterer sine biologiske funksjoner primært gjennom spesifikke interaksjoner med en rekke molekyler, inkludert andre proteiner, nukleinsyrer, små molekylligander og metallioner 1,4. Ligander er små molekylære forbindelser som spesifikt binder seg til proteiner i en organisme. Samspillet mellom proteiner og ligander skjer på bestemte steder på proteinet, kalt bindingsstedene, også kjent som bindingslommene5. I medisinsk kjemiforskning ligger fokuset i å identifisere nøkkelproteiner som er tydelig forbundet med sykdommer, som tjener som mål for legemidler6. Derfor er det av største betydning å få en dyp forståelse av bindingsstedene mellom proteiner og ligander for å fremme narkotikaforskning, design og forskning 7,8.
Molekylær docking er et mye brukt beregningsverktøy for å studere proteinligandbinding, som benytter de tredimensjonale strukturer av proteiner og ligander for å utforske deres primære bindingsmoduser og affiniteter når de danner stabile komplekser 9,10,11. Anvendelsen av molekylær dokkingteknologi stammer fra 1970-tallet. Basert på lås- og nøkkelparingsprinsippet og bruk av algoritmene til molekylær dokkingprogramvare, kan man bestemme samspillet mellom forbindelser og molekylære mål ved å analysere dokkingresultater. Denne tilnærmingen muliggjør prediksjon av aktive bindingssteder for både forbindelsen og målmolekylet. Følgelig letter det identifiseringen av en optimal bindingskonformasjon (her kalt bindingsmodellen) for ligand-reseptor-interaksjoner, noe som er avgjørende for å forstå mekanikken til disse molekylære engasjementene 12,13,14,15. Mens molekylær dokking gir verdifulle datamaskinbaserte spådommer om ligand-reseptorinteraksjoner, er det viktig å merke seg at dette er foreløpige funn. Følgelig er ytterligere eksperimentell verifisering avgjørende for å bekrefte disse interaksjonene.
Den cellulære termiske skiftanalysen (CETSA), opprinnelig foreslått av Pär Nordlunds forskerteam i 2013, fungerer som en metode for å validere legemiddelmålproteininteraksjoner. Denne teknikken tester spesifikt den termiske stabiliteten til målproteiner indusert av legemiddelbinding, og gir en praktisk tilnærming for å bekrefte molekylære interaksjoner 16,17,18. Denne tilnærmingen er basert på det grunnleggende prinsippet om at ligandbinding initierer et termisk skifte innen målproteiner og gjelder for et bredt spekter av biologiske prøver, inkludert cellelysater, intakte levende celler og vev19,20. CETSA støtter direkte målengasjement av små molekyler i intakte celler ved å oppdage termodynamisk stabilisering av proteiner på grunn av ligandbinding og koble den observerte fenotypiske responsen til målforbindelsen21,22. Blant de ulike metodene hentet fra CETSA, anses Western Blot-CETSA (WB-CETSA) som en klassisk tilnærming. Etter prøvepreparering ved bruk av CETSA-metoden brukes western blot-analyse for å oppdage endringer i målproteinets termiske stabilitet. Dette muliggjør presis bestemmelse av legemiddel-protein-interaksjoner i cellulære systemer17,23.
Xanthatin er en bioaktiv forbindelse isolert fra planten Xanthium L. med egenskaper som antiinflammatorisk, som har blitt brukt i tradisjonell kinesisk medisin for å behandle sykdommer som nasal bihulebetennelse og leddgikt24,25. Det kelch-lignende ECH-assosierte protein 1 (Keap1) er en komponent i det Cullin3-baserte Cullin-RING E3 ubiquitin ligase multi-subenhet proteinkomplekset og en viktig regulator av intracellulær redokshomeostase, som påvirker intensiteten og varigheten av den inflammatoriske responsen ved å modulere den intracellulære redokstilstanden26. I denne studien benyttet vi først molekylær docking for å undersøke samspillet mellom xanthatin (lite molekyl) og Keap1-protein, med sikte på å forutsi deres bindingsmodus. Deretter benyttet vi CETSA-metoden for å validere denne interaksjonen ved å vurdere virkningen av xanthatin på den termiske stabiliteten til Keap1-proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laste ned strukturene til xanthatin og Keap1
- Åpne PubChem-databasen (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), skriv inn xanthatin (lite molekyl), trykk deretter Søk og klikk på Det første resultatet. Klikk på Last ned og klikk Lagre under 2D-struktur for å lagre forbindelsen i .sdf-format.
- Last ned krystallstrukturen til proteinet.
- Åpne UniProt-databasen (https://www.uniprot.org/), skriv inn Keap1 og klikk på Søk. Klikk Menneske under populære organismer i venstre kolonne, og klikk deretter på Den første oppføringen med navnet Q14145 i høyre kolonne.
- Klikk på Struktur under funksjonen i venstre kolonne, finn strukturen med PDB ID: 2FLU, og klikk på RCSB-PDB. Klikk på Last ned filer og velg PDB-format for å laste ned krystallstrukturen til Keap1-proteinet.
2. Molekylær dokking
- Opprett en ny mappe med navnet molekylær docking på skrivebordet og lagre de nedlastede xanthatin (lite molekyl) og Keap1 (protein) strukturer i denne mappen.
MERK: Mappenavn og bane må være på engelsk. - Åpne Maestro-programvaren, klikk på Fil, velg Endre arbeidskatalog, klikk på skrivebordet, dobbeltklikk for å velge den nyopprettede molekylære dokkingmappen og klikk Velg alternativer.
- Behandling av små molekyler
- Klikk Alternativer for fil og importstrukturer, klikk på skrivebordet, dobbeltklikk på molekylær dockingmappe, klikk på xanthatin Structure File, og klikk deretter Åpne for å importere liten molekylfil.
- Klikk på Oppgaver i øvre høyre hjørne av programvaren og velg alternativet LigPrep . Bruk strukturer fra arbeidsområdet; resten av parametrene er standardparametrene og klikk Kjør for å utføre småmolekylbehandling.
- Protein struktur behandling
- Klikk alternativene Fil og Importer strukturer , klikk Skrivebord, og dobbeltklikk på mappen Molecular Docking . Klikk på Keap1 Protein Structure-filen , og klikk deretter Åpne for å importere proteinstrukturfilen.
- Klikk på Oppgaver i øvre høyre hjørne av programvaren og velg alternativet Protein Preparation Wizard. Merk av i boksen før du sletter farvann utover 5 Å fra hetegrupper og skriv inn en pH på 7,4+/-0,0. Klikk Forprosess, klikk Finjuster, og klikk deretter Optimaliser > Fjern vann > minimer.
- Klikk på neste oppgave når forrige oppgave er fullført. Klikk Oppgaver og velg alternativet Områdekart , bruk standardinnstillinger for alle parametere, og klikk Kjør.
- Klikk Alternativer for fil og importstrukturer , klikk på skrivebordet, dobbeltklikk på den molekylære dokkingmappen, og åpne mappen med navnet sitemap_1. Klikk den første filen med navnet Sitemap_1_out.maegz, og klikk deretter Åpne.
- Dobbeltklikk på prikken for å velge sitemap_1_protein i arbeidsområdet, og klikk deretter på Sitemap_1_site_1 for å velge den . Klikk på Oppgaver og velg alternativet Generering av reseptorrutenett .
MERK: Proteinsidene som forutsies av nettstedskartet, er rangert i henhold til poengsummen, med det høyest scorende stedet i utgangspunktet. - Velg alternativet Oppføring under reseptor, med de resterende parametrene uendret. Klikk på den lille hvite ballen i proteinstrukturen for å generere en dokkingboks med standardstørrelse og endre jobbnavnet til glide-grid_2FLU. Klikk Kjør.
- Molekylær dokking
- Klikk på Oppgaver og velg alternativet Ligand Docking . Velg Receptor Grid As fra filen, og klikk på Bla gjennom. Klikk på skrivebordet, dobbeltklikk på molekylær dokkingmappe, dobbeltklikk på glide-grid_2FLU-fil, klikk Glide-grid_2FLU.zip fil, og klikk deretter Åpne.
- Klikk på Bruk ligander fra filer > bla >gjennom skrivebordet. Dobbeltklikk på den molekylære dokkingmappen, dobbeltklikk på ligprep_1 filen, klikk Ligprep_1-out.maegz-filen, og klikk deretter Åpne.
- Klikk på Innstillinger og velg alternativet Presisjon som XP (ekstra presisjon), endre jobbnavnet til glide-dock_XP_2FLU, og klikk Kjør.
- Vise forankringsresultater
- Klikk Alternativer for fil og importstrukturer , klikk Skrivebord, og dobbeltklikk på mappen Molecular Docking . Dobbeltklikk på glide-dock_XP_2FLU filen, klikk glide-dock_XP_1_pv.maegz-filen og klikk deretter Åpne.
- Dobbeltklikk på prikken for å velge ligand i arbeidsområdet, og klikk deretter for å velge sitemap_1_protein. Klikk Tabell, skyv helt til høyre, og vis poengsummen under forankringspoengsum.
- Visualisering av 2D-resultater
- Dobbeltklikk på prikken for å velge ligand i arbeidsområdet, og klikk deretter for å velge sitemap_1_protein. Klikk Ligand-interaksjon > Visning , og merk av for LID-forklaring .
- Klikk filet, velg Lagre skjermbilde, skriv inn 6000 i bredden, fjern merket for Gjennomsiktig bakgrunn og klikk OK. Klikk på Desktop, navngi filen som 2D-xanthatin-2FLU, og lagre bildet.
- Visualisering av 3D-resultater
- Dobbeltklikk på prikken for å velge ligand i arbeidsområdet, og klikk deretter for å velge sitemap_1_protein.
- Klikk L i Hurtigvalg for å merke små molekyler, og klikk deretter Stil. Klikk på den andre linjen i stilen for å endre størrelsen på småmolekylbindingen og klikk på fargeatomene for å endre fargen på det lille molekylet.
- Velg det lille molekylet i figuren, klikk på høyre museknapp, velg Utvid utvalg, og velg 4 Å. Klikk Bruk etiketter med stil for å vise etikettene.
- Klikk på den andre linjen i stilen for å endre størrelsen på aminosyrebindinger og klikk på fargeatomer for å endre aminosyrefarge.
- Klikk på Neste > Inverter, hold nede kontrolltasten og klikk på den første øyeposisjonen under stil for å vise bare aminosyrene med etiketter.
- Klikk på Style > Ribbons for å vise proteinet som en båndstil og klikk på Rediger bånd under bånd for å endre båndfargen.
- Klikk på Interaksjoner Veksle nederst til høyre på skjermen, klikk på høyre museknapp og fjern merket for kontakter / sammenstøt.
- Søk etter mål i oppgaver, velg Avstand, og klikk på de to atomene forbundet med den gule stiplede linjen (hydrogenbinding) i skjermen for å måle hydrogenbindingslengder.
- Trykk og hold musehjulet for å rotere proteinet, juster proteinet til midten av skjermen, og sørg for at hver aminosyreetikett er synlig.
- Klikk Arbeidsområde > Lagre bilde som og klikk på skrivebordet. Lagre bildet som 600dpi som standard, navngi filen som 3D-xanthatin-2FLU, velg filtype som tiff-format, og lagre bildet.
3. Cellekultur og klargjøring av CETSA-prøver
- Cellekultur
- Tilsett 5 x 106 RAW264.7 celler/ml i en 100 mm dyrkningsfat og inkuber med 6 ml DMEM medium med 10% FBS og 1% antibiotika-antimykotisk oppløsning ved 37 °C, 95% fuktighet og 5% CO2. Forbered tre retter og utfør eksperimentet når cellene når 80% konfluens.
- Forberedelse av CETSA-prøver
- Aspirer det gamle mediet, tilsett 2 ml fosfatbuffersaltvann (PBS) oppvarmet til romtemperatur til hver tallerken, og vask 2x.
- Tilsett 2 ml PBS til hver tallerken med celler, bland cellene og samle celler i to 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 377 x g i 3 min ved romtemperatur.
- Kast supernatant- og resuspendasjonscellene med 2 ml PBS inneholdende 1 % bredspektret proteasehemmerblandinger. Del inn i individuelle mikrosentrifugerør med 1 ml cellesuspensjon i hver.
- Frys mikrosentrifugerørene i flytende nitrogen til de er hvite, faste stoffer, tine deretter umiddelbart i et vannbad på 37 °C og gjenta 3x. Sentrifuge ved 12 000 x g ved 4 °C i 10 minutter.
- Ta to mikrosentrifugerør, ett med 100 μM xanthatin og ett med like stort volum DMSO, og tilsett 450 μL sentrifugert supernatant til hvert rør, inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- Tilsett supernatanten fra de to mikrosentrifugerørene til 14 PCR-rør med et volum på 60 μL/rør, og varmerør samtidig ved varierende temperaturer (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C og 63 °C) i 3 minutter, med to PCR-rør ved hver temperatur, for DMSO- og xanthatingruppene, henholdsvis.
- For den uoppvarmede gruppen, ta supernatant fra hvert av de to mikrosentrifugerørene og legg til 14 PCR-rør, 7 for DMSO-gruppen og 7 for xanthatin-gruppen, i et volum på 60 μL hver. Ikke varm opp prøvene her.
- Avkjøl rørene ved romtemperatur for den oppvarmede gruppen. Sentrifuger alle rørene (oppvarmet og uoppvarmet) ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C og ta 48 μl supernatant fra hvert rør til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 12 μL SDS-PAGE proteinlastebuffer i hver tube, virvel for å blande godt, og varm opp i et vannbad ved 100 °C i 5 minutter.
MERK: Tilberedte CETSA-prøver må oppbevares ved -80 °C og testes av western blot innen 1 uke.
4. Vestlig blott
- Fremstilling av SDS-PAGE gel
- Skyll en lang og en kort glassplate med ultrarent vann. Plasser platene i klemmesporet, deretter på et gjennomsiktig brett. Tilsett ultrarent vann og sjekk lekkasjen i 10 minutter.
- Tilsett 8 ml lavere gelløsning og 8 ml lavere gelbuffer i en konisk kolbe og bland ved å riste forsiktig. Tilsett 160 μL koagulantpromotor til geloppløsningen og bland godt.
NOTAT: Volumet på det nedre limlaget bør ikke overstige den grønne linjen på klemmesporet. - Tøm det ultrarene vannet fra platene og tørk dem tørre med filterpapir. Tilsett den tilberedte nedre gelløsningen. Tilsett 2 ml isopropylalkohol og vent i 20 minutter for størkning.
- Ta 2 ml øvre geloppløsning og 2 ml øvre gelbuffer i en konisk kolbe og bland ved å riste kolben forsiktig.
- Fjern isopropylalkoholen fra gellaget og fjern overflødig isopropylalkohol med filterpapir.
- Tilsett 40 μL koagulantpromotor til den blandede øvre gelløsningen, bland godt, tilsett deretter mellom de lange og korte glassplatene og sett inn en 1,5 mm 15-hulls kam, vent i 20 minutter.
MERK: Kammen skal settes vinkelrett på det øvre laget, uten luftbobler mellom kammen og løsningen.
- Elektroforese
- Tilsett 1 liter ultrarent vann til et begerglass, tilsett en pose med SDS-PAGE løpende bufferpulver, rør godt med en glassstang og tilsett den tilberedte gelen til elektroforeseenheten. Plasser enheten i esken og trekk ut kammen.
- Tine markør- og CETSA-prøver ved romtemperatur, virvel og spinn ned. Legg til 2,5 μL markør til den første brønnen og 20 μL CETSA-prøver til hver av de gjenværende brønnene i henhold til den forhåndsbestemte sekvensen.
MERK: CETSA-prøver ble tilsatt suksessivt i henhold til temperaturbehandling beskrevet i trinn 3.2.6 fra 45 °C til 63 °C; DMSO-gruppen ble lagt til først, deretter xanthatingruppen (figur 1). - Legg den gjenværende elektroforeseløsningen til elektroforeseenheten, lukk lokket og sett inn elektroden, positiv pol til positiv pol, negativ pol til negativ pol.
- Slå PÅ strømbryteren og juster spenningsbryteren til 80 V for å starte elektroforese.
- Overføring til membran
- Tilsett 850 ml ultrarent vann, 100 ml vannfri etanol og 50 ml rask overføringsbuffer til et beger og rør godt. Forbered skumbrett, plastkniver, pinsett, skuffer og membranoverføringsanordninger.
- Klipp PVDF-membranen i henhold til størrelsen på gelen, merk den og suge den i metanol i 30 sekunder for å aktivere den.
- Hell overføringsløsningen i skuffen, plasser og åpne overføringsklemmene, og plasser en svamppute og tre lag overføringsfilterpapir.
- Stopp elektroforese og åpne deretter lokket på elektroforeseboksen. Ta elektroforeseanordningen, hell ut elektroforeseoppløsningen og fjern platen. Plasser platen på skumbrettet, lirk den forsiktig av med en plastkniv og kutt gelen for å tydelig visualisere proteinmarkøren og målproteinene.
- Hold den ene siden av markøren med pinsett, vask den i et brett som inneholder transmembranløsningen, og legg den flatt på filterpapir. Dypp den aktiverte PVDF-membranen i overføringsløsningen, hold den merkede siden med pinsett og dekk gelen med forsiden ned.
MERK: Den PVDF membranmerkede siden er forsiden og vær oppmerksom på at ingen bobler genereres under plasseringsprosessen. - Plasser to lag overføringsfilterpapir og ett lag svamppute på PVDF-membranen, dekk til og klem overføringsklemmene og sett dem i overføringstanken.
MERK: Svart farge på overføringsklipp til svart farge på overføringssporet. - Legg den gjenværende transmembranløsningen til transmembrankassetten, deksel med lokket, positiv til positiv, negativ til negativ.
- Juster strømmen til 400 mA, tid til 30 min, og trykk deretter på Kjør for å begynne å overføre membranen ved romtemperatur.
- Blokkerer
- Tilsett 2 liter ultrarent vann til et hetteglass, tilsett en pose TBS-pulver, og tilsett deretter 2 ml Tween for å lage TBST-løsning. Vei BSA-pulveret for å tilberede en 5 % BSA-løsning med TBST og tilsett 6 ml BSA-oppløsning til inkubasjonsboksen.
- Stopp membranoverføringen og åpne deretter overføringsklemmen. Klem markørsiden av PVDF-membranen og legg den i inkubasjonsboksen. Plasser inkubasjonsboksen på en shaker og blokker i 1,5 time ved romtemperatur.
- Inkubasjon av primært antistoff
- Forbered det primære antistoffet (se materialfortegnelse for detaljer) med 5% BSA-løsning ved 1:1000, resirkuler BSA-løsningen i inkubatorboksen, og tilsett 6 ml primært antistoff til inkubasjonsboksen. Legg inkubasjonsboksen i en skumboks med ispakker og hold den på en shaker over natten.
- Inkubasjon av sekundært antistoff
- Samle det primære antistoffet i inkubasjonsboksen neste dag, tilsett deretter 6 ml TBST-oppløsning og legg det på en shaker for å vaske i 5 minutter.
- Hell av den vaskede TBST-løsningen og tilsett frisk til vask; gjenta 5x og klargjør det sekundære antistoffet med 5% BSA-oppløsning ved 1:5000.
- Hell av TBST-oppløsningen og tilsett 6 ml sekundært antistoff til inkubasjonsboksen. Plasser inkubasjonsboksen på en shaker og inkuber i 1,5 time ved romtemperatur.
- Samle det sekundære antistoffet (se materialfortegnelsen for detaljer), tilsett deretter 6 ml TBST-oppløsning og legg den på en shaker for å vaske i 5 minutter. Hell av den vaskede TBST-løsningen og tilsett frisk til vask; Gjenta 5x.
- Eksponerer stripene
- Behold TBST oppløsningen på slutten av siste vask. Ta like store mengder kjemiluminescerende reagenser A og B, rist og bland godt. Beskytt oppløsningen mot lys.
- Åpne gelbildesystemet, klikk på Prøver, sjekk kalibreringen, vent til kalibreringen er fullført, og klikk deretter på Markør, sjekk kalibreringen.
- Plukk opp markørsiden av stripen med pinsett og senk helt ned i den kjemiluminescerende reagensløsningen. Klem den ene siden av markøren for å plassere stripen med forsiden ned i bildeapparatet, lukk lokket på bildeapparatet, klikk på Eksponering og sett eksponeringstiden til 1 s.
MERK: Utvikleren må helt dekke stripen, og utviklingen skal være i et mørkt miljø. - Klikk Lagre, gi bildet et navn, og lagre det som en .tif fil. Analyser den optiske tettheten til western blot. De grå verdiene for hver temperatur i DMSO-gruppen ble sammenlignet med de grå verdiene på 45 °C, og de grå verdiene for hver temperatur i xanthatin-gruppen ble sammenlignet med de grå verdiene av xanthatin ved 45 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Molekylær dokkinganalyse forutsa samspillet mellom xanthatin og Keap1-protein. Figur 2 viser dannelsen av hydrogenbindinger mellom xanthatin og aminosyrerester Gly-367 og Val-606 av Keap1-protein, med en hydrogenbindingslengde på 2,17 Å for Gly-367 og 2,13 Å for Val-606. I tillegg betyr den beregnede dokkingpoengsummen på -5,69 kcal / mol en god bindingsaffinitet mellom xanthatin og Keap1-protein.
CETSA-metoden viste at xanthatinbinding skiftet termisk stabilitet av Keap1-protein, og bekreftet samspillet mellom xanthatin og Keap1-protein21. Figur 3 indikerer at xanthatin bemerkelsesverdig skifter den termiske stabiliteten til Keap1-protein innenfor temperaturområdet 48 ° C til 57 ° C, sammenlignet med DMSO-gruppen. For å sikre lik prøvebelastning var for det første tettheten av celleinokulasjon der vi utførte forsøkene konsistent; For det andre ble celleprøvene fra DMSO-gruppen og xanthatin-gruppen blandet godt i cellekulturskålene og ble deretter likt fordelt i to mikrosentrifugerør, noe som sikret den konsistente mengden celleprøver, og volumet av supernatant tilsatt til hvert PCR-rør var 60 μL, og til slutt var volumet av hver prøve lastet opp i Western blot 20 μL, som sørget for lik belastning for oppvarmede prøver. Proteinnedbrytning i prøver fra rundt 51 °C skyldes hovedsakelig endringer i proteinstruktur og akselererte kjemiske reaksjoner forårsaket av høye temperaturer. Resultatene ovenfor viser at xanthatin kan binde seg direkte til Keap1-protein.
Figur 1: Lasterekkefølge for western blot. Temperaturen fra venstre mot høyre var 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C og 63 °C. Det første kjørefeltet ble lagt til med en markør; to baner ble brukt for hver temperatur; den første banen var DMSO-gruppen, og den andre banen var Xanthatin-gruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Interaksjon mellom xanthatin og Keap1 (PDB: 2FLU) protein. (A) 2D-representasjonen av xanthatinbinding til Keap1. (B) 3D-visualiseringen av xanthatin og Keap1-protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av xanthatin på termisk stabilitet av Keap1-protein. (A) Effektene av xanthatin på den termiske stabiliteten til Keap1 ble oppdaget av CETSA. (B) Den optiske tettheten av Keap1 ble normalisert til de som oppnås ved 45 °C. Data er representert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført ved enveis variansanalyse (enveis ANOVA). n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifisering av sykdomsmål og oppdagelse og utvikling av legemidler henger tett sammen27. Ved å målrette nøyaktig mot spesifikke mål, kan legemiddelkandidater utvikles for å behandle bestemte sykdommer mer effektivt samtidig som bivirkningene forbundet med stoffene28,29 minimeres. De mest brukte målene er proteinmål30. Imidlertid utgjør identifiseringen av spesielle proteinmål en enorm utfordring på grunn av det omfattende mangfoldet av proteiner i celler30,31. I dette papiret vedtok vi en tilnærming som kombinerer molekylær dokking med CETSA for å identifisere og validere proteinmål. Resultatene viste en direkte interaksjon mellom xanthatin og Keap1-protein. Integrasjonen av datateknologi og biologiske eksperimenter kan også brukes i undersøkelsen av andre legemidler og proteinmål for å fastslå tilstedeværelsen av en direkte interaksjon mellom stoffet og målet. Denne tilnærmingen, som kombinerer prediksjon med verifisering, reduserer effektivt både tidsforbruk og økonomiske kostnader. Videre er de eksperimentelle instrumentene og materialene enkle å få tak i, og operasjonsprosessen er ikke komplisert. Til slutt, CETSA-prøvene er enkle å forberede og teste ved hjelp av western blot-metoden, som sikrer reproduserbarheten av prøvene.
Vår erfaring er at det er flere kritiske aspekter som krever spesiell oppmerksomhet under eksperimentelle prosedyrer. For det første er det viktig å velge krystallstrukturen til proteinet som er løst ved røntgenanalyse når du velger proteinstrukturen før molekylær dokking. For det andre er celletetthet og fryse-/tinetid avgjørende faktorer i CETSA-eksperimenter. Celler i den logaritmiske vekstfasen bør velges for CETSA-eksperimenter, da veksttilstanden er stabil og har minimal innvirkning på eksperimentelle resultater. Under gjentatt frysing og tining av celler, bør timingen være godt kontrollert med flytende nitrogen som brukes til frysing til en hvit fast form, etterfulgt av umiddelbar tining ved romtemperatur før påfølgende frysesykluser. Til slutt må western blot-eksperimenter fullføres umiddelbart etter å ha forberedt CETSA-prøver for å forhindre proteinnedbrytning.
Molekylær dokking og CETSA er begge veletablerte teknikker som spiller en avgjørende rolle innen stoffutvikling. Molekylær dokking er medvirkende til å forutsi molekylære nivåinteraksjoner mellom forbindelser og deres mål, og gir verdifull innsikt i potensielle bindingsmoduser10,11. CETSA, derimot, fokuserer på å vurdere virkningen av legemidler på proteintermisk stabilitet og fungerer som et verktøy for å validere legemiddel-proteininteraksjoner17. Mens CETSA er en relativt enkel metode for verifisering, er det også en lav gjennomstrømningsmåte ved å bruke western blot for studiet av termisk skift av legemiddelproteinkompleks, og det bør ikke være den eneste teknikken som stoles på. I tillegg er trinnene i CETSA kompliserte, og eventuelle trinnfeil under operasjonen kan ha stor innvirkning på resultatene. Videre kan CETSA-metoden ikke bestemme forbindelsens spesifikke bindingssted og bindingsmodus til proteinmålet og kan ikke indikere om bindingen er kovalent eller ikke-kovalent 17,18,23. Utover termisk skiftanalyse, kan andre typer energisk analyse, som pH-avhengig proteinutfelling (pHDPP), også brukes til studier av ligand-protein-interaksjoner32. Videre er termisk proteomprofilering en energibasert metode for å avsløre ligand-protein-interaksjoner, noe som muliggjør høy gjennomstrømning, storskala analyse av protein-legemiddelinteraksjoner ved å kombinere proteomikk med CETSA33.
I tillegg kan lokalisert overflateplasmonresonans (LSPR) gi ytterligere kvalitativ og kvantitativ analyse34,35. Det bestemmer ikke bare eksistensen av interaksjoner mellom et legemiddel og dets mål, men måler også affinitetsparametrene og kinetiske parametrene til disse intermolekylære interaksjonene, noe som gir en mer omfattende forståelse.
Utover termisk skiftanalyse kan pH-avhengig proteinutfelling (pHDPP) også brukes til studier av ligand-protein-interaksjoner32. Molekylær dokking er en fysisk-mekanikkbasert simuleringsmetode for å forutsi interaksjoner mellom små molekyler og biomolekyler. Denne metoden tar sikte på å oppnå binding ved å optimalisere konformasjonen og orienteringen til små molekyler for å produsere den beste komplementariteten mellom dem og biomolekyler. Målprediksjon bruker kunstig intelligensteknikker for å forutsi bindingsstedene mellom små molekyler og biomolekyler. De to tilnærmingene har viktige forskjeller i metodeanvendelse og prediksjonsnøyaktighet. Metodeapplikasjon: molekylær docking brukes hovedsakelig til stoffdesign og optimalisering, og gir et teoretisk grunnlag for ny legemiddeloppdagelse. Målprediksjon, ved hjelp av mer avansert kunstig intelligens, brukes oftere på screening med høy gjennomstrømning og rask oppdagelse av blyforbindelser for å forbedre effektiviteten av narkotikaoppdagelse. Prediksjonsnøyaktighet: Siden molekylær dokking er basert på fysiske simuleringer, er prediksjonsnøyaktigheten høyere, men beregningskostnaden er også relativt høy. Mens målprediksjon har lavere beregningskostnader, avhenger prediksjonsnøyaktigheten av overflod av treningsdata og modellvalg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82004031) og Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Vi uttrykker vår store takknemlighet til Jiayi Sun ved Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, for hjelpen med western blot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A.
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
