Méthodes d'évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques
Summary
À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d'imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.
Abstract
Diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune cellulaire T. Pendant la pathogenèse, les patients deviennent progressivement plus insulinopenic que la production d'insuline est perdu, sans doute cela résulte de la destruction des cellules bêta du pancréas par les lymphocytes T. Comprendre les mécanismes de la mort des cellules bêta au cours du développement du DT1 donneront un aperçu de générer un remède efficace contre cette maladie. À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages ont toujours utilisé le radionucléide chrome 51 (51 Cr) pour marquer les cellules cibles. Ces objectifs sont ensuite exposés à des cellules effectrices et la libération de 51 Cr par les cellules cibles est lu comme une indication de la mort cellulaire médiée par les lymphocytes. Les inhibiteurs de la mort cellulaire résulte de la libération diminué de 51 Cr.
Comme les cellules effectrices, nous avons utilisé une population active autoréactifs clonale de cellules CD8 + lymphocytes T cytotoxiques (CTL) isolés à partir d'un stock de souris transgéniques pour les deux chaînes alpha et bêta du récepteur AI4 cellules T (TCR). Activé AI4 cellules T ont été co-cultivées avec des cellules marquées au 51 Cr NIT cible pendant 16 heures, la libération de 51 Cr a été enregistré pour calculer lyse spécifique
Les mitochondries participent à de nombreux événements importants physiologiques, tels que la production d'énergie, la régulation de la signalisation de transduction, et l'apoptose. L'étude des cellules bêta mitochondriale changements fonctionnels pendant le développement du DT1 est un nouveau domaine de recherche. Utiliser le potentiel de membrane mitochondriale colorant rhodamine tétraméthyl ester méthylique (TMRM) et l'imagerie confocale de cellules vivantes microscopiques, nous avons suivi le potentiel de membrane mitochondriale au cours du temps dans la ligne de la cellule bêta-1 NIT. Pour les études d'imagerie, d'effecteur AI4 cellules T ont été marqués avec fluorescent nucléaire coloration colorants Picogreen. NTI-1 et les cellules T ont été co-cultivées en chambrée lamelle et monté sur la platine du microscope équipé d'une chambre de cellules vivantes, contrôlée à 37 ° C, avec 5% de CO 2, et humidifié. Lors de ces expériences images ont été prises de chaque cluster toutes les 3 minutes pour 400 minutes.
Pendant une période de 400 minutes, nous avons observé la dissipation du potentiel de membrane mitochondriale dans NIT-1 grappes cellule où AI4 cellules T ont été attachés. Dans l'expérience, où le contrôle simultané NIT-1 cellules ont été co-cultivées avec CMH dépareillés humaine cellules Jurkat lymphocytes, le potentiel de membrane mitochondriale est resté intact. Cette technique peut être utilisée pour observer en temps réel des changements dans le potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules de l'attaque des lymphocytes cytotoxiques, des cytokines, ou d'autres réactifs cytotoxiques.
Protocol
Discussion
Lymphocyte T cytotoxique médiée la mort des cellules bêta est la principale physiopathologie du DT1 5. Dosages de LMC en utilisant 51 Cr communiqué nous permettre d'étudier le degré d'effecteur-cible de réponse 6. Cependant, le processus détaillé et les voies de lymphocytes T de mort des cellules bêta n'est pas encore pleinement comprise. Depuis les mitochondries sont critiques pour la fonction des cellules bêta et la mort 7, nous nous sommes concentrés…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de DK074656 AI56374 (CEM), ainsi que la Juvenile Diabetes Foundation Research.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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