Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten
Summary
Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.
Abstract
Type 1 diabetes (T1D) is een T-cel gemedieerde auto-immuunziekte. Tijdens de pathogenese, de patiënten worden steeds meer insulinopenic zoals insuline productie verloren is gegaan, vermoedelijk dit voortvloeit uit de vernietiging van pancreatische beta-cellen door T-cellen. Inzicht in de mechanismen van beta-celdood tijdens de ontwikkeling van T1D zal inzichten verschaffen om een effectieve behandeling voor deze ziekte te genereren. Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) assays van oudsher de gebruikte radionuclide Chroom 51 (51 Cr) om doelcellen label. Deze doelstellingen worden vervolgens blootgesteld aan effector cellen en het vrijkomen van 51 Cr van target cellen wordt gelezen als een indicatie van de lymfocyt-gemedieerde celdood. Remmers van celdood resulteren in een verminderde afgifte van 51 Cr.
Als effector cellen, gebruikten we een geactiveerde autoreactieve clonale populatie van CD8 + cytotoxische T lymfocyten (CTL) geïsoleerd van een muis voorraad transgene voor zowel de alfa-en bèta-ketens van de AI4 T-cel receptor (TCR). Geactiveerde T-cellen AI4 werden samen gekweekt met 51 Cr gelabelde doelwit NIT cellen voor 16 uur, vrijlating van 51 Cr werd opgenomen om specifieke lysis te berekenen
Mitochondriën deel te nemen aan vele belangrijke fysiologische gebeurtenissen, zoals de productie van energie, de regulatie van signalering transductie, en apoptose. De studie van de beta cel mitochondriale functionele veranderingen tijdens de ontwikkeling van T1D is een nieuw gebied van onderzoek. Met behulp van de mitochondriale membraanpotentiaal kleurstof tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) en confocale microscopische live cell imaging, we gecontroleerd mitochondriale membraanpotentiaal loop van de tijd in de beta-cellijn NIT-1. Voor beeldvorming studies werden effector AI4 T-cellen gelabeld met de fluorescente kleurstof Picogreen nucleaire kleuring. NIT-1-cellen en T cellen werden gekweekt in co-chambered dekglaasje en gemonteerd op de microscoop podium uitgerust met een live-cell kamer, gecontroleerd bij 37 ° C, met 5% CO 2, en bevochtigd. Tijdens deze experimenten foto's werden genomen van elke cluster om de 3 minuten voor 400 minuten.
Meer dan een cursus van 400 minuten, zagen we de afvoer van mitochondriale membraanpotentiaal in de NIT-1 cel clusters waar AI4 T-cellen werden bevestigd. In de gelijktijdige controle-experiment waar NIT-1-cellen werden samen gekweekt met MHC verkeerd afgestemd menselijke lymfocyten Jurkat cellen, mitochondriale membraanpotentiaal intact gebleven. Deze techniek kan worden gebruikt om real-time veranderingen in de mitochondriale membraanpotentiaal in cellen onder aanval van cytotoxische lymfocyten, cytokines, of andere cytotoxische reagentia te observeren.
Protocol
Discussion
Cytotoxische T-cel gemedieerde beta celdood is de belangrijkste pathofysiologie van T1D 5. CML testen met behulp van 51 Cr vrijgeven ons toelaten om de graad van effector-target response 6 studiepunten. Echter, de gedetailleerde proces en de paden van T-cel-gemedieerde celdood beta nog steeds niet volledig begrepen. Omdat mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bèta-celfunctie en dood 7, richtten we ons op de mitochondriale veranderingen tijdens de visuele CML. Mitoch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK074656 en AI56374 (CEM), evenals de Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
