Summary
Experimentet som används här visar en metod för molekylär dockning i kombination med cellulär termisk skiftanalys för att förutsäga och validera interaktionen mellan små molekyler och proteinmål.
Abstract
Proteiner är grundläggande för människans fysiologi, och deras måltavlor är avgörande inom forskning och läkemedelsutveckling. Identifiering och validering av viktiga proteinmål har blivit en integrerad del av läkemedelsutvecklingen. Molekylär dockning är ett beräkningsverktyg som används i stor utsträckning för att undersöka bindning av proteiner, särskilt i samband med interaktioner mellan läkemedel och proteinmål. För den experimentella verifieringen av bindningen och för att få direkt tillgång till bindningen av läkemedlet och dess mål, används metoden cellulär termisk skiftanalys (CETSA). Denna studie syftade till att integrera molekylär dockning med CETSA för att förutsäga och validera interaktioner mellan läkemedel och vitala proteinmål. Specifikt förutspådde vi interaktionen mellan xanthatin och Keap1-protein samt dess bindningssätt genom molekylär dockningsanalys, följt av verifiering av interaktionen med hjälp av CETSA-analysen. Våra resultat visade att xanthatin kunde etablera vätebindningar med specifika aminosyrarester av Keap1-protein och minska termostabiliteten hos Keap1-proteinet, vilket indikerar att xanthatin direkt kan interagera med Keap1-proteinet.
Introduction
Proteiner är mycket viktiga makromolekyler i levande organismer och har en mängd unika funktioner i celler, såsom membransammansättning, cytoskelettbildning, enzymaktivitet, transport, cellsignalering och engagemang i både intracellulära och extracellulära mekanismer 1,2,3. Proteiner manifesterar sina biologiska funktioner främst genom specifika interaktioner med en mängd olika molekyler, inklusive andra proteiner, nukleinsyror, småmolekylära ligander och metalljoner 1,4. Ligander är små molekylära föreningar som specifikt binder till proteiner i en organism. Interaktionen mellan proteiner och ligander sker på specifika platser på proteinet, så kallade bindningsställen, även kända som bindningsfickorna5. Inom läkemedelskemisk forskning ligger fokus på att identifiera nyckelproteiner som är tydligt associerade med sjukdomar, som fungerar som måltavlor för läkemedel6. Därför är det av yttersta vikt att få en djup förståelse för bindningsställena mellan proteiner och ligander för att främja läkemedelsupptäckt, design och forskning 7,8.
Molekylär dockning är ett allmänt använt beräkningsverktyg för att studera protein-ligandbindning, som använder de tredimensionella strukturerna av proteiner och ligander för att utforska deras primära bindningssätt och affiniteter när de bildar stabila komplex 9,10,11. Tillämpningen av molekylär dockningsteknik har sitt ursprung på 1970-talet. Baserat på principen om lås och nyckel-parning och med hjälp av algoritmerna för molekylär dockningsprogramvara kan man bestämma interaktionen mellan föreningar och molekylära mål genom att analysera dockningsresultat. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att förutsäga aktiva bindningsställen för både föreningen och målmolekylen. Följaktligen underlättar det identifieringen av en optimal bindningskonformation (här kallad bindningsmodellen) för ligand-receptorinteraktioner, vilket är avgörande för att förstå mekaniken bakom dessa molekylära engagemang 12,13,14,15. Även om molekylär dockning ger värdefulla datorbaserade förutsägelser av ligand-receptorinteraktioner, är det viktigt att notera att detta är preliminära resultat. Följaktligen är ytterligare experimentell verifiering nödvändig för att bekräfta dessa interaktioner.
Cellular thermal shift assay (CETSA), som ursprungligen föreslogs av Pär Nordlunds forskargrupp 2013, fungerar som en metod för att validera interaktioner mellan läkemedel och målproteiner. Denna teknik testar specifikt den termiska stabiliteten hos målproteiner inducerade av läkemedelsbindning, vilket ger ett praktiskt tillvägagångssätt för att bekräfta molekylära interaktioner 16,17,18. Detta tillvägagångssätt är baserat på den grundläggande principen att ligandbindning initierar en termisk förändring inom målproteiner och är tillämpbar på ett brett spektrum av biologiska prover, inklusive celllysat, intakta levande celler och vävnader19,20. CETSA stöder direkt målengagemang av små molekyler i intakta celler genom att detektera termodynamisk stabilisering av proteiner på grund av ligandbindning och koppla det observerade fenotypiska svaret till målföreningen21,22. Bland de olika metoder som härrör från CETSA anses Western Blot-CETSA (WB-CETSA) vara en klassisk metod. Efter provberedning med hjälp av CETSA-metoden används western blot-analys för att detektera förändringar i den termiska stabiliteten hos målproteinet. Detta möjliggör en exakt bestämning av läkemedels-proteininteraktioner inom cellulära system17,23.
Xanthatin är en bioaktiv förening isolerad från växten Xanthium L. med egenskaper som antiinflammatorisk, som har använts i traditionell kinesisk medicin för att behandla sjukdomar som näsbihåleinflammation och artrit24,25. Det kelch-liknande ECH-associerade proteinet 1 (Keap1) är en komponent i det Cullin3-baserade Cullin-RING E3 ubiquitin-ligaset multi-subunit proteinkomplexet och en viktig regulator av intracellulär redoxhomeostas, som påverkar intensiteten och varaktigheten av det inflammatoriska svaret genom att modulera det intracellulära redoxtillståndet26. I den här studien använde vi först molekylär dockning för att undersöka interaktionen mellan xanthatin (liten molekyl) och Keap1-proteinet, i syfte att förutsäga deras bindningssätt. Därefter använde vi CETSA-metoden för att validera denna interaktion genom att bedöma effekten av xanthatin på den termiska stabiliteten hos Keap1-proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ladda ner strukturerna för xanthatin och Keap1
- Öppna PubChem-databasen (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), mata in xanthatin (liten molekyl), tryck sedan på Sök och klicka på Det första resultatet. Klicka på Ladda ner och klicka på Spara under 2D-struktur för att spara sammansättningen i .sdf-format.
- Ladda ner proteinets kristallstruktur.
- Öppna UniProt-databasen (https://www.uniprot.org/), mata in Keap1 och klicka på Sök. Klicka på Människa under populära organismer i den vänstra kolumnen och klicka sedan på Den första posten med namnet Q14145 i den högra kolumnen.
- Klicka på Struktur under funktionen i den vänstra kolumnen, hitta strukturen med PDB ID: 2FLU, och klicka på RCSB-PDB. Klicka på Ladda ner filer och välj PDB-format för att ladda ner kristallstrukturen för Keap1-proteinet.
2. Molekylär dockning
- Skapa en ny mapp med namnet molekylär dockning på skrivbordet och spara de nedladdade strukturerna xanthatin (liten molekyl) och Keap1 (protein) i den här mappen.
OBS: Mappnamn och sökväg måste vara på engelska. - Öppna Maestro-programvaran, klicka på Arkiv, välj Ändra arbetskatalog, klicka på Skrivbord, dubbelklicka för att välja den nyskapade molekylära dockningsmappen och klicka på Välj alternativ.
- Bearbetning av små molekyler
- Klicka på Arkiv och importera strukturalternativ, klicka på Skrivbord, dubbelklicka på molekylär dockningsmapp, klicka på xanthatin Structure File och klicka sedan på Öppna för att importera liten molekylfil.
- Klicka på Uppgifter i det övre högra hörnet av programvaran och välj alternativet LigPrep . Använd strukturer från arbetsytan; resten av parametrarna är standardparametrarna och klicka på Kör för att utföra bearbetning av små molekyler.
- Bearbetning av proteinstruktur
- Klicka på alternativen Arkiv och Importera strukturer , klicka på Skrivbord och dubbelklicka på mappen Molecular Docking . Klicka på filen Keap1 Protein Structure och klicka sedan på Öppna för att importera proteinstrukturfilen.
- Klicka på Uppgifter i det övre högra hörnet av programmet och välj alternativet Protein Preparation Wizard . Markera rutan Innan du tar bort vatten bortom 5 Å från hetgrupper och ange ett pH på 7,4+/-0,0. Klicka på Förbearbeta, klicka på Förfina och klicka sedan på Optimera > Ta bort vatten > minimera.
- Klicka på nästa uppgift när den föregående uppgiften är klar. Klicka på Uppgifter och välj alternativet Webbplatskarta , använd standardinställningarna för alla parametrar och klicka på Kör.
- Klicka på alternativen Arkiv och Importera strukturer , klicka på Skrivbord, dubbelklicka på den molekylära dockningsmappen och öppna mappen med namnet sitemap_1. Klicka på den första filen med namnet Sitemap_1_out.maegz och klicka sedan på Öppna.
- Dubbelklicka på punkten för att välja sitemap_1_protein i arbetsytan och klicka sedan på Sitemap_1_site_1 för att välja den . Klicka på Uppgifter och välj alternativet Receptor Grid Generation .
OBS: De proteinplatser som förutspås av webbplatskartan rankas enligt poängsättningen, med den webbplats som får högst poäng i första hand. - Välj alternativet Entry under receptor, med de återstående parametrarna oförändrade. Klicka på den lilla vita bollen i proteinstrukturen för att generera en dockningsruta med standardstorlek och ändra jobbnamnet till glide-grid_2FLU. Klicka på Kör.
- Molekylär dockning
- Klicka på Uppgifter och välj alternativet Ligand Docking . Välj Receptor Grid As från filen och klicka på Bläddra. Klicka på Skrivbord, dubbelklicka på molekylär dockningsmapp, dubbelklicka på glide-grid_2FLU file, klicka på Glide-grid_2FLU.zip file och klicka sedan på Öppna.
- Klicka på Använd ligander från filer > bläddra > skrivbordet. Dubbelklicka på den molekylära dockningsmappen, dubbelklicka på den ligprep_1 filen, klicka på filen Ligprep_1-out.maegz och klicka sedan på Öppna.
- Klicka på Inställningar och välj alternativet Precision som XP (extra precision), ändra jobbnamnet till glide-dock_XP_2FLU och klicka på Kör.
- Visa dockningsresultat
- Klicka på alternativen Arkiv och Importera strukturer , klicka på Skrivbord och dubbelklicka på mappen Molecular Docking . Dubbelklicka på filen glide-dock_XP_2FLU , klicka på filen glide-dock_XP_1_pv.maegz och klicka sedan på Öppna.
- Dubbelklicka på punkten för att välja ligand på arbetsytan och klicka sedan för att välja sitemap_1_protein. Klicka på Tabell, skjut längst till höger och visa poängen under dockningspoäng.
- Visualisering av 2D-resultat
- Dubbelklicka på punkten för att välja ligand i arbetsytan och klicka sedan för att även välja sitemap_1_protein. Klicka på Ligand Interaction > View och markera rutan LID-förklaring .
- Klicka på Arkiv, välj Spara skärmdump, mata in 6000 på bredden, avmarkera rutan för Transparent bakgrund och klicka på OK. Klicka på Skrivbord, namnge filen som 2D-xanthatin-2FLU och spara bilden.
- Visualisering av 3D-resultat
- Dubbelklicka på punkten för att välja ligand i arbetsytan och klicka sedan för att även välja sitemap_1_protein.
- Klicka på L i Snabbval för att välja små molekyler och klicka sedan på Stil. Klicka på den andra raden i stilen för att ändra storleken på den lilla molekylbindningen och klicka på färgatomerna för att ändra den lilla molekylens färg.
- Markera den lilla molekylen i figuren, klicka med höger musknapp, välj Expandera markering och välj 4 Å. Klicka på Använd etiketter i format för att visa etiketterna.
- Klicka på den andra raden i stilen för att ändra storleken på aminosyrabindningar och klicka på Färgatomer för att ändra aminosyrafärg.
- Klicka på Nästa > Invertera, håll ner kontrolltangenten och klicka på den första ögonpositionen under stil för att endast visa aminosyrorna med etiketter.
- Klicka på Stil > Menyfliksområden för att visa proteinet som en menyfliksstil och klicka på Redigera menyfliksområde under menyflikar för att ändra färgbandsfärgen.
- Klicka på Interaktioner Växla i det nedre högra hörnet av skärmen, klicka med höger musknapp och avmarkera kontakter/sammandrabbningar.
- Sök efter mått i uppgifter, välj Avstånd och klicka på de två atomerna som är förbundna med den gula prickade linjen (vätebindning) på skärmen för att mäta vätebindningslängder.
- Tryck och håll ned mushjulet för att rotera proteinet, justera proteinet till mitten av skärmen och se till att varje aminosyraetikett är synlig.
- Klicka på Arbetsyta > Spara bild som och klicka på skrivbordet. Spara bilden som 600dpi som standard, namnge filen som 3D-xanthatin-2FLU, välj filtyp som tiff-format och spara bilden.
3. Cellodling och beredning av CETSA-prover
- Cellodling
- Tillsätt 5 x 106 RAW264.7 celler/ml i en 100 mm odlingsform och inkubera med 6 ml DMEM-medium med 10 % FBS och 1 % antibiotika-antimykotisk lösning vid 37 °C, 95 % luftfuktighet och 5 % CO2. Förbered tre rätter och utför experimentet när cellerna når 80% sammanflöde.
- Beredning av CETSA-prov
- Aspirera det gamla mediet, tillsätt 2 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS) uppvärmd till rumstemperatur till varje maträtt och tvätta 2x.
- Tillsätt 2 ml PBS till varje skål med celler, blanda cellerna och samla cellerna i två 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 377 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och åter blanda cellerna med 2 ml PBS som innehåller 1 % bredspektrumproteashämmare. Dela upp i enskilda mikrocentrifugrör med 1 ml cellsuspension i varje.
- Frys mikrocentrifugrören i flytande kväve tills de är vita, tina sedan omedelbart i ett 37 °C vattenbad och upprepa 3 gånger. Centrifugera vid 12 000 x g vid 4 °C i 10 minuter.
- Ta två mikrocentrifugrör, ett med 100 μM xanthatin och ett med lika stor volym DMSO, och tillsätt 450 μl centrifugerad supernatant till varje rör, inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
- Tillsätt supernatanten från de två mikrocentrifugrören till 14 PCR-rör med en volym på 60 μL/rör och värm rören samtidigt vid olika temperaturer (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C och 63 °C) i 3 minuter, med två PCR-rör vid varje temperatur, för DMSO- och xanthatingrupperna. respektive.
- För den ouppvärmda gruppen tas supernatanten från vart och ett av de två mikrocentrifugrören och tillsätts till 14 PCR-rör, 7 för DMSO-gruppen och 7 för xanthatingruppen, i en volym av 60 μl vardera. Värm inte proverna här.
- Kyl rören i rumstemperatur för den uppvärmda gruppen. Centrifugera alla rör (uppvärmda och ouppvärmda) vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 °C och ta 48 μL supernatant från varje rör till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 12 μL SDS-PAGE proteinladdningsbuffert till varje rör, virvla för att blanda väl och värm i ett vattenbad vid 100 °C i 5 minuter.
OBS: Förberedda CETSA-prover måste förvaras vid -80 °C och testas med western blot inom 1 vecka.
4. Västra blotet
- Beredning av SDS-PAGE gel
- Skölj en lång och en kort glasplatta med ultrarent vatten. Placera plattorna i clamping spår och sedan på en genomskinlig bräda. Tillsätt ultrarent vatten och kontrollera läckaget i 10 minuter.
- Tillsätt 8 ml lägre gellösning och 8 ml nedre gelbuffert i en E-kolv och blanda genom att skaka försiktigt. Tillsätt 160 μl koaguleringspromotor till gellösningen och blanda väl.
OBS: Volymen på det nedre lagret av lim bör inte överstiga den gröna linjen på clamping spår. - Töm det ultrarena vattnet från plattorna och torka dem med filterpapper. Tillsätt den förberedda nedre gellösningen. Tillsätt 2 ml isopropylalkohol och vänta i 20 minuter för stelning.
- Ta 2 ml övre gellösning och 2 ml övre gelbuffert i en E-kolv och blanda genom att skaka kolven försiktigt.
- Ta bort isopropylalkoholen från gelskiktet och torka av överflödig isopropylalkohol med filterpapper.
- Tillsätt 40 μL koaguleringspromotor till den blandade övre gellösningen, blanda väl, tillsätt sedan mellan de långa och korta glasplattorna och sätt in en 1,5 mm 15-hålskam, vänta i 20 minuter.
OBS: Kammen ska sättas in vinkelrätt mot det övre lagret, utan luftbubblor mellan kammen och lösningen.
- Elektrofores
- Tillsätt 1 L ultrarent vatten i en bägare, tillsätt en påse SDS-PAGE löpande buffertpulver, rör om väl med en glasstav och tillsätt den förberedda gelen till elektroforesenheten. Placera enheten i lådan och dra ut kammen.
- Tina markör och CETSA prover vid rumstemperatur, virvel och spin down. Tillsätt 2,5 μl markör till den första brunnen och 20 μL CETSA-prover till var och en av de återstående brunnarna enligt den förutbestämda sekvensen.
OBS: CETSA-proverna tillsattes successivt enligt den temperaturbehandling som beskrivs i steg 3.2.6 från 45 °C till 63 °C. DMSO-gruppen lades först till och sedan xanthatin-gruppen (figur 1). - Tillsätt den återstående elektroforeslösningen till elektroforesenheten, stäng locket och sätt in elektroden, positiv pol till positiv pol, negativ pol till negativ pol.
- Slå PÅ strömbrytaren och justera volymentage omkopplare till 80 V för att starta elektrofores.
- Överför till membran
- Tillsätt 850 ml ultrarent vatten, 100 ml vattenfri etanol och 50 ml snabböverföringsbuffert i en bägare och rör om väl. Förbered skumbräda, plastknivar, pincett, brickor och membranöverföringsanordningar.
- Klipp PVDF-membranet efter storleken på gelen, markera det och blötlägg det i metanol i 30 s för att aktivera det.
- Häll överföringslösningen i brickan, placera och öppna överföringsklämmorna och placera en svampdyna och tre lager överföringsfilterpapper.
- Avbryt elektroforesen och öppna sedan locket till elektroforesboxen. Ta elektroforesanordningen, häll ut elektroforeslösningen och ta bort plattan. Placera plattan på skumbrädan, bänd försiktigt bort den med en plastkniv och skär gelen för att tydligt visualisera proteinmarkören och målproteinerna.
- Håll ena sidan av markören med en pincett, tvätta den i en bricka som innehåller transmembranlösningen och lägg den platt på filterpapper. Doppa det aktiverade PVDF-membranet i överföringslösningen, håll den märkta sidan med en pincett och täck gelen med framsidan nedåt.
OBS: PVDF-membranet märkt sida är framsidan och var uppmärksam på att inga bubblor genereras under placeringsprocessen. - Placera två lager överföringsfilterpapper och ett lager svampdyna på PVDF-membranet, täck och kläm fast överföringsklämmorna och lägg dem i överföringstanken.
OBS: Svart färg på överföringsklämman till svart färg på överföringsfacket. - Tillsätt den återstående transmembranlösningen till transmembrankassetten, täck med locket, positivt till positivt, negativt till negativt.
- Justera strömmen till 400 mA, tiden till 30 minuter och tryck sedan på Kör för att börja överföra membranet vid rumstemperatur.
- Blockering
- Tillsätt 2 l ultrarent vatten till en injektionsflaska av glas, tillsätt en påse TBS-pulver och tillsätt sedan 2 ml Tween för att göra TBST-lösning. Väg BSA-pulvret för att bereda en 5% BSA-lösning med TBST och tillsätt 6 ml BSA-lösning till inkubationslådan.
- Stoppa membranöverföringen och öppna sedan överföringsklämman. Kläm fast markörsidan av PVDF-membranet och placera det i inkubationslådan. Placera inkubationslådan på en shaker och blockera i 1.5 timme i rumstemperatur.
- Inkubation av primära antikroppar
- Förbered den primära antikroppen (se materialtabellen för detaljer) med 5 % BSA-lösning vid 1:1000, återvinn BSA-lösningen i inkubatorlådan och tillsätt 6 ml primär antikropp till inkubationslådan. Placera inkubationslådan i en skumlåda med kylklampar och förvara den på en shaker över natten.
- Inkubation av sekundära antikroppar
- Samla den primära antikroppen i inkubationslådan nästa dag, tillsätt sedan 6 ml TBST-lösning och lägg den på en shaker för att tvätta i 5 minuter.
- Häll av den tvättade TBST-lösningen och tillsätt färsk för tvätt; Upprepa 5 gånger och förbered den sekundära antikroppen med 5 % BSA-lösning vid 1:5000.
- Häll av TBST-lösningen och tillsätt 6 ml sekundär antikropp i inkubationslådan. Placera inkubationslådan på en shaker och inkubera i 1.5 timme i rumstemperatur.
- Samla upp den sekundära antikroppen (se materialtabellen för detaljer), tillsätt sedan 6 ml TBST-lösning och placera den på en shaker för att tvätta i 5 minuter. Häll av den tvättade TBST-lösningen och tillsätt färsk för tvätt; Upprepa 5 gånger.
- Exponera remsorna
- Behåll TBST-lösningen i slutet av den sista tvätten. Ta lika stora volymer kemiluminiscerande reagens A och B, skaka och blanda väl. Skydda lösningen från ljus.
- Öppna gelavbildningssystemet, klicka på Prover, kontrollera kalibreringen, vänta på att kalibreringen ska slutföras och klicka sedan på Markör, kontrollera kalibreringen.
- Plocka upp markörsidan av remsan med en pincett och sänk ner den kemiluminescerande reagenslösningen. Clamp ena sidan av markören för att placera remsan med framsidan nedåt i kameran, stäng locket på kameran, klicka på Exponering och ställ in exponeringstiden till 1 s.
OBS: Utvecklaren måste täcka remsan helt och hållet och utvecklingen bör vara i en mörk miljö. - Klicka på Spara, namnge bilden och spara den som en .tif fil. Analysera den optiska densiteten hos den västra fläcken. Gråvärdena för varje temperatur i DMSO-gruppen jämfördes med gråvärdena för 45 °C, och gråvärdena för varje temperatur i xanthatingruppen jämfördes med gråvärdena för xanthatin vid 45 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Molekylär dockningsanalys förutspådde interaktionen mellan xanthatin och Keap1-proteinet. Figur 2 visar bildandet av vätebindningar mellan xanthatin och aminosyraresterna Gly-367 och Val-606 av Keap1-protein, med en vätebindningslängd på 2,17 Å för Gly-367 och 2,13 Å för Val-606. Dessutom innebär den beräknade dockningspoängen på -5,69 kcal/mol en god bindningsaffinitet mellan xanthatin och Keap1-protein.
CETSA-metoden visade att xanthatinbindning förändrade den termiska stabiliteten hos Keap1-proteinet, vilket bekräftade interaktionen mellan xanthatin och Keap1-protein21. Figur 3 visar att xanthatin på ett anmärkningsvärt sätt förskjuter den termiska stabiliteten hos Keap1-proteinet inom temperaturintervallet 48 °C till 57 °C, jämfört med DMSO-gruppen. För att säkerställa en jämn provbelastning var för det första densiteten av cellinokulering där vi utförde experimenten konsekvent; för det andra blandades cellproverna från DMSO-gruppen och xanthatingruppen väl i cellodlingsskålarna och fördelades sedan jämnt i två mikrocentrifugrör, vilket säkerställde en konsekvent mängd cellprover, och volymen av supernatant som tillsattes till varje PCR-rör var 60 μL, och slutligen var volymen av varje prov som laddats upp i Western blot 20 μL, vilket säkerställde lika belastning för uppvärmda prover. Proteinnedbrytning i prover från cirka 51 °C beror främst på förändringar i proteinstruktur och accelererade kemiska reaktioner orsakade av höga temperaturer. Ovanstående resultat visar att xanthatin kan binda direkt till Keap1-proteinet.
Figur 1: Inläsningsordning för västra blot. Temperaturen i ordning från vänster till höger var 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C och 63 °C. Det första körfältet lades till med en markering; Två körfält användes för varje temperatur; den första körfältet var DMSO-gruppen och det andra körfältet var xanthatin-gruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Interaktion mellan xanthatin och Keap1 (PDB: 2FLU) protein. (A) 2D-representationen av xanthatin som binder till Keap1. (B) 3D-visualisering av xanthatin och Keap1-protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekt av xanthatin på den termiska stabiliteten hos Keap1-proteinet. (A) Effekterna av xanthatin på den termiska stabiliteten hos Keap1 detekterades av CETSA. (B) Den optiska densiteten hos Keap1 normaliserades till de som erhölls vid 45 °C. Data representeras som medelvärde ± SD. Statistisk analys utfördes genom envägsanalys av varians (envägs ANOVA). n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifieringen av sjukdomsmål och upptäckten och utvecklingen av läkemedel är nära förbundna med varandra27. Genom att rikta in sig på specifika måltavlor kan läkemedelskandidater utvecklas för att behandla vissa sjukdomar mer effektivt samtidigt som de biverkningar som är förknippade med läkemedlenminimeras 28,29. De vanligaste målen är protein targets30. Identifieringen av speciella proteinmål utgör dock en enorm utmaning på grund av den stora mångfalden av proteiner i celler30,31. I den här artikeln antog vi ett tillvägagångssätt som kombinerar molekylär dockning med CETSA för att identifiera och validera proteinmål. Resultaten avslöjade en direkt interaktion mellan xanthatin och Keap1-proteinet. Integrationen av datorteknik och biologiska experiment kan också användas vid undersökning av andra läkemedel och proteinmål för att fastställa förekomsten av en direkt interaktion mellan läkemedlet och målet. Den här metoden, som kombinerar förutsägelse med verifiering, minskar effektivt både tidsåtgång och ekonomiska kostnader. Dessutom är de experimentella instrumenten och materialen lätta att få tag på, och driftprocessen är inte komplicerad. Slutligen är CETSA-proverna lätta att förbereda och testa med western blot-metoden, vilket säkerställer provernas reproducerbarhet.
Enligt vår erfarenhet finns det flera kritiska aspekter som kräver särskild uppmärksamhet under experimentella procedurer. För det första är det viktigt att välja proteinets kristallstruktur som upplösts genom röntgenanalys när man väljer proteinstruktur före molekylär dockning. För det andra är celldensitet och frys-/upptiningstid avgörande faktorer i CETSA-experiment. Celler i den logaritmiska tillväxtfasen bör väljas ut för CETSA-experiment eftersom deras tillväxtstadium är stabilt och har minimal inverkan på försöksresultaten. Vid upprepad frysning och upptining av celler bör tidpunkten kontrolleras väl med flytande kväve som används för frysning tills det bildas ett vitt fast ämne, följt av omedelbar upptining vid rumstemperatur före efterföljande frysningscykler. Slutligen måste western blot-experiment slutföras omedelbart efter att CETSA-prover har förberetts för att förhindra proteinnedbrytning.
Molecular docking och CETSA är båda väletablerade tekniker som spelar en avgörande roll inom läkemedelsutveckling. Molekylär dockning är avgörande för att förutsäga interaktioner på molekylär nivå mellan föreningar och deras mål, vilket ger värdefulla insikter om potentiella bindningssätt10,11. CETSA, däremot, fokuserar på att bedöma effekten av läkemedel på proteiners termiska stabilitet och fungerar som ett verktyg för att validera läkemedels-proteininteraktioner17. Även om CETSA är en relativt okomplicerad metod för verifiering, är det också en metod med låg genomströmning genom att använda western blot för studier av termisk förändring av läkemedels-proteinkomplex, och det bör inte vara den enda tekniken som man förlitar sig på. Dessutom är stegen i CETSA komplicerade, och eventuella stegfel under operationen kan ha stor inverkan på resultaten. CETSA-metoden kan inte heller bestämma det specifika bindningsstället och bindningssättet för föreningen till proteinmålet och kan inte ange om bindningen är kovalent eller icke-kovalent 17,18,23. Utöver termisk skiftanalys kan andra typer av energetiska analyser, såsom pH-beroende proteinutfällning (pHDPP), också användas för studier av ligand-proteininteraktioner32. Dessutom är termisk proteomprofilering en energibaserad metod för att avslöja ligand-proteininteraktioner, vilket möjliggör storskalig analys av protein-läkemedelsinteraktioner med hög kapacitet genom att kombinera proteomik med CETSA33.
Dessutom kan lokaliserad ytplasmonresonans (LSPR) ge ytterligare kvalitativ och kvantitativ analys 34,35. Den bestämmer inte bara förekomsten av interaktioner mellan ett läkemedel och dess mål, utan mäter också affinitetsparametrarna och kinetiska parametrarna för dessa intermolekylära interaktioner, vilket ger en mer omfattande förståelse.
Utöver termisk skiftanalys kan pH-beroende proteinutfällning (pHDPP) också användas för studier av ligand-proteininteraktioner32. Molecular docking är en fysikalisk-mekanik-baserad simuleringsmetod för att förutsäga interaktioner mellan små molekyler och biomolekyler. Denna metod syftar till att uppnå bindning genom att optimera konformationen och orienteringen av små molekyler för att producera bästa komplementaritet mellan dem och biomolekyler. Målförutsägelse använder artificiell intelligens-tekniker för att förutsäga bindningsställena mellan små molekyler och biomolekyler. De två metoderna har viktiga skillnader i metodtillämpning och förutsägelsenoggrannhet. Metodtillämpning: Molekylär dockning används främst för läkemedelsdesign och optimering, vilket ger en teoretisk grund för ny läkemedelsutveckling. Målprediktion, med hjälp av mer avancerad artificiell intelligens, tillämpas oftare på screening med hög genomströmning och snabb upptäckt av ledande föreningar för att förbättra effektiviteten vid läkemedelsupptäckt. Prediktionsnoggrannhet: Eftersom molekylär dockning är baserad på fysiska simuleringar är dess förutsägelsenoggrannhet högre, men beräkningskostnaden är också relativt hög. Målförutsägelse har en lägre beräkningskostnad, men förutsägelsens noggrannhet beror på mängden träningsdata och modellval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82004031) och Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Vi uttrycker vår stora uppskattning till Jiayi Sun vid Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, för hjälpen med western blot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
- Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review. Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).
- Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking. Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).
- Zhang, F., et al. PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection. Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).
- Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network. J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).
- Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions. Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).
- Hatty, C. R., Banati, R. B. Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO). Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).
- Chaires, J. B. Calorimetry and thermodynamics in drug design. Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).
- Huang, S. Y., Zou, X. Advances and challenges in protein-ligand docking. Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).
- Li, J., Fu, A., Zhang, L. An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking. Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).
- Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking. Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).
- Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
- Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications. Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).
- Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs. Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).
- Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin. Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 116, 154862 (2023).
- Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
- Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects. Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).
- Jiang, X., et al. Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings. Phytomedicine. 110, 154637 (2023).
- Mateus, A., et al. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).
- Sanchez, T. W., et al. Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement. ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).
- Tolvanen, T. A.
- Liu, M., et al. Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases. J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).
- Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation. Molecules. 27 (14), 4603 (2022).
- Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants. Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).
- Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery. BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).
- Schenone, M., Dančík, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Chakraborty, C., et al. SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development. Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Zhang, X., et al. Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation. Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).
- Zhang, X., et al. A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand. Proteomics. 20, 1900372 (2020).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2022).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
