Summary
Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit einem zellulären thermischen Shift-Assay, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.
Abstract
Proteine sind für die menschliche Physiologie von grundlegender Bedeutung, wobei ihre Ziele für die Forschung und Arzneimittelentwicklung von entscheidender Bedeutung sind. Die Identifizierung und Validierung wichtiger Proteinziele ist zu einem integralen Bestandteil der Arzneimittelentwicklung geworden. Molekulares Docking ist ein computergestütztes Werkzeug, das häufig zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung eingesetzt wird, insbesondere im Zusammenhang mit Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Proteinzielen. Für die experimentelle Verifizierung der Bindung und um direkt auf die Bindung des Wirkstoffs und seines Ziels zuzugreifen, wird die Methode des Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) verwendet. Diese Studie zielte darauf ab, molekulares Docking mit CETSA zu integrieren, um Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und lebenswichtigen Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren. Konkret haben wir die Interaktion zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein sowie dessen Bindungsmodus durch molekulare Docking-Analyse vorhergesagt, gefolgt von der Verifizierung der Interaktion mit dem CETSA-Assay. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Xanthatin Wasserstoffbrückenbindungen mit spezifischen Aminosäureresten des Keap1-Proteins aufbauen und die Thermostabilität des Keap1-Proteins verringern kann, was darauf hindeutet, dass Xanthatin direkt mit dem Keap1-Protein interagieren kann.
Introduction
Proteine sind äußerst wichtige Makromoleküle in lebenden Organismen und besitzen eine Vielzahl einzigartiger Funktionen innerhalb von Zellen, wie z. B. die Membranzusammensetzung, die Bildung des Zytoskeletts, die Enzymaktivität, den Transport, die Zellsignalisierung und die Beteiligung an intrazellulären und extrazellulären Mechanismen 1,2,3. Proteine manifestieren ihre biologischen Funktionen in erster Linie durch spezifische Wechselwirkungen mit einer Vielzahl von Molekülen, einschließlich anderer Proteine, Nukleinsäuren, niedermolekularer Liganden und Metallionen 1,4. Liganden sind kleine molekulare Verbindungen, die spezifisch an Proteine in einem Organismus binden. Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Liganden findet an bestimmten Stellen des Proteins statt, den sogenannten Bindungsstellen, die auch als Bindungstaschen bekannt sind5. In der medizinisch-chemischen Forschung liegt der Fokus auf der Identifizierung von Schlüsselproteinen, die eindeutig mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden und als Angriffspunkte für Medikamente dienen6. Daher ist ein tiefes Verständnis der Bindungsstellen zwischen Proteinen und Liganden von größter Bedeutung, um die Entdeckung, das Design und die Forschung von Arzneimitteln zu fördern 7,8.
Molekulares Docking ist ein weit verbreitetes Computerwerkzeug zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung, das die dreidimensionalen Strukturen von Proteinen und Liganden nutzt, um ihre primären Bindungsmodi und Affinitäten bei der Bildung stabiler Komplexe zu untersuchen 9,10,11. Die Anwendung der molekularen Docking-Technologie hat ihren Ursprung in den 1970er Jahren. Basierend auf dem Prinzip der Schloss-Schlüssel-Paarung und unter Verwendung der Algorithmen der molekularen Docking-Software kann die Wechselwirkung zwischen Verbindungen und molekularen Zielen durch die Analyse der Docking-Ergebnisse bestimmt werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Vorhersage aktiver Bindungsstellen sowohl für die Verbindung als auch für das Zielmolekül. Folglich erleichtert es die Identifizierung einer optimalen Bindungskonformation (hier als Bindungsmodell bezeichnet) für Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen, was für das Verständnis der Mechanik dieser molekularen Bindungen entscheidend ist 12,13,14,15. Während das molekulare Docking wertvolle computergestützte Vorhersagen von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen liefert, ist es wichtig zu beachten, dass es sich hierbei um vorläufige Ergebnisse handelt. Daher ist eine weitere experimentelle Überprüfung unerlässlich, um diese Wechselwirkungen zu bestätigen.
Der Cellular Thermal Shift Assay (CETSA), der ursprünglich 2013 vom Forschungsteam um Pär Nordlund vorgeschlagen wurde, dient als Methode zur Validierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Zielproteinen. Diese Technik testet speziell die thermische Stabilität von Zielproteinen, die durch Wirkstoffbindung induziert werden, und bietet einen praktischen Ansatz zur Bestätigung molekularer Wechselwirkungen 16,17,18. Dieser Ansatz basiert auf dem Grundprinzip, dass die Ligandenbindung eine thermische Verschiebung innerhalb der Zielproteine auslöst, und ist auf ein breites Spektrum biologischer Proben anwendbar, einschließlich Zelllysaten, intakter lebender Zellen und Gewebe19,20. CETSA unterstützt die direkte Zielaktivierung kleiner Moleküle in intakten Zellen, indem es die thermodynamische Stabilisierung von Proteinen aufgrund der Ligandenbindung nachweist und die beobachtete phänotypische Reaktion mit der Zielsubstanz verknüpft21,22. Unter den verschiedenen Methoden, die sich aus CETSA ableiten, gilt Western Blot-CETSA (WB-CETSA) als klassischer Ansatz. Nach der Probenvorbereitung mit der CETSA-Methode wird die Western-Blot-Analyse eingesetzt, um Veränderungen in der thermischen Stabilität des Zielproteins nachzuweisen. Dies ermöglicht die präzise Bestimmung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen innerhalb zellulärer Systeme17,23.
Xanthatin ist eine bioaktive Verbindung, die aus der Pflanze Xanthium L. mit Eigenschaften wie entzündungshemmend isoliert wird und in der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Krankheiten wie Nasennebenhöhlenentzündung und Arthritis eingesetzt wird24,25. Das Kelch-like ECH-assoziierte Protein 1 (Keap1) ist Bestandteil des Cullin3-basierten Cullin-RING E3-Ubiquitin-Ligase-Multi-Subunit-Proteinkomplexes und ein wichtiger Regulator der intrazellulären Redox-Homöostase, der die Intensität und Dauer der Entzündungsreaktion beeinflusst, indem er den intrazellulären Redoxzustandmoduliert 26. In dieser Studie haben wir zunächst molekulares Docking verwendet, um die Interaktion zwischen Xanthatin (kleines Molekül) und dem Keap1-Protein zu untersuchen, um ihren Bindungsmodus vorherzusagen. Anschließend verwendeten wir die CETSA-Methode, um diese Interaktion zu validieren, indem wir den Einfluss von Xanthatin auf die thermische Stabilität des Keap1-Proteins untersuchten.
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Protocol
1. Herunterladen der Strukturen von Xanthatin und Keap1
- Öffnen Sie die PubChem-Datenbank (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), geben Sie Xanthatin (kleines Molekül) ein, drücken Sie dann auf Suchen und klicken Sie auf Das erste Ergebnis. Klicken Sie auf Herunterladen und klicken Sie auf Speichern unter 2D-Struktur, um die Verbindung im .sdf-Format zu speichern.
- Laden Sie die Kristallstruktur des Proteins herunter.
- Öffnen Sie die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org/), geben Sie Keap1 ein und klicken Sie auf Suchen. Klicken Sie in der linken Spalte unter "Beliebte Organismen" auf "Mensch " und dann in der rechten Spalte auf "Der erste Eintrag mit dem Namen Q14145 ".
- Klicken Sie unter der Funktion in der linken Spalte auf Struktur , suchen Sie die Struktur mit der PDB-ID: 2FLU und klicken Sie auf RCSB-PDB. Klicken Sie auf Dateien herunterladen und wählen Sie PDB-Format , um die Kristallstruktur des Keap1-Proteins herunterzuladen.
2. Molekulares Andocken
- Erstellen Sie auf dem Desktop einen neuen Ordner mit dem Namen molecular docking und speichern Sie die heruntergeladenen Strukturen Xanthatin (kleines Molekül) und Keap1 (Protein) in diesem Ordner.
HINWEIS: Der Name und der Pfad des Ordners müssen auf Englisch sein. - Öffnen Sie die Maestro-Software, klicken Sie auf Datei, wählen Sie Arbeitsverzeichnis ändern, klicken Sie auf Desktop, doppelklicken Sie, um den neu erstellten molekularen Docking-Ordner auszuwählen, und klicken Sie auf Optionen auswählen.
- Verarbeitung kleiner Moleküle
- Klicken Sie auf Optionen für Datei - und Importstrukturen, klicken Sie auf Desktop, doppelklicken Sie auf den Ordner Molecular Docking, klicken Sie auf xanthatin Structure File (Strukturdatei) und klicken Sie dann auf Öffnen , um die Datei für kleine Moleküle zu importieren.
- Klicken Sie in der oberen rechten Ecke der Software auf Aufgaben und wählen Sie die Option LigPrep . Verwenden von Strukturen aus dem Arbeitsbereich; Die restlichen Parameter sind die Standardparameter, und klicken Sie auf Ausführen , um die Verarbeitung kleiner Moleküle durchzuführen.
- Verarbeitung der Proteinstruktur
- Klicken Sie auf die Optionen Datei und Strukturen importieren , klicken Sie auf Desktop und doppelklicken Sie auf den Ordner Molecular Docking . Klicken Sie auf die Keap1-Proteinstrukturdatei , und klicken Sie dann auf Öffnen , um die Proteinstrukturdatei zu importieren.
- Klicken Sie in der oberen rechten Ecke der Software auf Aufgaben und wählen Sie die Option Proteinzubereitungs-Assistent . Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Vor dem Löschen von Wässern über 5 Å aus den Het-Gruppen und geben Sie einen pH-Wert von 7,4+/-0,0 ein. Klicken Sie auf Vorverarbeitung, klicken Sie auf Verfeinern und dann auf Optimieren > Wasser entfernen > minimieren.
- Klicken Sie auf die nächste Aufgabe, wenn die vorherige Aufgabe abgeschlossen ist. Klicken Sie auf Aufgaben , wählen Sie die Option Sitemap aus, verwenden Sie die Standardeinstellungen für alle Parameter und klicken Sie auf Ausführen.
- Klicken Sie auf die Optionen Datei und Strukturen importieren , klicken Sie auf Desktop, doppelklicken Sie auf den Ordner Molecular Docking und öffnen Sie den Ordner mit dem Namen sitemap_1. Klicken Sie auf die erste Datei mit dem Namen Sitemap_1_out.maegz, und klicken Sie dann auf Öffnen.
- Doppelklicken Sie auf den Punkt, um sitemap_1_protein im Arbeitsbereich auszuwählen, und klicken Sie dann auf Sitemap_1_site_1 , um ihn auszuwählen. Klicken Sie auf Aufgaben und wählen Sie die Option Rezeptorgittergenerierung aus.
HINWEIS: Die von der Sitemap vorhergesagten Proteinstandorte werden entsprechend der Bewertung eingestuft, wobei die Stelle mit der höchsten Punktzahl an erster Stelle steht. - Wählen Sie unter Rezeptor die Option Eintrag aus, wobei die restlichen Parameter unverändert bleiben. Klicken Sie auf die kleine weiße Kugel in der Proteinstruktur, um eine Docking-Box in Standardgröße zu generieren und den Jobnamen in glide-grid_2FLU zu ändern. Klicken Sie auf Ausführen.
- Molekulares Andocken
- Klicken Sie auf Aufgaben und wählen Sie die Option Liganden-Docking . Wählen Sie das Receptor Grid As aus der Datei aus und klicken Sie auf Durchsuchen. Klicken Sie auf Desktop, doppelklicken Sie auf den Ordner Molecular Docking, doppelklicken Sie auf Glide-grid_2FLU-Datei, klicken Sie auf Glide-grid_2FLU.zip Datei, und klicken Sie dann auf Öffnen.
- Klicken Sie auf Liganden aus Dateien verwenden > > Desktop zu durchsuchen. Doppelklicken Sie auf den Ordner molecular docking, doppelklicken Sie auf die Datei ligprep_1, klicken Sie auf die Datei Ligprep_1-out.maegz, und klicken Sie dann auf Öffnen.
- Klicken Sie auf Einstellungen und wählen Sie die Option Präzision als XP (zusätzliche Genauigkeit), ändern Sie den Auftragsnamen in Gleiter-dock_XP_2FLU und klicken Sie auf Ausführen.
- Anzeigen der Andockergebnisse
- Klicken Sie auf die Optionen Datei und Strukturen importieren , klicken Sie auf Desktop und doppelklicken Sie auf den Ordner Molecular Docking . Doppelklicken Sie auf die glide-dock_XP_2FLU-Datei , klicken Sie auf die Datei glide-dock_XP_1_pv.maegz und klicken Sie dann auf Öffnen.
- Doppelklicken Sie auf den Punkt, um den Liganden im Arbeitsbereich auszuwählen, und klicken Sie dann, um sitemap_1_protein auszuwählen. Klicken Sie auf Tabelle, schieben Sie den Mauszeiger nach ganz rechts, und zeigen Sie die Punktzahl unter der Andockpunktzahl an.
- Visualisierung von 2D-Ergebnissen
- Doppelklicken Sie auf den Punkt, um den Liganden im Arbeitsbereich auszuwählen, und klicken Sie dann, um auch sitemap_1_protein auszuwählen. Klicken Sie auf Ligandeninteraktion > Ansicht und aktivieren Sie das Kontrollkästchen LID-Legende .
- Klicken Sie auf Datei, wählen Sie Screenshot speichern, geben Sie 6000 in der Breite ein, deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für transparenten Hintergrund und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Desktop, benennen Sie die Datei als 2D-xanthatin-2FLU und speichern Sie das Bild.
- Visualisierung von 3D-Ergebnissen
- Doppelklicken Sie auf den Punkt, um den Liganden im Arbeitsbereich auszuwählen, und klicken Sie dann, um auch sitemap_1_protein auszuwählen.
- Klicken Sie in der Schnellauswahl auf L , um kleine Moleküle auszuwählen, und klicken Sie dann auf Stil. Klicken Sie auf die zweite Zeile im Stil, um die Größe der kleinen Molekülbindung zu ändern, und klicken Sie auf die Farbatome, um die Farbe der kleinen Moleküle zu ändern.
- Wählen Sie das kleine Molekül in der Abbildung aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Auswahl erweitern aus, und wählen Sie 4 Å aus. Klicken Sie auf Beschriftungen im Stil anwenden, um die Beschriftungen anzuzeigen.
- Klicken Sie auf die zweite Zeile im Stil, um die Größe der Aminosäurebindungen zu ändern, und klicken Sie auf die Farbatome , um die Aminosäurefarbe zu ändern.
- Klicken Sie auf Weiter > Invertieren, halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie auf die erste Augenposition unter Stil, um nur die Aminosäuren mit Beschriftungen anzuzeigen.
- Klicken Sie auf Style > Ribbons , um das Protein als Ribbon-Stil anzuzeigen, und klicken Sie auf Edit Ribbon under ribbons, um die Ribbon-Farbe zu ändern.
- Klicken Sie auf Interaktionen umschalten in der unteren rechten Ecke des Bildschirms, klicken Sie mit der rechten Maustaste und deaktivieren Sie Kontakte/Konflikte.
- Suchen Sie in Aufgaben nach Messen, wählen Sie Abstand und klicken Sie auf die beiden Atome, die durch die gelbe gestrichelte Linie (Wasserstoffbrückenbindung) auf dem Bildschirm verbunden sind, um die Länge der Wasserstoffbrückenbindungen zu messen.
- Halten Sie das Mausrad gedrückt, um das Protein zu drehen, das Protein in die Mitte des Bildschirms einzustellen und sicherzustellen, dass jede Aminosäuremarkierung sichtbar ist.
- Klicken Sie auf Arbeitsbereich > Bild speichern unter und klicken Sie auf den Desktop. Speichern Sie das Bild standardmäßig mit 600 dpi, benennen Sie die Datei als 3D-xanthatin-2FLU, wählen Sie den Dateityp als tiff-Format und speichern Sie das Bild.
3. Vorbereitung von Zellkultur- und CETSA-Proben
- Zellkultur
- 5 x 106 RAW264,7 Zellen/ml in eine 100-mm-Kulturschale geben und mit 6 mL DMEM-Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotikum-Antimykotik-Lösung bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 inkubieren. Bereiten Sie drei Gerichte vor und führen Sie das Experiment durch, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.
- CETSA-Probenvorbereitung
- Aspirieren Sie das alte Medium, geben Sie 2 ml auf Raumtemperatur erwärmte Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS) zu jedem Gericht und waschen Sie es 2x.
- Geben Sie 2 ml PBS in jede Zellschale, mischen Sie die Zellen und sammeln Sie die Zellen in zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 377 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Den Überstand verwerfen und die Zellen mit 2 ml PBS resuspendieren, die 1 % Breitspektrum-Proteaseinhibitor-Mischungen enthalten. In einzelne Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 1 ml Zellsuspension aufteilen.
- Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren, bis sie weiß sind, dann sofort in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen und 3x wiederholen. Zentrifugieren bei 12.000 x g bei 4 °C für 10 min.
- Man nehme zwei Mikrozentrifugenröhrchen, eines mit 100 μM Xanthatin und eines mit dem gleichen Volumen an DMSO, gib 450 μl zentrifugierten Überstand in jedes Röhrchen und inkubiere es 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Geben Sie den Überstand aus den beiden Mikrozentrifugenröhrchen in 14 PCR-Röhrchen mit einem Volumen von 60 μl/Röhrchen und erhitzen Sie die Röhrchen gleichzeitig bei unterschiedlichen Temperaturen (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C und 63 °C) für 3 min, wobei zwei PCR-Röhrchen bei jeder Temperatur für die DMSO- und Xanthatin-Gruppen verwendet werden. beziehungsweise.
- Für die unerhitzte Gruppe wird der Überstand aus jedem der beiden Mikrozentrifugenröhrchen entnommen und zu 14 PCR-Röhrchen hinzugefügt, 7 für die DMSO-Gruppe und 7 für die Xanthatin-Gruppe, mit einem Volumen von jeweils 60 μl. Erhitzen Sie die Proben hier nicht.
- Kühlen Sie die Röhren bei Raumtemperatur für die beheizte Gruppe ab. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen (beheizt und unbeheizt) bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C und geben Sie 48 μl Überstand aus jedem Röhrchen in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 12 μl SDS-PAGE-Proteinladepuffer in jedes Röhrchen, vermischen Sie es gut und erhitzen Sie es 5 Minuten lang in einem Wasserbad bei 100 °C.
HINWEIS: Vorbereitete CETSA-Proben müssen bei -80 °C gelagert und innerhalb von 1 Woche mit Western Blot getestet werden.
4. Western-Blot
- Vorbereitung des SDS-PAGE-Gels
- Spülen Sie eine lange und eine kurze Glasplatte mit Reinstwasser ab. Legen Sie die Platten in den Klemmschlitz und dann auf eine transparente Platte. Reinstwasser hinzufügen und 10 Minuten lang auf Dichtheit prüfen.
- 8 ml der unteren Gellösung und 8 ml des unteren Gelpuffers in einen erlenden Kolben geben und durch leichtes Schütteln mischen. Geben Sie 160 μl Gerinnungspromotor in die Gellösung und mischen Sie gut.
HINWEIS: Das Volumen der unteren Klebstoffschicht sollte die grüne Linie auf dem Klemmschlitz nicht überschreiten. - Lassen Sie das Reinstwasser von den Platten ab und tupfen Sie sie mit Filterpapier trocken. Fügen Sie die vorbereitete untere Gellösung hinzu. Fügen Sie 2 mL Isopropylalkohol hinzu und warten Sie 20 Minuten, bis die Masse fest ist.
- 2 ml der oberen Gellösung und 2 ml des oberen Gelpuffers werden in einen erlen Kolben gegeben und durch leichtes Schütteln des Kolbens gemischt.
- Entfernen Sie den Isopropylalkohol von der Gelschicht und tupfen Sie den überschüssigen Isopropylalkohol mit Filterpapier ab.
- Geben Sie 40 μl Gerinnungsmittelpromotor in die gemischte obere Gellösung, mischen Sie gut, fügen Sie es dann zwischen die langen und kurzen Glasplatten hinzu und führen Sie einen 1,5 mm 15-Loch-Kamm ein, warten Sie 20 Minuten.
HINWEIS: Der Kamm sollte senkrecht zur oberen Schicht eingeführt werden, ohne Luftblasen zwischen dem Kamm und der Lösung.
- Elektrophorese
- 1 l Reinstwasser in ein Becherglas geben, einen Beutel SDS-PAGE Laufpufferpulver hinzufügen, mit einem Glasstab gut umrühren und das vorbereitete Gel in die Elektrophoreseeinheit geben. Legen Sie das Gerät in die Box und ziehen Sie den Kamm heraus.
- Auftauen von Marker- und CETSA-Proben bei Raumtemperatur, Vortexen und Schleudern. Geben Sie 2,5 μl Marker in die erste Vertiefung und 20 μl CETSA-Proben in jede der verbleibenden Vertiefungen gemäß der vorgegebenen Reihenfolge.
HINWEIS: Die CETSA-Proben wurden gemäß der in Schritt 3.2.6 beschriebenen Temperaturbehandlung von 45 °C auf 63 °C nacheinander zugegeben. Zuerst wurde die DMSO-Gruppe und dann die Xanthatin-Gruppe hinzugefügt (Abbildung 1). - Geben Sie die restliche Elektrophoreselösung in die Elektrophoreseeinheit, schließen Sie den Deckel und führen Sie die Elektrode ein, Pluspol auf Pluspol, Minuspol auf Minuspol.
- Schalten Sie den Netzschalter ein und stellen Sie den Spannungsschalter auf 80 V ein, um die Elektrophorese zu starten.
- Übertragung auf Membran
- 850 mL Reinstwasser, 100 mL wasserfreies Ethanol und 50 mL Schnelltransferpuffer in ein Becherglas geben und gut umrühren. Bereiten Sie Schaumstoffplatten, Kunststoffmesser, Pinzetten, Tabletts und Membranübertragungsgeräte vor.
- Schneiden Sie die PVDF-Membran entsprechend der Größe des Gels zu, markieren Sie sie und weichen Sie sie 30 s lang in Methanol ein, um sie zu aktivieren.
- Gießen Sie die Transferlösung in das Fach, setzen Sie die Transferklammern ein und öffnen Sie sie, legen Sie ein Schwammpad und drei Schichten Transferfilterpapier ein.
- Stoppen Sie die Elektrophorese und öffnen Sie dann den Deckel der Elektrophoresebox. Nehmen Sie das Elektrophoresegerät, gießen Sie die Elektrophoreselösung aus und entfernen Sie die Platte. Legen Sie die Platte auf die Schaumstoffplatte, hebeln Sie sie vorsichtig mit einem Plastikmesser ab und schneiden Sie das Gel so ab, dass der Proteinmarker und die Zielproteine deutlich sichtbar sind.
- Halten Sie eine Seite des Markers mit einer Pinzette fest, waschen Sie ihn in einer Schale mit der Transmembranlösung und legen Sie ihn flach auf das Filterpapier. Tauchen Sie die aktivierte PVDF-Membran in die Transferlösung, halten Sie die markierte Seite mit einer Pinzette fest und decken Sie das Gel mit der Vorderseite nach unten ab.
HINWEIS: Die markierte Seite der PVDF-Membran ist die Vorderseite und achten Sie darauf, dass während des Bestückungsvorgangs keine Blasen entstehen. - Legen Sie zwei Schichten Transferfilterpapier und eine Schicht Schwammpad auf die PVDF-Membran, decken Sie die Transferklammern ab, klemmen Sie sie fest und legen Sie sie in den Transferbehälter.
HINWEIS: Schwarze Farbe des Transferclips auf schwarze Farbe des Transferschlitzes. - Geben Sie die restliche Transmembranlösung in die Transmembrankassette und decken Sie sie mit dem Deckel ab, positiv bis positiv, negativ bis negativ.
- Stellen Sie den Strom auf 400 mA und die Zeit auf 30 min ein und drücken Sie dann Run, um die Übertragung der Membran bei Raumtemperatur zu starten.
- Blockierend
- Geben Sie 2 l Reinstwasser in ein Glasfläschchen, fügen Sie einen Beutel TBS-Pulver hinzu und fügen Sie dann 2 ml Tween hinzu, um TBST-Lösung herzustellen. Wiegen Sie das BSA-Pulver, um eine 5%ige BSA-Lösung mit TBST herzustellen, und geben Sie 6 mL BSA-Lösung in die Inkubationsbox.
- Stoppen Sie den Membrantransfer und öffnen Sie dann den Transferclip. Klemmen Sie die Markierungsseite der PVDF-Membran fest und legen Sie sie in die Inkubationsbox. Stellen Sie die Inkubationsbox auf einen Schüttler und blockieren Sie sie 1,5 h lang bei Raumtemperatur.
- Inkubation des Primärantikörpers
- Bereiten Sie den Primärantikörper (siehe Materialtabelle für Details) mit 5%iger BSA-Lösung bei 1:1000 vor, recyceln Sie die BSA-Lösung in der Inkubatorbox und geben Sie 6 ml Primärantikörper in die Inkubationsbox. Stellen Sie die Inkubationsbox in eine Schaumstoffbox mit Eisbeuteln und bewahren Sie sie über Nacht auf einem Shaker auf.
- Inkubation des Sekundärantikörpers
- Sammeln Sie den primären Antikörper am nächsten Tag in der Inkubationsbox, fügen Sie dann 6 ml TBST-Lösung hinzu und legen Sie sie auf einen Schüttler, um sie 5 Minuten lang zu waschen.
- Gießen Sie die gewaschene TBST-Lösung ab und fügen Sie frische zum Waschen hinzu; 5x wiederholen und den Sekundärantikörper mit 5%iger BSA-Lösung bei 1:5000 vorbereiten.
- Gießen Sie die TBST-Lösung ab und geben Sie 6 ml Sekundärantikörper in die Inkubationsbox. Stellen Sie die Inkubationsbox auf einen Schüttler und inkubieren Sie sie 1,5 h lang bei Raumtemperatur.
- Sammeln Sie den Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle für Details), fügen Sie dann 6 ml TBST-Lösung hinzu und legen Sie sie auf einen Schüttler, um sie 5 Minuten lang zu waschen. Gießen Sie die gewaschene TBST-Lösung ab und fügen Sie frische zum Waschen hinzu; 5x wiederholen.
- Freilegen der Streifen
- Bewahren Sie die TBST-Lösung am Ende der letzten Wäsche auf. Nehmen Sie gleiche Mengen der Chemilumineszenz-Reagenzien A und B, schütteln Sie sie und mischen Sie sie gut. Schirmen Sie die Lösung vor Licht ab.
- Öffnen Sie das Gel-Imaging-System, klicken Sie auf Proben, überprüfen Sie die Kalibrierung, warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist, und klicken Sie dann auf Marker, Kalibrierung überprüfen.
- Nehmen Sie die Markierungsseite des Streifens mit einer Pinzette auf und tauchen Sie sie vollständig in die chemilumineszierende Reagenzlösung ein. Klemmen Sie eine Seite des Markers fest, um den Streifen mit der Vorderseite nach unten in den Imager zu legen, schließen Sie den Deckel des Imagers, klicken Sie auf Belichtung und stellen Sie die Belichtungszeit auf 1 s ein.
HINWEIS: Der Entwickler muss den Streifen vollständig abdecken, und die Entwicklung sollte sich in einer dunklen Umgebung befinden. - Klicken Sie auf Speichern, benennen Sie das Bild und speichern Sie es als .tif Datei. Analysieren Sie die optische Dichte des Western Blots. Die Grauwerte jeder Temperatur in der DMSO-Gruppe wurden mit den Grauwerten von 45 °C verglichen, und die Grauwerte jeder Temperatur in der Xanthatin-Gruppe wurden mit den Grauwerten von Xanthatin bei 45 °C verglichen.
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Representative Results
Die molekulare Docking-Analyse sagte die Wechselwirkung zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein voraus. Abbildung 2 zeigt die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Xanthatin und den Aminosäureresten Gly-367 und Val-606 des Keap1-Proteins mit einer Wasserstoffbrückenlänge von 2,17 Å für Gly-367 und 2,13 Å für Val-606. Darüber hinaus deutet der berechnete Docking-Score von -5,69 kcal/mol auf eine gute Bindungsaffinität zwischen Xanthatin und Keap1-Protein hin.
Die CETSA-Methode zeigte, dass die Xanthatinbindung die thermische Stabilität des Keap1-Proteins veränderte, was die Interaktion zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein21 bestätigte. Abbildung 3 zeigt, dass Xanthatin die thermische Stabilität des Keap1-Proteins im Temperaturbereich von 48 °C bis 57 °C im Vergleich zur DMSO-Gruppe bemerkenswert verschiebt. Um eine gleichmäßige Probenbelastung zu gewährleisten, war erstens die Dichte der Zellinokulation, bei der wir die Experimente durchführten, konsistent; zweitens wurden die Zellproben aus der DMSO-Gruppe und der Xanthatin-Gruppe in den Zellkulturschalen gut gemischt und dann gleichmäßig auf zwei Mikrozentrifugenröhrchen verteilt, wodurch die gleichbleibende Menge an Zellproben sichergestellt wurde, und das Volumen des Überstands, das jedem PCR-Röhrchen zugesetzt wurde, betrug 60 μl, und schließlich betrug das Volumen jeder Probe, die in den Western Blot hochgeladen wurde, 20 μl. Dies gewährleistete eine gleichmäßige Beladung der erhitzten Proben. Der Proteinabbau in Proben ab etwa 51 °C ist hauptsächlich auf Veränderungen der Proteinstruktur und beschleunigte chemische Reaktionen zurückzuführen, die durch hohe Temperaturen verursacht werden. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Xanthatin direkt an das Keap1-Protein binden kann.
Abbildung 1: Ladereihenfolge des Western Blots. Die Temperatur in der Reihenfolge von links nach rechts betrug 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C und 63 °C. Die erste Spur wurde mit einer Markierung versehen; Für jede Temperatur wurden zwei Fahrspuren verwendet; Die erste Lane war die DMSO-Gruppe und die zweite Lane die Xanthatin-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Interaktion zwischen Xanthatin und dem Protein Keap1 (PDB: 2FLU). (A) Die 2D-Darstellung von Xanthatin, das an Keap1 bindet. (B) Die 3D-Visualisierung von Xanthatin und Keap1 Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Einfluss von Xanthatin auf die thermische Stabilität des Keap1-Proteins. (A) Die Auswirkungen von Xanthatin auf die thermische Stabilität von Keap1 wurden mittels CETSA nachgewiesen. (B) Die optischen Dichten von Keap1 wurden auf die bei 45 °C erreichten Dichten normiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die statistische Analyse wurde durch eine unidirektionale Varianzanalyse (unidirektionale ANOVA) durchgeführt. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Identifizierung von Krankheitszielen sowie die Entdeckung und Entwicklung von Medikamenten sind eng miteinander verknüpft27. Durch die präzise Ausrichtung auf spezifische Ziele können Wirkstoffkandidaten entwickelt werden, um bestimmte Krankheiten effektiver zu behandeln und gleichzeitig die mit den Medikamenten verbundenen Nebenwirkungen zu minimieren 28,29. Die am häufigsten verwendeten Ziele sind Proteinziele30. Die Identifizierung spezieller Proteinziele stellt jedoch aufgrund der großen Vielfalt an Proteinen innerhalb der Zellen eine immense Herausforderung dar30,31. In dieser Arbeit haben wir einen Ansatz gewählt, der molekulares Docking mit CETSA kombiniert, um Proteinziele zu identifizieren und zu validieren. Die Ergebnisse zeigten eine direkte Wechselwirkung zwischen Xanthatin und dem Keap1-Protein. Die Integration von Computertechnologie und biologischen Experimenten kann auch bei der Untersuchung anderer Wirkstoffe und Proteinziele eingesetzt werden, um das Vorhandensein einer direkten Wechselwirkung zwischen dem Medikament und dem Ziel festzustellen. Dieser Ansatz, der Vorhersage und Verifizierung kombiniert, reduziert effektiv sowohl den Zeitaufwand als auch die wirtschaftlichen Kosten. Darüber hinaus sind die experimentellen Instrumente und Materialien leicht zu beschaffen, und der Betriebsprozess ist nicht kompliziert. Schließlich sind die CETSA-Proben einfach vorzubereiten und mit der Western-Blot-Methode zu testen, die die Reproduzierbarkeit der Proben gewährleistet.
Unserer Erfahrung nach gibt es mehrere kritische Aspekte, die bei experimentellen Verfahren besondere Aufmerksamkeit erfordern. Erstens ist es wichtig, die Kristallstruktur des Proteins auszuwählen, die durch Röntgenanalyse aufgelöst wird, wenn die Proteinstruktur vor dem molekularen Andocken ausgewählt wird. Zweitens sind die Zelldichte und die Einfrier-/Auftauzeit entscheidende Faktoren bei CETSA-Experimenten. Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase sollten für CETSA-Experimente ausgewählt werden, da ihr Wachstumszustand stabil ist und nur minimale Auswirkungen auf die experimentellen Ergebnisse hat. Während des wiederholten Einfrierens und Auftauens von Zellen sollte der Zeitpunkt gut kontrolliert werden, wobei flüssiger Stickstoff zum Einfrieren verwendet wird, bis er eine weiße feste Form hat, gefolgt von einem sofortigen Auftauen bei Raumtemperatur vor nachfolgenden Gefrierzyklen. Schließlich müssen Western-Blot-Experimente unmittelbar nach der Vorbereitung von CETSA-Proben abgeschlossen werden, um einen Proteinabbau zu verhindern.
Molekulares Docking und CETSA sind beides etablierte Techniken, die im Bereich der Arzneimittelentwicklung eine entscheidende Rolle spielen. Molekulares Docking ist maßgeblich an der Vorhersage von Wechselwirkungen auf molekularer Ebene zwischen Verbindungen und ihren Zielen beteiligt und bietet wertvolle Einblicke in potenzielle Bindungsmodi10,11. Im Gegensatz dazu konzentriert sich CETSA auf die Bewertung der Auswirkungen von Arzneimitteln auf die thermische Stabilität von Proteinen und dient als Instrument zur Validierung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen17. Obwohl CETSA eine relativ einfache Methode zur Verifizierung ist, ist es auch eine Methode mit geringem Durchsatz, da Western Blot für die Untersuchung der thermischen Verschiebung des Wirkstoff-Protein-Komplexes verwendet wird, und es sollte nicht die einzige Technik sein, auf die man sich verlässt. Darüber hinaus sind die Schritte von CETSA kompliziert, und alle Schrittfehler während der Operation können einen großen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Darüber hinaus kann die CETSA-Methode die spezifische Bindungsstelle und den Bindungsmodus der Verbindung an das Proteinziel nicht bestimmen und nicht angeben, ob die Bindung kovalent oder nicht-kovalent ist 17,18,23. Neben dem thermischen Shift-Assay können auch andere Arten von energetischen Assays, wie z. B. die pH-abhängige Proteinfällung (pHDPP), für die Untersuchung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden32. Darüber hinaus ist das thermische Proteom-Profiling eine energiebasierte Methode zur Aufdeckung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen, die durch die Kombination von Proteomik mit CETSA33 eine groß angelegte Analyse von Protein-Wirkstoff-Wechselwirkungen mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Darüber hinaus kann die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) weitere qualitative und quantitative Analysen liefern34,35. Es bestimmt nicht nur das Vorhandensein von Wechselwirkungen zwischen einem Medikament und seinem Ziel, sondern misst auch die Affinitätsparameter und kinetischen Parameter dieser intermolekularen Wechselwirkungen und bietet so ein umfassenderes Verständnis.
Neben dem thermischen Shift-Assay kann die pH-abhängige Proteinfällung (pHDPP) auch zur Untersuchung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden32. Molekulares Docking ist eine physikomechanisch basierte Simulationsmethode zur Vorhersage von Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen und Biomolekülen. Diese Methode zielt darauf ab, eine Bindung zu erreichen, indem die Konformation und Orientierung kleiner Moleküle optimiert wird, um die beste Komplementarität zwischen ihnen und Biomolekülen zu erzielen. Bei der Zielvorhersage werden Techniken der künstlichen Intelligenz eingesetzt, um die Bindungsstellen zwischen kleinen Molekülen und Biomolekülen vorherzusagen. Die beiden Ansätze weisen wesentliche Unterschiede in der Methodenanwendung und der Vorhersagegenauigkeit auf. Anwendung der Methode: Molekulares Docking wird hauptsächlich für das Design und die Optimierung von Wirkstoffen eingesetzt und bietet eine theoretische Grundlage für die Entdeckung neuer Wirkstoffe. Die Zielvorhersage mit Hilfe fortschrittlicherer künstlicher Intelligenz wird immer häufiger auf das Hochdurchsatz-Screening und die schnelle Entdeckung von Leitsubstanzen angewendet, um die Effizienz der Wirkstoffforschung zu verbessern. Vorhersagegenauigkeit: Da das molekulare Docking auf physikalischen Simulationen basiert, ist die Vorhersagegenauigkeit höher, aber auch der Rechenaufwand ist relativ hoch. Während die Zielvorhersage einen geringeren Rechenaufwand hat, hängt die Vorhersagegenauigkeit von der Fülle der Trainingsdaten und der Modellauswahl ab.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82004031) und dem Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303) unterstützt. Wir danken Jiayi Sun vom Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine für die Unterstützung bei Western Blot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
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