طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة
Summary
ويمكن استخدام الخلايا بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات لاختبار ردود الفعل وآليات autoreactive دراسة موت الخلايا في المختبر. ومع ذلك ، يمكن استخدام الخلايا الحية المجهرية مبائر تقنيات التصوير مع الأصباغ الفلورية ، اكتب وحركية من موت الخلايا وكذلك الممرات المستخدمة في دراستها بمزيد من التفصيل.
Abstract
داء السكري نوع 1 (T1D) هي الخلية بوساطة أمراض المناعة الذاتية تي. خلال المرضية ، والمرضى تصبح تدريجيا أكثر ناقص الأنسولين كما هو فقدان إنتاج الأنسولين ، ويفترض أن هذه النتائج من تدمير خلايا بيتا في البنكرياس من قبل خلايا تي. وفهم آليات موت الخلايا بيتا خلال تطوير T1D تقديم رؤى لإنشاء علاج فعال لهذا المرض. وقد استخدمت الخلية بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات تاريخيا النويدات المشعة الكروم 51 (51 ريال برازيلي) إلى تسمية الخلايا المستهدفة. ثم تتعرض هذه الأهداف إلى الخلايا المستجيب وقراءة الافراج عن 51 ساعة معتمدة من الخلايا المستهدفة كدليل على موت الخلايا اللمفاوية التي تتوسط فيها. مثبطات نتيجة موت الخلايا في الافراج انخفضت من 51 ساعة معتمدة.
كما الخلايا المستجيب ، استخدمنا تنشيط السكان نسيلي autoreactive من CD8 + T السامة للخلايا الليمفاوية (CTL) معزولة عن ماوس وراثيا الأسهم للألفا على حد سواء وسلاسل بيتا من مستقبلات الخلايا التائية AI4 (TCR). وتم تنشيط خلايا تي AI4 التعاون مع مثقف 51 ساعة معتمدة المسمى الخلايا المستهدفة NIT لمدة 16 ساعة ، والإفراج عن 51 ساعة معتمدة تم تسجيلها لحساب تحلل محددة
الميتوكوندريا المشاركة في العديد من الأحداث الفيزيولوجية الهامة ، مثل إنتاج الطاقة ، وتنظيم الإشارات تنبيغ ، وموت الخلايا المبرمج. دراسة التغييرات الوظيفية الميتوكوندريا خلية بيتا خلال تطوير T1D هي منطقة جديدة من الأبحاث. باستخدام غشاء الميتوكوندريا المحتملة صبغة رباعي ميثيل استر الميثيل رودامين (TMRM) ، والتصوير المجهري مبائر الخلية الحية ، رصدنا غشاء الميتوكوندريا المحتملة على مر الزمن في خط خلايا بيتا NIT – 1. للدراسات والتصوير ، وكانت تسمى الخلايا التائية المستجيب AI4 مع صبغة الفلورسنت النووية تلطيخ Picogreen. NIT – 1 الخلايا والخلايا التائية وشارك في تربيتها في غرف ساترة والتي شنت على المسرح المجهر مجهزة غرفة الخلية الحية ، التي تسيطر على 37 درجة مئوية ، مع 5 ٪ CO 2 ، ومرطب. خلال هذه التجارب تم التقاط صور من كل مجموعة كل 3 دقائق لمدة 400 دقيقة.
أكثر من 400 دورة دقائق ، لاحظنا تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا في NIT – 1 كتل الخلية حيث كانت تعلق AI4 خلايا تي. في التجربة التحكم في وقت واحد حيث تم NIT – 1 الخلايا المستزرعة التعاون مع MHC سوء المتطابقة ظلت الميتوكوندريا المحتملة غشاء خلايا لمفاوية Jurkat ، سليمة. ويمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة التغييرات في الوقت الحقيقي في غشاء الميتوكوندريا المحتملة في الخلايا الليمفاوية تحت هجوم السامة للخلايا ، السيتوكينات ، أو الكواشف السامة للخلايا أخرى.
Protocol
Discussion
السامة للخلايا T في خلايا بيتا بوساطة الموت هو الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية للT1D 5. المقايسات CML باستخدام الكروم اطلاق سراح 51 تسمح لنا دراسة درجة المستجيب المستهدفة استجابة 6. ومع ذلك ، لا تزال عملية مفصلة والممرات من الخلايا T التي تتوسط بيتا موت الخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وDK074656 AI56374 (CEM) ، وكذلك مؤسسة أبحاث السكري الأحداث.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
