שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות
Summary
Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.
Abstract
סוכרת מסוג 1 (T1D) הוא תא T בתיווך מחלה אוטואימונית. במהלך בפתוגנזה, חולים הופכים בהדרגה insulinopenic יותר כמו ייצור אינסולין הוא איבד, ככל הנראה זו תוצאה של הרס תאים בטא בלבלב על ידי ותאי T. הבנת מנגנוני מוות של תאים בטא במהלך הפיתוח של T1D יספק תובנות כדי ליצור תרופה יעילה למחלה זו. Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity השתמשו בעבר כרום רדיונוקלידים 51 (51 Cr) לתייג התאים היעד. מטרות אלו נחשפים מכן מפעיל תאים ושחרור של 51 Cr מתאי המטרה היא לקרוא כאינדיקציה המוות הלימפוציטים בתיווך התא. מעכבי תוצאה של התא למוות לשחרר ירידה של 51 Cr.
כמו תאים מפעיל, השתמשנו האוכלוסייה מופעל המשובטים autoreactive של CD8 + ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) מבודד מהונדס עכבר המניות אלפא וגם שרשראות בטא של קולטן T AI4 תא (TCR). הופעל AI4 בתאי T היו שיתוף תרבותי עם 51 Cr שכותרתו ניט תאים היעד במשך 16 שעות, שחרור של 51 Cr נרשמה לחשב תמוגה ספציפי
המיטוכונדריה להשתתף באירועים רבים פיזיולוגיים חשובים כגון הפקת אנרגיה, ויסות איתות התמרה, ו אפופטוזיס. המחקר של בטא שינויים התא המיטוכונדריה תפקודית במהלך הפיתוח של T1D הוא אזור הרומן של המחקר. שימוש המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה לצבוע Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) הדמיה confocal מיקרוסקופיים תא חי, אנחנו במעקב פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לאורך זמן בתור תא בטא ניט-1. עבור בדיקות הדמיה, מפעיל AI4 בתאי T תויגו עם פלורסנט גרעיני מכתים צבע Picogreen. ניט-1 ותאי T היו שיתוף בתרבית החדרים coverglass ועלה על הבמה מיקרוסקופ המצויד בתא תא חי, מבוקר על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, ו humidified. במהלך ניסויים אלה התמונות נלקחו של כל אשכול כל 3 דקות עבור 400 דקות.
במהלך של 400 דקות, צפינו את פיזור פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ניט-1 אשכולות התא שבו AI4 בתאי T צורפו. בניסוי שליטה בו זמנית איפה ניט-1 התאים היו שיתוף תרבותי עם MHC אי – התאמה האדם תאים לימפוציטים Jurkat, פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה נותרו על כנן. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לצפות בזמן אמת שינויים בפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים תחת מתקפה של לימפוציטים, ציטוקינים ציטוטוקסיות, או ריאגנטים ציטוטוקסיות אחרות.
Protocol
Discussion
ציטוטוקסיות T בטא בתיווך התא מוות של תאים הוא פתופיזיולוגיה העיקרי של T1D 5. מבחני CML באמצעות שחרור 51 Cr לאפשר לנו ללמוד את מידת התגובה היעד מפעיל-6. עם זאת, תהליך מפורט מסלולים המוות T התא בתיווך תא הבטא עדיין לא הבינו באופן מלא. מאז המיטוכונדריה הן קריטיו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות DK074656 ו AI56374 (CEM), כמו גם את הקרן למחקר סוכרת נעורים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
