Summary
अभी तक सटीक विधि को इकट्ठा करने और वर्णित है मच्छर hemocytes दाग सरलीकृत. हमारे विधि उच्च इंजेक्शन तकनीक की सटीकता एडीज मच्छरों में hemocytes की साफ तैयारी को अलग के साथ छिड़काव की सादगी को जोड़ती है. इस पद्धति का अध्ययन hemocytes के प्रकार के ज्ञान की आवश्यकता होती है और उनके बहुतायत की सुविधा.
Protocol
1. Hemocyte संग्रह के अग्रिम में तैयार
- (98 मिमी NaOH, 186 मिमी NaCl, 1.7 मिमी EDTA, 41 मिमी साइट्रिक एसिड, 4.5 पीएच anticoagulant) एक hemolymph मंदक समाधान है कि 60% है Schneider मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 30% साइट्रेट बफर के होते तैयार 11. 1.0 एमएल aliquots है कि -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है प्रत्येक विभाज्य केवल एक बार का उपयोग करें (सामग्री देखें).
- एक अंत में एक 1 सेमी व्यास चक्र स्कोरिंग एक गिलास नक़्क़ाशी उपकरण का उपयोग करके कांच खुर्दबीन स्लाइड (75 x 25 x 1 मिमी) तैयार करें. वैकल्पिक रूप से, खुर्दबीन स्लाइड दो पूर्व etched हलकों के साथ खरीदा जा सकता है (जैसे फिशर साइंटिफिक या ईएमएस स्रोतों). एक मच्छर के प्रति गिलास स्लाइड की जरूरत होगी.
- कांच सुइयों का एक सेट (सामग्री देखें) तैयार निम्नलिखित सुझाव दिया सेटिंग्स (Sutter उपकरण, मॉडल पी 87) के अनुसार खींच लिया:
हीट 5 रैंप खींचो: 45 वेळ: 75 : 175 580 दबाव
इस खींचने पर सुझाव दिया सेटिंग्स का उपयोग करना, हम है कि लगभग 3 मिमी की टांग की लंबाई के साथ समग्र लंबाई में 500 मिमी के आसपास हैं सुइयों का निर्माण. पूर्व खींच सुइयों को भी खरीदा जा सकता है (जैसे Tritech अनुसंधान).
2. Microinjector के hemocyte संग्रह के अग्रिम में तैयार
- Microinjector सुई धारक में निर्माता के निर्देशों के अनुसार खींच सुई डालें. Backfill (सामग्री देखें) microinjector टयूबिंग, सिरिंज और खनिज तेल के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार गिलास सुई खींच लिया.
3. मादा मच्छर के hemocyte संग्रह के अग्रिम में तैयार
- छोटे ठोस पिंजरे कंटेनर है कि बर्फ के साथ संपर्क में किया जा सकता है में 15 वयस्क महिलाओं Aspirate. गहरी पर्याप्त बर्फ में मच्छरों के साथ विसर्जित कर पिंजरे पिंजरे और सभी पक्षों की है कि पूरे ऊंचाई ताकि बर्फ के साथ संपर्क में हैं. इससे यह सुनिश्चित होगा कि सभी मच्छरों ठंड को उजागर किया जाएगा.
शीत anesthetize मच्छरों के बारे में 8 मिनट के लिए या जब तक वे नहीं रह रहे हैं मोबाइल. - एक अवसाद स्लाइड पर एक मच्छर रखें. इस इंजेक्शन के लिए साइट के रूप में स्लाइड की सेवा करेंगे.
4. Hemocyte संग्रह
- सेट microinjector खींच गिलास सुई में hemolymph मंदक के 12 μl ले और सातवें और आठवें पेट क्षेत्रों के बीच मच्छर में समाधान इंजेक्षन. के बारे में 3 मच्छरों कुल 12 μl लिया मात्रा के 3-3.5 μl इंजेक्शन के साथ किया जा सकता है है. मच्छर संदंश के साथ धीरे से किया जाना चाहिए जगह में आयोजित जबकि इंजेक्शन प्रदर्शन किया है. मंदक की एक छोटी मात्रा इतनी के रूप में किया जा रहा है इंजेक्शन से खनिज तेल को रोकने के लिए सुई की नोक पर रहने चाहिए. इंजेक्शन के बाद पेट "भरा" या फूला हुआ दिखना चाहिए.
- प्लेस एक अलग साफ कंटेनर में 5 मिनट के लिए ठीक करने के लिए बर्फ पर मच्छरों इंजेक्शन. मच्छर के अंदर anticoagulant मंदक समाधान के ऊष्मायन में मदद करेगा आंतरिक ऊतकों को पालन hemocytes बेदखल. औसत पर 3 से 5 ताजा मच्छरों प्रत्येक 5 मिनट वसूली की अवधि के दौरान इंजेक्शन जा सकता है.
- वसूली पैर बंद कटाव, पंख, और सूक्ष्म कैंची का उपयोग कर समय पर प्रत्येक मच्छर के पेट (आठवें खंड में) की नोक के 5 मिनट के के बाद. यह वसूली बर्फ पर रखा कप में किया जाना चाहिए. पैर और पंख काटना संग्रह स्लाइड्स को हस्तांतरित किया जा रहा है तराजू की संभावना कम कर देता है. नोट: काट नहीं है और पैर पंख भी वक्ष लगाव साइटों के लिए करीब या आप बच hemolymph के लिए अन्य उद्घाटन बनाने जोखिम. Hemolymph केवल पेट की नोक पर बनाई गई खोलने के माध्यम से एकत्र किया जाना चाहिए.
- 70% इथेनॉल के साथ एक गिलास etched खुर्दबीन स्लाइड धो और यह एक kimwipe के साथ सूखी. स्थिति एक और इंजेक्शन बरामद etched चक्र के बाहरी किनारे पर स्लाइड पर मच्छर. Microinjector सेट करने के लिए ताजा hemolymph मंदक के 12 μl लेने और अपने mesothorax के पार्श्व पक्ष में मच्छर में यह मात्रा इंजेक्षन. सबसे उद्धार लेकिन मंदक के पूरे नहीं मात्रा (8 के बारे में - μl 10) के रूप में इंजेक्शन से खनिज तेल को रोकने के लिए. मंदक की एक छोटी मात्रा में सुई की नोक पर रहना चाहिए.
- मच्छर स्थिति कटौती ताकि पेट खोलने 1 सेमी सर्कल के किनारे पर है. इंजेक्शन के बाद पतला hemolymph चिह्नित क्षेत्र के भीतर एकत्र होना चाहिए. एक बार सुई mesothoracic इंजेक्शन साइट से हटा दिया जाता है, संदंश के दो हथियार के बीच मच्छर पकड़े फिर से शुरू और धीरे से उन संदंश के साथ पेट निचोड़ etched सर्कल क्षेत्र पर hemolymph प्रत्यक्ष.
- पतला hemolymph स्लाइड पर के बारे में 10 मिनट के लिए या जब तक यह दिख सूखी शुष्क करने की अनुमति दें.
5. Hemocyte निर्धारण और धुंधला हो जाना
- HEMA3 (सामग्री देखें) 7: डुबकी एस प्रत्येक स्लाइड अलग दागLIDE 1 हर बार दूसरा लगानेवाला 5 बार में, और अंत में, समाधान द्वितीय में डुबकी स्लाइड एक एक दूसरे के लिए 3 बार, समाधान में एक एक दूसरे के लिए 3 बार मैं Dipslide. डि पानी के साथ स्लाइड के पीछे कुल्ला. स्लाइड के सामने rinsed नहीं होना चाहिए. दाग ऊतक युक्त etched के सर्कल के बाहर स्लाइड के सामने ब्लाट - सूखी.
- Etched के केंद्र के चारों ओर बढ़ते मध्यम (जैसे शूर / माउंट या Polymount) लागू करते हैं और उस पर एक कवर पर्ची जगह. नीचे हल्के प्रेस इतना कवर पर्ची (25 x 25 मिमी) पर है कि पूरे कवर पर्ची (etched दाग ऊतक युक्त चक्र सहित) द्वारा कवर क्षेत्र के लिए बढ़ते मध्यम फैलता है. स्लाइड्स 3 घंटे या रात भर की एक न्यूनतम के लिए शुष्क करने की अनुमति दें. Hemocytes इष्टतम दृश्य और इमेजिंग के लिए संग्रह के बाद 2 सप्ताह के भीतर देखा जाना चाहिए.
6. प्रतिनिधि परिणाम
तय की और HEMA3 दाग एक एडीज aegypti वयस्क मादा से एकत्र hemocytes के उदाहरण चित्रा 1 ए सी में दिखाए जाते हैं. चित्रा 1A hemocyte है कि हम एक अपने छोटे आकार, आकार गोलाकार गोलाकार और उच्च cytoplasm (550x बढ़ाई अनुपात) 11 परमाणु के आधार पर prohemocyte के रूप में पहचान से पता चलता है. चित्रा 1 बी एक एक अपनी गोलाकार आकार और परमाणु अनुपात (550x बढ़ाई) के लिए उच्च cytoplasm के आधार पर oenocytoid के रूप में वर्गीकृत hemocyte से पता चलता है. अन्त में, चित्रा 1C hemocyte granulocyte प्रकार दिखाता है (550x बढ़ाई). Granulocytes प्रकृति में और अधिक बारीक हैं और आकार और व्यवहार में अधिक amoeboid हो के रूप में वे कांच की सतहों का पालन करते हैं. Hemocyte टाइपिंग और 11 वसूली के लिए पहले प्रकाशित मापदंड का प्रयोग, हमारे संग्रह विधि कुल hemocytes की एक समान संख्या में मिले और हम इसी तरह पाया कि granulocytes कुल hemocytes का सबसे बड़ा प्रतिशत 11 (चित्र 2).
चित्रा 1 में एक प्रतिनिधि HEMA3 तय, दाग prohemocyte लाइट माइक्रोस्कोप छवियों (ए) (बी) oenocytoid, और ऐ से granulocyte (सी) . aegypti वयस्क महिला. C = cytoplasm, एन = नाभिक जी = granules.
चित्रा 2 कुल मायने रखता है. ± एसई के सभी hemocytes और granulocytes हमारे hemolymph कमजोर पड़ने और संग्रह विधि द्वारा मादा मच्छर प्रति प्राप्त.
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Discussion
hemocyte संग्रह विधि यहाँ वर्णित पहले प्रकाशित तरीकों से संशोधित है और एक कम कदम के साथ एडीज मच्छरों से hemocytes की साफ तैयारी को अलग करने के लिए अनुमति देता है. जबकि हमारे विशेष रुचि एडीज मच्छरों में hemocyte आबादी निस्र्पक में निहित है, हमें विश्वास है कि अन्य मच्छर समूहों के लिए इस तकनीक लागू किया जा सकता है के बाद प्रारंभिक परीक्षण करने के लिए उचित इंजेक्शन की मात्रा का निर्धारण करने के लिए आयोजित की जाती हैं. हमारी प्रोटोकॉल नमकीन घोल के स्थान में anticoagulant बफ़र्स का उपयोग करता है और hemocytes की आबादी है कि सही vivo में संख्या दर्शाता पैदावार. हालांकि, हम अभी तक संस्कृति में अलग hemocytes को बनाए रखने के लिए हमारे प्रोटोकॉल की उपयुक्तता नहीं निर्धारित किया है.
एक कटौती सूंड के माध्यम से hemolymph के संग्रह के लिए परिसंचारी hemocytes की fewest संख्या उपज दिखाया गया है और यहाँ नहीं होगा आगे चर्चा की. छिड़काव आधारित विधियों, जबकि आचरण आसान है, आंतरिक ऊतकों और 11 तराजू से संदूषण का एक बड़ा स्तर की अनुमति के लिए आलोचना की गई है. हाल ही में, उच्च इंजेक्शन / वसूली तरीकों hemocytes की वसूली में सुधार विकसित किए गए, जबकि 11 contaminates के स्तर को कम करने, लेकिन इंजेक्शन और एकत्रित चरणों की एक संख्या जरूरत पर जोर देता है. हमारे प्रोटोकॉल बरामद hemocytes और कम contaminants के एक ही स्तर प्राप्त है, लेकिन कम इंजेक्शन और एकत्रित कदम के साथ, जिससे hemocytes की साफ तैयारी को प्राप्त करने के लिए एक सरल अभी तक सटीक विधि की पेशकश की. सबसे पहले, हटाने पैर, पंख और जहां hemolymph hemocytes की एक बहुत क्लीनर तैयारी में परिणाम एकत्र किया जाता है से अलग कंटेनर में पेट की नोक हमारी प्रोटोकॉल में सरल कदम. दूसरा, हमारे विधि लाभ सटीकता गिलास एक सुई धारक एक सकारात्मक विस्थापन microinjector से जुड़ी में आयोजित सुइयों का उपयोग करके. जबकि मंदक इसी तरह हाथ से आयोजित की सुइयों का उपयोग इंजेक्शन जा सकता है या दूसरे हाथ से आयोजित उपकरणों के वितरण microinjector का उपयोग एकत्र hemolymph के अनुरूप मात्रा में वितरण की मात्रा और बाद में परिणाम की सटीकता बढ़ जाती है. हमारे परीक्षणों 9,5 करने के लिए 10.5 (4.1 और 4.4 कदम) μl हमें लगातार इंजेक्शन मादा मच्छर (अप्रकाशित डेटा) से hemolymph के 9-10 μl इकट्ठा करने के लिए अनुमति दी है कि संयुक्त इंजेक्शन मात्रा से संकेत मिलता है, जिससे hemocyte आबादी को बढ़ाता में निरंतरता का एक और उपाय प्रदान. हमारी विधि अन्य आयोजित हाथ इंजेक्शन सुइयों और / या गिलास केशिका पतला hemolymph एकत्र ट्यूबों के लिए की जरूरत को हटाने के द्वारा समग्र संग्रह सरल है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक जॉन फ्रे और बेन पीटरसन मच्छर पालन के लिए शुक्रिया अदा करना होगा. हम भी क्रिस्टीन डेविस और गैरी Radice hemocyte micrographs साथ मदद के लिए धन्यवाद. इस शोध रिचमंड कला और विज्ञान गर्मियों ए.ए. Qayum और संकाय ए Telang के लिए अनुदान के लिए फैलोशिप विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
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