Summary
여기에 사용된 실험은 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 세포 열 이동 분석과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.
Abstract
단백질은 인간 생리학의 근간을 이루며, 단백질의 표적은 연구 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 중요한 단백질 표적의 식별 및 검증은 약물 개발의 필수 요소가 되었습니다. 분자 도킹은 특히 약물 및 단백질 표적 상호 작용의 맥락에서 단백질-리간드 결합을 조사하는 데 널리 사용되는 계산 도구입니다. 결합의 실험적 검증을 위해 약물과 표적의 결합에 직접 접근하기 위해 세포 열 이동 분석(CETSA) 방법이 사용됩니다. 이 연구는 분자 도킹을 CETSA와 통합하여 약물과 필수 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하는 것을 목표로 했습니다. 구체적으로, 분자 도킹 분석을 통해 xanthatin과 Keap1 단백질의 상호작용 및 결합 모드를 예측한 후 CETSA assay를 이용하여 상호작용을 검증하였습니다. 우리의 결과는 xanthatin이 Keap1 단백질의 특정 아미노산 잔기와 수소 결합을 형성하고 Keap1 단백질의 열안정성을 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 xanthatin이 Keap1 단백질과 직접 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다.
Introduction
단백질은 살아있는 유기체에서 매우 중요한 거대분자이며 막 구성, 세포골격 형성, 효소 활성, 수송, 세포 신호 전달, 세포 내 및 세포 외 메커니즘에 대한 관여와 같은 세포 내에서 다양한 고유 기능을 가지고 있습니다 1,2,3. 단백질은 주로 다른 단백질, 핵산, 소분자 리간드 및 금속 이온 1,4을 포함한 다양한 분자와의 특정 상호 작용을 통해 생물학적 기능을 나타냅니다. 리간드는 유기체의 단백질에 특이적으로 결합하는 작은 분자 화합물입니다. 단백질과 리간드 사이의 상호작용은 결합 부위(binding site)라고 불리는 단백질의 특정 부위에서 발생하며, 이는 결합 포켓(binding pocket)이라고도 한다5. 의약화화학 연구에서 초점은 약물의 표적 역할을 하는 질병과 명확하게 연관된 핵심 단백질을 식별하는 데 있다6. 따라서 단백질과 리간드 사이의 결합 부위에 대한 깊은 이해를 얻는 것은 약물 발견, 설계 및 연구를 촉진하는 데 가장 중요합니다 7,8.
분자 도킹은 단백질-리간드 결합을 연구하는 데 널리 사용되는 계산 도구로, 단백질과 리간드의 3차원 구조를 사용하여 안정적인 복합체를 형성할 때 주요 결합 모드와 친화도를 탐색합니다 9,10,11. 분자 도킹 기술의 적용은 1970년대에 시작되었습니다. lock and key pairing 원리를 기반으로 분자 도킹 소프트웨어의 알고리즘을 활용하여 도킹 결과를 분석하여 화합물과 분자 타겟 간의 상호 작용을 결정할 수 있습니다. 이 접근법을 통해 화합물과 표적 분자 모두에 대한 활성 결합 부위를 예측할 수 있습니다. 결과적으로, 이는 리간드-수용체 상호 작용에 대한 최적의 결합 구조(여기서는 결합 모델이라고 함)의 식별을 용이하게 하며, 이는 이러한 분자 결합 12,13,14,15의 역학을 이해하는 데 중요합니다. 분자 도킹은 리간드-수용체 상호 작용에 대한 귀중한 컴퓨터 기반 예측을 제공하지만, 이는 예비 결과라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 이러한 상호 작용을 확인하기 위해 추가 실험적 검증이 필수적입니다.
2013년 Pär Nordlund의 연구팀이 처음 제안한 세포 열 이동 분석(CETSA)은 약물-표적 단백질 상호 작용을 검증하는 방법 역할을 합니다. 이 기술은 약물 결합에 의해 유도된 표적 단백질의 열적 안정성을 특이적으로 테스트하여 분자 상호 작용을 확인하기 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다 16,17,18. 이 접근법은 리간드 결합이 표적 단백질 내에서 열 이동을 시작한다는 기본 원리를 기반으로 하며 세포 용해물, 온전한 살아있는 세포 및 조직19,20을 포함한 광범위한 생물학적 샘플에 적용할 수 있습니다. CETSA는 리간드 결합으로 인한 단백질의 열역학적 안정화를 감지하고 관찰된 표현형 반응을 표적 화합물21,22에 연결하여 원형(intact) 세포에서 소분자의 직접적인 표적 결합을 지원합니다. CETSA에서 파생된 다양한 방법론 중 WB-CETSA(Western Blot-CETSA)는 고전적인 접근 방식으로 간주됩니다. CETSA 방법을 사용한 시료 전처리 후 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 표적 단백질의 열적 안정성 변화를 감지합니다. 이를 통해 세포 시스템 내에서 약물-단백질 상호 작용을 정확하게 결정할 수 있습니다17,23.
Xanthatin은 비강염 및 관절염과 같은 질병을 치료하기 위해 중국 전통 의학에서 사용되어 온 항염증제와 같은 특성을 가진 식물 Xanthium L.에서 분리된 생체 활성 화합물입니다24,25. 켈치 유사 ECH 관련 단백질 1(Keap1)은 Cullin3 기반 Cullin-RING E3 유비퀴틴 리가아제 다중 서브유닛 단백질 복합체의 구성 요소이며 세포 내 산화 환원 항상성의 중요한 조절자이며, 이는 세포 내 산화 환원 상태26을 조절하여 염증 반응의 강도와 지속 기간에 영향을 미칩니다. 이 연구에서는 먼저 분자 도킹을 활용하여 xanthatin(소분자)과 Keap1 단백질 간의 상호 작용을 조사하여 결합 모드를 예측하는 것을 목표로 했습니다. 그 후, CETSA 방법을 사용하여 Keap1 단백질의 열적 안정성에 대한 xanthatin의 영향을 평가함으로써 이러한 상호 작용을 검증했습니다.
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Protocol
1. xanthatin 및 Keap1의 구조 다운로드
- PubChem 데이터베이스(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)를 열고 xanthatin(소분자)을 입력한 다음 검색을 누르고 첫 번째 결과를 클릭합니다. Download( 다운로드 )를 클릭하고 2D structure(2D structure)에서 Save(저장 )를 클릭하여 화합물을 .sdf 형식으로 저장합니다.
- 단백질의 결정 구조를 다운로드합니다.
- UniProt 데이터베이스(https://www.uniprot.org/)를 열고 Keap1을 입력한 다음 검색을 클릭합니다. 왼쪽 열의 인기 있는 유기체 아래에서 인간 을 클릭한 다음 오른쪽 열에서 Q14145라는 첫 번째 항목을 클릭합니다.
- 왼쪽 열의 함수 아래에 있는 구조를 클릭하고 PDB ID가 2FLU인 구조를 찾은 다음 RCSB-PDB를 클릭합니다. Download Files(파일 다운로드 )를 클릭하고 PDB Format(PDB 형식 )을 선택하여 Keap1 단백질의 결정 구조를 다운로드합니다.
2. 분자 도킹
- 바탕 화면에 molecular docking이라는 새 폴더를 만들고 다운로드한 xanthatin(소분자) 및 Keap1(단백질) 구조를 이 폴더에 저장합니다.
참고: 폴더 이름과 경로는 영어여야 합니다. - Maestro 소프트웨어를 열고, 파일을 클릭하고, 작업 디렉토리 변경을 선택하고, 바탕 화면을 클릭하고, 새로 생성된 분자 도킹 폴더를 두 번 클릭하여 선택한 다음 옵션 선택을 클릭합니다.
- 저분자 처리
- 파일을 클릭하고 구조 옵션을 가져오고, 바탕 화면을 클릭하고, 분자 도킹 폴더를 두 번 클릭하고, xanthatin Structure File을 클릭한 다음, 열기를 클릭하여 small molecule 파일을 가져옵니다.
- 소프트웨어의 오른쪽 상단 모서리에 있는 작업을 클릭하고 LigPrep 옵션을 선택합니다. 작업 공간의 구조를 사용합니다. 나머지 파라미터는 기본 파라미터이며 Run(실행 )을 클릭하여 small molecule 처리를 수행합니다.
- 단백질 구조 처리
- File(파일) 및 Import Structures(구조체 가져오기) 옵션을 클릭하고 Desktop(데스크톱)을 클릭한 다음 Molecular Docking 폴더를 두 번 클릭합니다. Keap1 Protein Structure 파일을 클릭한 다음 Open을 클릭하여 단백질 구조 파일을 가져옵니다.
- 소프트웨어의 오른쪽 상단 모서리에 있는 작업을 클릭하고 단백질 준비 마법사 옵션을 선택합니다. Het Groups에서 5 Å 이상의 물을 삭제하기 전에 확인란을 선택하고 pH를 7.4+/-0.0으로 입력합니다. [Preprocess]를 클릭하고 [Refine]을 클릭한 다음 [Optimize]를 클릭하고 [Optimize]> "Remove Waters > Minimize]를 클릭합니다.
- 이전 작업이 완료되면 다음 작업을 클릭합니다. 작업을 클릭하고 Sitemap 옵션을 선택한 다음 모든 매개 변수에 대해 기본 설정을 사용하고 실행을 클릭합니다.
- File and Import Structures options(파일 및 구조 가져오기 옵션)를 클릭하고, Desktop(데스크톱)을 클릭하고, molecular docking 폴더를 두 번 클릭하고, sitemap_1라는 폴더를 엽니다. Sitemap_1_out.maegz라는 첫 번째 파일을 클릭한 다음 열기를 클릭합니다.
- 점을 두 번 클릭하여 작업 공간에서 sitemap_1_protein 선택한 다음 Sitemap_1_site_1 클릭하여 선택합니다. 작업(Tasks )을 클릭하고 Receptor Grid Generation(수용체 그리드 생성 ) 옵션을 선택합니다.
참고: 사이트맵에 의해 예측된 단백질 사이트는 점수에 따라 순위가 매겨지며 가장 높은 점수를 받은 사이트가 먼저 순위가 매겨집니다. - receptor(수용체)에서 Entry(항목 ) 옵션을 선택하고 나머지 매개변수는 변경하지 않습니다. 단백질 구조에서 Small White Ball 을 클릭하여 기본 크기의 도킹 상자를 생성하고 작업 이름을 glide-grid_2FLU로 변경합니다. 실행을 클릭합니다.
- 분자 도킹
- Tasks(작업)를 클릭하고 Ligand Docking(리간드 도킹) 옵션을 선택합니다. 파일에서 Receptor Grid As를 선택하고 찾아보기를 클릭합니다. 바탕 화면을 클릭하고, 분자 도킹 폴더를 두 번 클릭하고, 글라이드 grid_2FLU 파일을 두 번 클릭하고, Glide-grid_2FLU.zip 파일을 클릭한 다음 열기를 클릭합니다.
- 파일에서 리간드 사용을 클릭하고 > 바탕 화면을 찾아>. 분자 도킹 폴더를 두 번 클릭하고, ligprep_1 파일을 두 번 클릭하고, Ligprep_1-out.maegz 파일을 차례로 클릭한 다음 열기를 클릭합니다.
- 설정을 클릭하고 XP로 정밀도(추가 정밀도) 옵션을 선택하고 작업 이름을 글라이드 dock_XP_2FLU로 변경한 다음 실행을 클릭합니다.
- 도킹 결과 보기
- File and Import Structures options(파일 및 구조 가져오기 옵션)를 클릭하고, Desktop(바탕 화면)을 클릭한 다음 Molecular Docking 폴더를 두 번 클릭합니다. glide-dock_XP_2FLU 파일을 두 번 클릭하고 glide-dock_XP_1_pv.maegz 파일을 클릭한 다음 열기를 클릭합니다.
- 점을 두 번 클릭하여 작업 공간에서 ligand를 선택한 다음 sitemap_1_protein를 클릭하여 선택합니다. 표를 클릭하고 맨 오른쪽으로 밀고 도킹 점수 아래의 점수를 확인합니다.
- 2D 결과의 시각화
- 점을 두 번 클릭하여 작업 공간에서 ligand를 선택한 다음 sitemap_1_protein도 클릭하여 선택합니다. Ligand Interaction > View 를 클릭하고 LID 범례 상자를 확인합니다.
- 파일을 클릭하고, 스크린샷 저장을 선택하고, 너비에 6000을 입력하고, 투명 배경 확인란의 선택을 취소하고, 확인을 클릭합니다. 바탕 화면을 클릭하고 파일 이름을 2D-xanthatin-2FLU로 지정한 다음 이미지를 저장합니다.
- 3D 결과의 시각화
- 점을 두 번 클릭하여 작업 공간에서 ligand를 선택한 다음 sitemap_1_protein도 클릭하여 선택합니다.
- 빠른 선택(Quick Select)에서 L 을 클릭하여 작은 분자를 선택한 다음 스타일(Style)을 클릭합니다. 스타일에서 두 번째 줄을 클릭하여 소분자 결합의 크기를 변경하고 색상 원자를 클릭하여 소분자 색상을 변경합니다.
- 그림에서 작은 분자를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 선택 영역 확장을 선택하고 4 Å를 선택합니다. Apply Labels in style(스타일에 레이블 적용 )을 클릭하여 레이블을 표시합니다.
- 스타일의 두 번째 줄을 클릭하여 아미노산 결합의 크기를 변경하고 색상 원자 를 클릭하여 아미노산 색상을 변경합니다.
- Next(다음) > Invert(반전)를 클릭하고 Control 키를 누른 상태에서 style 아래의 첫 번째 눈 위치를 클릭하여 레이블이 있는 아미노산만 표시합니다.
- Style > Ribbons(리본 스타일)를 클릭하여 단백질을 리본 스타일로 표시하고 리본 아래의 Edit Ribbon(리본 편집)을 클릭하여 리본 색상을 변경합니다.
- 화면 오른쪽 하단의 상호 작용 토글을 클릭하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 연락처/충돌을 선택 취소합니다.
- 작업에서 측정을 검색하고 거리를 선택한 다음 화면에서 노란색 점선(수소 결합)으로 연결된 두 개의 원자를 클릭하여 수소 결합 길이를 측정합니다.
- 마우스 휠을 길게 눌러 단백질을 회전하고, 단백질을 화면 중앙으로 조정하고, 각 아미노산 라벨이 보이는지 확인합니다.
- Workspace > Save Image as(다른 이름으로 이미지 저장)를 클릭하고 바탕 화면을 클릭합니다. 기본적으로 이미지를 600dpi로 저장하고, 파일 이름을 3D-xanthatin-2FLU로, 파일 형식을 tiff 형식으로 선택하고, 이미지를 저장합니다.
3. 세포 배양 및 CETSA 시료 전처리
- 세포 배양
- 5 x 106 RAW264.7 cells/mL를 100mm 배양 접시에 넣고 37°C, 95% 습도 및 5%CO2에서 10% FBS 및 1% 항생제-항진균 용액이 포함된 6mL의 DMEM 배지로 배양합니다. 세 가지 요리를 준비하고 세포가 80%의 밀도에 도달하면 실험을 수행합니다.
- CETSA 시료 전처리
- 기존 배지를 흡인하고 실온으로 데운 인산염 완충 식염수(PBS) 2mL를 각 접시에 넣고 2번 세척합니다.
- 세포의 각 접시에 2mL의 PBS를 추가하고, 세포를 혼합하고, 세포를 두 개의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다. 실온에서 377 x g 으로 3분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 1% 광범위 프로테아제 억제제 혼합물을 함유한 2mL의 PBS로 세포를 재현탁시킵니다. 각각 1mL의 세포 현탁액이 있는 개별 마이크로 원심분리기 튜브로 나눕니다.
- 미세 원심분리기 튜브를 액체 질소에 하얗게 굳어질 때까지 얼린 다음 즉시 37°C 수조에서 해동하고 3회 반복합니다. 4°C에서 12,000 x g 으로 10분 동안 원심분리기
- 100μM 크산토틴과 동일한 부피의 DMSO가 있는 두 개의 미세 원심분리기 튜브를 사용하여 각 튜브에 450μL의 원심분리 상층액을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 두 개의 마이크로 원심 분리기 튜브의 상층액을 60 μL / 튜브의 부피로 14 개의 PCR 튜브에 추가하고 다양한 온도 (45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C 및 63 °C)에서 동시에 튜브를 가열하고 각 온도에서 2 개의 PCR 튜브를 사용하여 DMSO 및 xanthatin 그룹에 대해 각각.
- 가열되지 않은 그룹의 경우 2개의 미세 원심분리기 튜브 각각에서 상등액을 채취하여 14개의 PCR 튜브(DMSO 그룹의 경우 7개, 잔토틴 그룹의 경우 7개)에 각각 60μL의 부피로 추가합니다. 여기에서 샘플을 가열하지 마십시오.
- 가열된 그룹을 위해 실온에서 튜브를 냉각합니다. 모든 튜브(가열식 및 비가열식)를 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 각 튜브에서 48μL의 상층액을 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 가져옵니다. 각 튜브에 12μL의 SDS-PAGE 단백질 로딩 버퍼를 추가하고 와류를 넣어 잘 섞은 다음 100°C의 수조에서 5분 동안 가열합니다.
참고: 준비된 CETSA 샘플은 -80°C에서 보관하고 1주일 이내에 웨스턴 블롯으로 테스트해야 합니다.
4. 웨스턴 블롯
- SDS-PAGE 겔의 제조
- 긴 유리판 하나와 짧은 유리판 하나를 초순수로 헹굽니다. 플레이트를 클램핑 슬롯에 넣은 다음 투명 보드에 놓습니다. 초순수를 넣고 10분 동안 누수 확인합니다.
- 하부 겔 용액 8mL와 하부 겔 완충액 8mL를 원뿔형 플라스크에 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다. 겔 용액에 160μL의 응고제 프로모터를 추가하고 잘 섞는다.
알림: 접착제 하단 층의 부피는 cl의 녹색 선을 초과해서는 안 됩니다.amp잉 슬롯. - 접시에서 초순수를 배출하고 여과지로 물기를 닦아냅니다. 준비된 하단 젤 용액을 추가합니다. 이소프로필 알코올 2mL를 넣고 응고될 때까지 20분 동안 기다립니다.
- 상부 겔 용액 2mL와 상부 겔 완충액 2mL를 원추형 플라스크에 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 섞습니다.
- 겔 층에서 이소프로필 알코올을 제거하고 여과지로 여분의 이소프로필 알코올을 닦아냅니다.
- 혼합된 상부 겔 용액에 40μL의 응고제 프로모터를 추가하고 잘 섞은 다음 긴 유리판과 짧은 유리판 사이에 넣고 1.5mm 15홀 빗을 삽입하고 20분 동안 기다립니다.
알림: 빗은 빗과 용액 사이에 기포가 없도록 상층에 수직으로 삽입해야 합니다.
- 전기영동
- 비이커에 초순수 1L를 넣고 SDS-PAGE 러닝 버퍼 파우더 한 봉지를 넣고 유리 막대로 잘 저어주고 준비된 겔을 전기영동 장치에 넣습니다. 장치를 상자에 넣고 빗을 당겨 빼냅니다.
- 마커 및 CETSA 샘플을 실온, 와류 및 스핀다운에서 해동합니다. 미리 결정된 순서에 따라 첫 번째 웰에 2.5μL의 마커를 추가하고 나머지 웰 각각에 20μL의 CETSA 샘플을 추가합니다.
참고: CETSA 샘플은 45°C에서 63°C까지 3.2.6단계에서 설명한 온도 처리에 따라 연속적으로 첨가되었습니다. DMSO 그룹이 먼저 추가된 다음 xanthatin 그룹이 추가되었습니다(그림 1). - 남은 전기영동 용액을 전기영동 장치에 넣고 뚜껑을 닫고 전극을 삽입하고 양극에서 양극으로, 음극에서 음극을 삽입합니다.
- 전원 스위치를 켜고 전압 스위치를 80V로 조정하여 전기 영동을 시작합니다.
- 멤브레인으로 전송
- 초순수 850mL, 무수 에탄올 100mL, 급속 전달 완충액 50mL를 비커에 넣고 잘 저어줍니다. 폼 보드, 플라스틱 칼, 핀셋, 트레이 및 멤브레인 이송 장치를 준비합니다.
- 겔의 크기에 따라 PVDF 멤브레인을 자르고 표시한 후 메탄올에 30초 동안 담가 활성화시킵니다.
- 전사 용액을 트레이에 붓고 전사 클램프를 놓고 열고 스폰지 패드와 전사 여과지 3층을 놓습니다.
- 전기영동을 중지한 다음 전기영동 상자의 뚜껑을 엽니다. 전기 영동 장치를 가져 와서 전기 영동 용액을 붓고 플레이트를 제거하십시오. 폼 보드에 플레이트를 놓고 플라스틱 칼로 부드럽게 들어 올린 다음 겔을 잘라 단백질 마커와 대상 단백질을 명확하게 시각화합니다.
- 핀셋으로 마커의 한쪽을 잡고 막관통 용액이 들어있는 트레이에 세척한 다음 여과지 위에 평평하게 놓습니다. 활성 PVDF 멤브레인을 전사 용액에 담그고 핀셋으로 라벨이 부착된 면을 잡고 겔을 앞면이 아래로 향하게 덮습니다.
알림: PVDF 멤브레인으로 표시된 면은 전면이며 배치 과정에서 기포가 생성되지 않는다는 사실에 주의하십시오. - PVDF 멤브레인에 전사 여과지 2층과 스폰지 패드 1층을 놓고 전사 클립을 덮고 clamp 전사 탱크에 넣습니다.
참고: 전송 클립의 검은색에서 전송 슬롯의 검은색으로. - 나머지 막관통 용액을 막관통 카세트에 추가하고 뚜껑을 덮고 양극에서 양극, 음극에서 음극으로 덮습니다.
- 전류를 400mA로, 시간을 30분으로 조정한 다음 Run을 눌러 실온에서 멤브레인 전달을 시작합니다.
- 블로킹
- 유리병에 초순수 2L를 넣고 TBS 분말 한 봉지를 넣은 다음 Tween 2mL를 넣어 TBST 용액을 만듭니다. BSA 분말의 무게를 측정하여 TBST가 포함된 5% BSA 용액을 준비하고 배양 상자에 6mL의 BSA 용액을 추가합니다.
- 멤브레인 전송을 중지한 다음 전송 클립을 엽니다. Clamp PVDF 멤브레인의 마커 쪽을 배양 상자에 넣습니다. 배양 상자를 셰이커에 놓고 실온에서 1.5시간 동안 차단합니다.
- 1차 항체 배양
- 1:1000에서 5% BSA 용액으로 1차 항체(자세한 내용은 재료 표 참조)를 준비하고, 인큐베이터 상자에서 BSA 용액을 재활용하고, 배양 상자에 1차 항체 6mL를 추가합니다. 인큐베이션 박스를 얼음 팩이 있는 폼 박스에 넣고 밤새 셰이커에 올려 둡니다.
- 2차 항체 배양
- 다음날 배양 상자에 1차 항체를 채취한 후 TBST 용액 6mL를 넣고 셰이커에 올려 5분 동안 세척합니다.
- 세척 된 TBST 용액을 붓고 세척을 위해 신선하게 첨가하십시오. 5x를 반복하고 1:5000에서 5% BSA 용액으로 2차 항체를 준비합니다.
- TBST 용액을 붓고 배양 상자에 2차 항체 6mL를 추가합니다. 배양 상자를 셰이커에 놓고 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다.
- 2차 항체를 채취한 다음(자세한 내용은 재료 표 참조) TBST 용액 6mL를 추가하고 셰이커에 올려 5분 동안 세척합니다. 세척 된 TBST 용액을 붓고 세척을 위해 신선하게 첨가하십시오. 5회 반복합니다.
- 스트립 노출
- 마지막 세척이 끝날 때 TBST 용액을 유지하십시오. 화학발광 시약 A와 B를 같은 부피로 잡고 흔들어 잘 섞는다. 용액을 빛으로부터 보호하십시오.
- 겔 이미징 시스템을 열고, Samples(샘플)를 클릭하고, 보정을 확인하고, 보정이 완료될 때까지 기다린 다음 Marker, check calibration(마커, 보정 확인)을 클릭합니다.
- 핀셋으로 스트립의 마커 쪽을 잡고 화학발광 시약 용액에 완전히 담그십시오. Clamp 마커의 한쪽을 눌러 스트립을 이미저에 뒤집어 놓고 이미저의 덮개를 닫고 노출을 클릭하고 노출 시간을 1초로 설정합니다.
참고: 개발자는 스트립을 완전히 덮어야 하며 개발은 어두운 환경에서 이루어져야 합니다. - 저장을 클릭하고 이미지 이름을 지정한 다음 .tif 파일로 저장합니다. 웨스턴 블롯의 광학 밀도를 분석합니다. DMSO 그룹 내 각 온도의 그레이 값을 45°C의 그레이 값과 비교하고, xanthatin 그룹 내 각 온도의 그레이 값을 45°C의 xanthatin의 그레이 값과 비교하였다.
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Representative Results
분자 도킹 분석은 xanthatin과 Keap1 단백질 사이의 상호 작용을 예측했습니다. 그림 2 는 Klead1 단백질의 잔기인 크산토틴과 아미노산 잔기 Gly-367 및 Val-606 사이의 수소 결합 형성을 보여주며, 수소 결합 길이는 Gly-367의 경우 2.17Å, Val-606의 경우 2.13Å입니다. 또한, -5.69 kcal/mol의 계산된 도킹 점수는 잔타틴과 Keap1 단백질 사이의 결합 친화도가 양호함을 의미합니다.
CETSA 방법은 xanthatin 결합이 Keap1 단백질의 열적 안정성을 이동시켜 xanthatin과 Keap1 단백질21 사이의 상호 작용을 확인했습니다. 그림 3 은 xanthatin이 DMSO 그룹에 비해 48 °C에서 57 °C의 온도 범위 내에서 Keap1 단백질의 열 안정성을 현저하게 변화시킨다는 것을 나타냅니다. 동일한 샘플 로딩을 보장하기 위해 첫째, 실험을 수행한 세포 접종의 밀도가 일정했습니다. 둘째, DMSO 그룹 및 잔토틴 그룹의 세포 샘플을 세포 배양 접시에 잘 혼합한 후 두 개의 마이크로 원심분리기 튜브에 균등하게 분포시켜 일관된 양의 세포 샘플량을 보장하고, 각 PCR 튜브에 첨가된 상층액의 부피는 60 μL이고, 마지막으로 웨스턴 블롯에 업로드된 각 샘플의 부피는 20 μL이고, 격렬한 표본을 위한 동등한 선적을 지키는지 어느 것이. 약 51°C에서 시료의 단백질 분해는 주로 단백질 구조의 변화와 고온으로 인한 화학 반응 가속화 때문입니다. 위의 결과는 xanthatin이 Keap1 단백질에 직접 결합할 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: 웨스턴 블롯의 적재 순서. 온도는 왼쪽에서 오른쪽으로 45°C, 48°C, 51°C, 54°C, 57°C, 60°C, 63°C 순이었다. 첫 번째 차선에는 마커가 추가되었습니다. 각 온도에 대해 두 개의 레인이 사용되었습니다. 첫 번째 레인은 DMSO 그룹이었고 두 번째 레인은 xanthatin 그룹이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 잔타틴과 Keap1(PDB: 2FLU) 단백질 간의 상호 작용. (A) Keap1에 바인딩되는 xanthatin의 2D 표현. (B) xanthatin 및 Keap1 단백질의 3D 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Keap1 단백질의 열적 안정성에 대한 xanthatin의 효과. (A) Keap1의 열 안정성에 대한 xanthatin의 영향은 CETSA에 의해 감지되었습니다. (B) Keap1의 광학 밀도는 45°C에서 얻은 것으로 정규화되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 수행되었습니다. n = 3입니다. *P < 0.05, **P < 0.01, P < 0.001, P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
질병 표적의 식별과 약물의 발견 및 개발은 밀접하게 상호 연결되어 있습니다27. 특정 표적을 정확하게 표적으로 함으로써, 약물 후보는 약물과 관련된 부작용을 최소화하면서 동시에 특정 질병을 보다 효과적으로 치료하도록 개발될 수 있다(28,29). 가장 일반적으로 사용되는 표적은 단백질 표적30입니다. 그러나, 특별한 단백질 표적의 ID는 세포 내의 단백질의 광대한 다양성 때문에 엄청난 도전을 제기한다30,31. 이 논문에서는 단백질 표적을 식별하고 검증하기 위해 분자 도킹과 CETSA를 결합하는 접근 방식을 채택했습니다. 그 결과, 잔타틴과 Keap1 단백질 사이에 직접적인 상호작용이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 컴퓨터 기술과 생물학 실험의 통합은 약물과 표적 사이의 직접적인 상호 작용의 존재를 확인하기 위해 다른 약물 및 단백질 표적의 조사에도 사용될 수 있습니다. 예측과 검증을 결합한 이 접근 방식은 시간 소비와 경제적 비용을 모두 효과적으로 줄입니다. 또한 실험 도구와 재료를 쉽게 구할 수 있으며 작업 과정이 복잡하지 않습니다. 마지막으로, CETSA 샘플은 웨스턴 블롯 방법으로 준비 및 테스트가 용이하여 샘플의 재현성을 보장합니다.
우리의 경험에 비추어 볼 때, 실험 절차 중에 특별한주의를 기울여야하는 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 첫째, 분자 도킹 전에 단백질 구조를 선택할 때 X-ray 분석으로 분해된 단백질의 결정 구조를 선택하는 것이 중요합니다. 둘째, 세포 밀도와 동결/해동 시간은 CETSA 실험에서 중요한 요소입니다. 로그 성장 단계의 세포는 성장 상태가 안정적이고 실험 결과에 미치는 영향이 최소화되므로 CETSA 실험을 위해 선택해야 합니다. 세포의 동결 및 해동을 반복하는 동안 하얀 고체 형태가 될 때까지 동결에 사용되는 액체 질소를 사용하여 타이밍을 잘 제어해야 하며, 그 후에는 후속 동결 주기 전에 실온에서 즉시 해동해야 합니다. 마지막으로, 웨스턴 블롯 실험은 단백질 분해를 방지하기 위해 CETSA 샘플을 준비한 후 즉시 완료해야 합니다.
분자 도킹과 CETSA는 모두 약물 개발 분야에서 중요한 역할을 하는 잘 정립된 기술입니다. 분자 도킹은 화합물과 표적 사이의 분자 수준 상호 작용을 예측하는 데 중요한 역할을 하며, 잠재적인 결합 모드10,11에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 이에 반해 CETSA는 약물이 단백질의 열적 안정성에 미치는 영향을 평가하는 데 중점을 두고 약물-단백질 상호작용을 검증하기 위한 도구 역할을 한다17. CETSA는 비교적 간단한 검증 방법이지만, 약물-단백질 복합체의 열 이동 연구를 위해 웨스턴 블롯을 사용하는 저처리량 방법이기도 하며, CETSA가 유일한 기법에만 의존해서는 안 됩니다. 또한 CETSA의 단계가 복잡하고 작업 중 단계 오류가 발생하면 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, CETSA 방법은 단백질 타겟에 대한 화합물의 특정 결합 부위 및 결합 모드를 결정할 수 없으며 결합이 공유 결합 또는 비공유 결합인지 여부를 나타낼 수 없습니다 17,18,23. 열 이동 분석 외에도 pH 의존성 단백질 침전(pHDPP)과 같은 다른 종류의 에너지 분석도 리간드-단백질 상호 작용 연구에 사용할 수 있습니다32. 또한 열 단백질체 프로파일링은 리간드-단백질 상호작용을 밝히기 위한 에너지 기반 방법으로, 단백질체학과 CETSA33을 결합하여 단백질-약물 상호작용에 대한 고처리량 대규모 분석을 가능하게 합니다.
또한, 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)은 추가적인 정성적 및 정량적 분석을 제공할 수 있다(34,35). 이는 약물과 표적 간의 상호 작용 존재를 결정할 뿐만 아니라 이러한 분자 간 상호 작용의 친화성 매개변수와 역학 매개변수를 측정하여 보다 포괄적인 이해를 제공합니다.
열 이동 분석 외에도 pH 의존성 단백질 침전(pHDPP)은 리간드-단백질 상호 작용 연구에도 사용할 수 있습니다32. 분자 도킹은 소분자와 생체 분자 간의 상호 작용을 예측하기 위한 물리 역학 기반 시뮬레이션 방법입니다. 이 방법은 작은 분자와 생체 분자 사이에 최상의 상보성을 생성하기 위해 작은 분자의 형태와 방향을 최적화함으로써 결합을 달성하는 것을 목표로 합니다. 표적 예측은 인공 지능 기술을 활용하여 작은 분자와 생체 분자 사이의 결합 부위를 예측합니다. 두 가지 접근 방식은 방법 적용과 예측 정확도에서 중요한 차이점이 있습니다. 방법 응용: 분자 도킹은 주로 약물 설계 및 최적화에 사용되어 신약 개발을 위한 이론적 기초를 제공합니다. 표적 예측은 보다 발전된 인공 지능의 도움으로 고처리량 스크리닝 및 선도 화합물의 신속한 발견에 더 자주 적용되어 약물 발견의 효율성을 향상시킵니다. 예측 정확도: 분자 도킹은 물리적 시뮬레이션을 기반으로 하기 때문에 예측 정확도는 더 높지만 계산 비용도 상대적으로 높습니다. 대상 예측은 계산 비용이 낮지만 예측 정확도는 학습 데이터의 풍부함과 모델 선택에 따라 달라집니다.
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Disclosures
저자는 밝힐 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82004031)과 쓰촨성 과학기술프로그램(Sichuan Science and Technology Program, 2022NSFSC1303)의 지원을 받았다. 웨스턴 블롯에 대한 도움을 주신 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine의 Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy의 Jiayi Sun에게 큰 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
References
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